Identifizierung und Quantifizierung von Konservierungsstoffen in Kosmetika mittels HPLC. Probenmaterial: kosmetisches Mittel (Bodylotion)
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- Waldemar Buchholz
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1 Identifizierung und Quantifizierung von Konservierungsstoffen in Kosmetika mittels HPLC Probenmaterial: kosmetisches Mittel (Bodylotion) Prinzip: Die Konservierungsstoffe werden mit Ammoniumacetatpuffer/Methanol durch Ultraschallbehandlung aus der Bodylotion extrahiert. Die durch Carrez-Fällung und Filtration geklärte Lösung wird hochleistungsflüssigkeitschromatographisch an einer RP8-Säule getrennt und mittels UV-Detektor bei 235 nm detektiert. Die Identifizierung erfolgt über die Retentionszeiten, die Quantifizierung mittels externer Standards über die Peakflächen. Reagenzien: o Methanol HPLC-grade o Bidestilliertes Wasser (für die Herstellung der Fließmittel) o Vollentsalztes Wasser o Essigsäure (w = %) o 0,01M Ammoniumacetat-Puffer: 0,77 g Ammoniumacetat und 1,2 ml Eisessig in 1 l Messkolben mit dest. Wasser bis zur Marke auffüllen, anschließend mit Hilfe der ph-elektrode mit Eisessig/konzentriertem Ammoniak auf ph 4,5 einstellen und anschließend membranfiltrieren o Extraktionslösung: 0,01M Ammoniumacetat-Puffer im Verhältnis 60/40 mit Methanol mischen (bitte insgesamt 1 l herstellen) o Standardsubstanzen: Sorbinsäure, Benzoesäure, para-hydroxybenzoesäure, phb-methylester, phb-ethylester, phb-propylester; analysenrein o Carrez-Lösung I 15 g Kaliumhexacyanoferrat(II) (K 4 [Fe(CN) 6 ]*3H 2 O) in 100 ml Messkolben einwiegen und bis zur Marke mit Wasser auffüllen (steht aus) o Carrez-Lösung II 30 g Zinksulfat (ZnSO 4 *7H 2 O) in 100 ml Messkolben einwiegen und bis zur Marke mit Wasser auffüllen (steht aus)
2 Stammlösungen: 50 mg Standardsubstanz auf 0,1 mg genau in einen 100 ml Messkolben einwiegen, in 40 ml Methanol lösen und mit einem Methanol-Wasser-Gemisch (40/60) ad 100 ml auffüllen Die Stammlösungen werden anschließend 1:50; 1:33,3; 1:25; 1:20 weiterverdünnt. Dazu werden mit einer Vollpipette 2 ml (bzw. 3 ml, 4 ml und 5 ml) der Stammlösung in einen 100 ml Messkolben pipettiert und mit Methanol-NH 4 OAc-Puffer-Gemisch (40/60) ad 100 ml aufgefüllt. Aufarbeitung der Probe: Von der gründlich homogenisierten Probe (kräftig Schütteln) werden 2,5 g auf 0,1 mg genau in einen 50ml Messkolben eingewogen. Der Kolben wird zu ca. 80 % mit dem Extraktionsgemisch aufgefüllt und die Probe unter kräftigem Umschwenken gelöst. Der Kolben wird für 15 Min. ins Ultraschallbad (Kellerlabor; Ecke hinten links) gestellt. Zur Klärung werden anschließend unter kräftigem Umschwenken nacheinander je 1 ml Carrez-Lösung I und II zugegeben. Nach Auffüllen bis zur Marke wird kräftig geschüttelt und durch ein Faltenfilter filtriert, wobei der Vorlauf (ersten 5 ml des Filtrats) verworfen wird. Falls nötig, wird noch enthaltenes Fett über Nacht ausgefroren. Die Probe ist nach der Aufarbeitung und vor der Injektion bei den zuständigen Assistenten vorzuzeigen. Das Filtrat muss klar sein! Das Filtrat wird durch einen Membranfilter (0,45 μm) für die HPLC gereinigt und 1:1 (25 ml Probe mit einer Vollpipette in einen 50 ml Messkolben pipettieren und mit Methanol-NH 4 OAc-Puffer (40/60) bis zur Marke auffüllen) weiterverdünnt. Für die Membranfiltration wird die Probenlösung in eine Plastikspritze aufgezogen und durch das ausgegebenen 0,45 µm-filter in ein frisches Gefäß überführt.
