Einlasssystem oder Voraussetzung für optimale Datenqualität Die Rolle des LC in der LC/MS Analytik

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1 Einlasssystem oder Voraussetzung für optimale Datenqualität Die Rolle des LC in der LC/MS Analytik Dr. Udo Huber Produktspezialist LC Agilent Technologies 1

2 Braucht man eine gute chromatographische Trennung vor dem MS? Chromatographic separation is not required when using MS. Extract individual m/z values, do SIM or choose precursor ions for MS/MS. [Unbekannter MS Anwender] 2

3 Gute LC Trennung 4.8e5 Intensity, cps 4.2e5 3.6e5 3.0e5 2.4e5 Diphenhydramine m/z Ketoprophen m/z e5 1.2e5 6.0e Time, min 30:70 Wasser/Methanol, 0.2 % Essigsäure 3

4 Schlechte LC Trennung 4.8e5 Diphenhydramine m/z e5 3.6e5 Intensity, cps 3.0e5 2.4e5 1.8e5 1.2e5 6.0e4 Ketoprophen m/z Time, min 5:95 Wasser/Methanol, 0.2 % Essigsäure 4

5 Chromatographie, MS, Software Die Kombination bringt den Erfolg MassHunter Datenanalyse TM Chromatographie Massenspektrometrie Maximale Information zur Probe 5

6 Das HPLC System als Partner für MS Fakten und Anforderungen Ionenquellen können maximal mit Flussraten von 1 ml/min (< 2 ml/min) betrieben werden. Kleinere Flussraten ergeben eine bessere Sprayeffizienz. Bei Flussraten < 1 ml/min sollten keine Standard 4.6 mm i.d. Säulen betrieben werden da man ausserhalb des Effizienzoptimums arbeitet. Der übliche Säulendurchmesser in der LC/MS ist 2.1 mm. Diese Säulen werden mit Flussraten von ml/min (bis 1 ml/min bei schneller Analytik) gefahren. Die kleinen Flussraten stellen besondere Anforderungen an das LC System. 6

7 Totvolumen Totvolumen (Verzögerungsvolumen, delay volume, dwell volume) System volume from the point of mobile phase mixing to the column head (W. Dolan LCGC 2006 Vol 24, No 5, ) Totvolumen Verzögert das Ankommen des Gradienten auf der Säule 7

8 Einfluss Totvolumen mau 400 Säule: ZORBAX SB-C x 50 mm, 1.8 μm Fluss: 0.42 ml/min 3.7 min 300 Totvolumen ca. 700 μl min mau min Totvolumen 120 μl min 8

9 Totvolumen Totvolumen (Verzögerungsvolumen, delay volume, dwell volume) System volume from the point of mobile phase mixing to the column head (W. Dolan LCGC 2006 Vol 24, No 5, ) Totvolumen Verzögert das Ankommen des Gradienten auf der Säule Verlängert die Zeit welche die Probe auf der Säule isokratischen Bedingungen ausgesetzt ist 9

10 Einfluss Totvolumen mau 400 Säule: ZORBAX SB-C x 50 mm, 1.8 μm Fluss: 0.42 ml/min 300 Totvolumen ca. 700 μl min mau Totvolumen 120 μl min 10

11 Einfluss Totvolumen auf die Trennung Verzögert das Ankommen des Gradienten auf der Säule, verlängert die Laufzeit. Das isokratisches Stück zu Beginn des Laufs kann einen negativen aber auch einen positiven Einfluss auf die Trennung haben. Einfluss auf die Trennung steigt mit sinkender Flussrate und damit mit sinkendem Säulendurchmesser. 11

12 Totvolumen Agilent 1290 Infinity LC Konfiguration DV* / µl 1290 Pumpe Pumpe + Mischer (Jet Weaver) Pumpe + Mischer + Fixed Loop Autosampler Pumpe + Mischer + Variable Loop Autosampler 110 * Totvolumen: 10 % step gradient Definition, vorläufige Ergebnisse 1 5 µl Schleife 12

13 Dispersionsvolumen Dispersionsvolumen (system dispersion) Dispersion is the sample bandspreading or dilution which occurs in connecting tubing, sample valves, flow cells and in column end-fittings. Dispersion Peakhöhe: Verlust an Empfindlichkeit Peakbreite: Verlust an Auflösung Kapillarverbindungen (Innendurchmesser, Länge) 2 π σ = r 4 24 F D m L Aris-Taylor Gleichung 13

14 Einfluss Dispersionsvolumen mau Dispersionsvolumen nicht optimiert Peakwidth min Resolution Peakwidth min min mau Dispersionsvolumen optimiert Peakwidth min Resolution Peakwidth min min 14

15 Dispersionsvolumen Dispersionsvolumen (system dispersion) Dispersion is the sample bandspreading or dilution which occurs in connecting tubing, sample valves, flow cells and in column end-fittings. Kapillarverbindungen (Innendurchmesser, Länge) Verbindungen (Unions, T-Stücke, Fittings) Zusätzliche Ventile (Alternating column regeneration) Detektor (Einlasswärmetauscher, Flusszellenvolumen und geometrie) 15

16 Einfluss Kapillarverbindungen mau 140 Schlechte Kapillarverbindungen min mau Gute Kapillarverbindungen min 16

17 Auswirkung Dispersionsvol. auf Effizienz Flussraten angepasst an Säulendurchmesser: 4.6 mm Säule 1 ml/min 3 mm Säule 0.43 ml/min 2.1 mm Säule 0.21 ml/min Säulendimensionen: 50 mm Länge 1.8 µm Partikelgröße 17

18 1290 Infinity Dioden Array Detektor Optofluidic Waveguides Pfadlänge 10 mm Volumen ca. 2 µl 18

19 Optimale Konfiguration des LC Verbindung zum MS Kurze Kapillare mit nicht zu großem Innendurchmesser Direkt Verbindung zum MS Sprayer wenn die Probe es erlaubt. Generell Möglichst kurze Kapillarverbindungen, besonders hinter der Säule. Kapillaren mit der Flussrate angepasstem Durchmesser. Keine unnötigen Verbindungen ( unions ). Anschlagen der Kapillaren direkt dort wo sie verwendet werden sollen. Der größte Verlust von peak performance kommt von schlecht angeschlagenen Fittings. 19

20 Das Agilent 1290 Infinity LC Der optimale Partner für das MS High-end UHPLC System, Leistung 1200 bar bei 2 ml/min (800 bar bei 5 ml/min) Minimale Totvolumina für schnelle Analysen Minimale Dispersionsvolumina, auch mit installiertem UV Detektor Optimiert für 2.1 mm Säulen 20

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