3 Durchführung der Messung: Inbetriebnahme der HPLC Die Inbetriebnahme erfolgt zusammen mit dem betreuenden Assistenten. Allgemeine Hinweise zur HPLC - Fließmittel (Methanol, Puffer und Wasser) müssen vor der Verwendung gefrittet werden. Dazu wird mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe das jeweilige Fließmittel durch einen Filter gezogen, wobei Verunreinigungen und Luftblasen entfernt werden - vor dem Einspritzen die Spritze mit der Probe bzw. dem jeweiligen Standard einige Male durchspülen - zum Einspritzen: Dosierschleife auf load stellen, ca. 40 μl ohne Luftblasen (Kontrolle!) in die Dosierschleife injizieren; die Dosierschleife fasst 20,0 μl, überschüssige Lösung wird automatisch entleert. Damit die Lösung aus der Dosierschleife auf die Säule gelangt, wird das Ventil auf inject gestellt - vor dem nächsten Einspritzen nicht vergessen, das Ventil wieder auf load zu stellen! - die HPLC reagiert sehr empfindlich auf Luft im System!!! Sollten sich im Schlauch, durch den das Fließmittel angesaugt wird, Luftblasen bilden, ist die Pumpe abzuschalten und dem Assistenten Bescheid zu geben! - es ist stets darauf zu achten, dass sich ausreichend Puffer, Wasser bzw. MeOH in den Vorratsflaschen befindet, damit keine Luft angesaugt wird - das Abfallgefäß ist rechtzeitig in die Lösungsmittelabfälle im Studentenlabor zu entleeren - Die Säule wird in Methanol gelagert. Zu Beginn der Analyse muss die Säule mit Fließmittel gespült werden (erfolgt zusammen mit dem zuständigen Assistenten). Sobald eine ruhige Basislinie erreicht wird (nach ca. 20 min - Detektorsignal zeigt konstanten Wert an), kann mit der Analyse begonnen werden.
4 Einstellungen der Software Aufnehmen eines Chromatogramms: 1. Jeweiligen PC starten 2. Benutzer Wellchrom auswählen (bitte 6 Min. warten!) 3. EuroChrom starten 4. unter Hardware -> File -> open -> Demo -> Config kann die Hardware- Konfiguration für die jeweilige Anlage eingesehen werden; Fenster schließen. 5. Measurement Method öffnen -> File -> new -> jeweilige Hardwarekonfiguration auswählen. Als Analyst Name eigenen Namen und als Laufzeit 40 Min. einstellen. File -> save in den Ordner Mowi Im linken Feld Demo anwählen, im rechten doppelt auf Mowi klicken. Nur hier wird gespeichert! Bitte KEINE Chromatogramme direkt unter Demo speichern! Die Ordner Data, Config und Methods sind NUR für die Assistenten! Methode benennen Icon ganz rechts anwählen: Fluss, Fließmittelzusammensetzung und Messwellenlänge einstellen Fluss: 1 ml/min Fließmittelzusammensetzung: 0 % Wasser (A) 40 % Methanol (B) 60 % Puffer (C) Messwellenlänge 235 nm Nochmal speichern (File -> save) und Fenster schließen Achtung: - Messwellenlänge, Fluss und Gradient werden in der Methode eingestellt! Die Einstellungen an Pumpe und Detektor selbst haben keine Auswirkungen! AutoZero erfolgt über die Software. - Methoden können nicht geändert werden! Sie müssen neu geschrieben werden! - Für jede Änderung von Fluss, Gradient, muss eine neue Methode geschrieben werden! 6. Icon in der Mitte anklicken: Pumpe starten (im Pumpen-Display steht SLAVE ) 7. Icon links daneben anklicken (blauer Pfeil) und das Chromatogramm in den Ordner Mowi speichern. Nur hier wird gespeichert! Bitte KEINE Chromatogramme direkt unter Demo speichern! Die Ordner Data, Config und Methods sind NUR für die Assistenten! 8. Dateinamen mit Enter bestätigen, sofort Injektor-Hebel umlegen. 9. Beendigung der Messung: wieder auf den blauen Pfeil klicken, Sicherheitsabfrage bestätigen. Das Fenster mit dem Graphen schließen. 10. Die Pumpe kann eingeschaltet bleiben; mit der nächsten Messung ab Nr. 6 fortfahren (auch vor Ablauf der 40 Minuten! Lauf ist nach 20 Minuten zu Ende!) 11. Soll das Programm beendet werden (normalerweise nur am Ende des Tages), muss die Pumpe vorher ausgeschaltet werden (Icon in der Mitte).
5 Hinweis: Es werden nur Peaks integriert, die über 10 mau (Milliampere-units) hoch sind und eine bestimmte Mindestfläche aufweisen. Alles darunter wird als Rauschen interpretiert und nicht integriert. Achtung: Ab ca. 300 mau ist viel Substanz auf der Säule Verdünnung!!! Proben sind so zu verdünnen, dass die Peaks zwischen 10 und 300 mau Höhe aufweisen! Auswertung der Chromatogramme: 1. Chromatogram Viewer öffnen 2. unter File -> open -> Demo -> Mowi die gewünschte Datei öffnen 3. unter View Links -> Peak Report können die RT und die Fläche ausgelesen werden. Diese Daten unter File -> Print Protocol (!) ausdrucken Identifizierung Zunächst werden nacheinander alle Standardlösungen eingespritzt, um die Retentionszeiten der Vergleiche zu ermitteln. Anschließend wird die Probe injiziert. Anhand der Retentionszeit der Probe kann die enthaltene Substanz identifiziert werden. Zur Absicherung der Identifizierung muss ein Aufsatzversuch erfolgen, bei dem die Probe 1:1 mit dem vermuteten Standard gemischt und dann injiziert wird. Quantifizierung Der in der Probe enthaltene Standard sowie die Probe werden insgesamt jeweils dreimal eingespritzt, bis drei saubere Spektren erhalten werden. Anhand der ermittelten Flächen wird über Dreisatz die Konzentration der Probe berechnet. Es ist darauf zu achten, dass Standard und Probe in etwa die gleiche Konzentration aufweisen! Die Angabe erfolgt in Massenprozent. Platzabgabe: Um ein Ausfallen des Puffers aus dem Fließmittel zu verhindern wird die Säule nicht direkt mit Methanol gespült, sondern zunächst der Pufferanteil im Fließmittel durch Wasser ersetzt. Man stellt ein Wasser/Methanolgemisch (60/40) her und spült die Säule ca. 20 min. Anschließend wird die Säule mit reinem Methanol (ca. 30 min) gespült, in welchem sie anschließend gelagert wird. Die Spritze muss mit Methanol und Wasser gespült werden, so dass sie frei von Puffer- oder Probenresten ist (muss sich leicht aufziehen lassen). Außerdem ist der Abfallbehälter in den großen Lösungsmittelkanister im Studentenlabor unter dem Abzug zu entleeren. Angaben im Protokoll: - Probe - Literatur - Prinzip - Durchführung (mit Angabe der Geräteparameter) - Berechnung (mit allen Einwaagen) - Ergebnis - alle relevanten Chromatogramme (beschriftet)
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