Diphtheria Toxoid IgG Enzyme Immunoassay kit. For in-vitro diagnostic use only Product code: MK014

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1 4. CAUTION Diphtheria Toxoid IgG Enzyme Immunoassay kit For in-vitro diagnostic use only Product code: MK4 Product manufactured by: The Binding Site Group Ltd, PO Box 7, Birmingham, B4 4ZB, U.K. Telephone: +44 () 436 Fax: +44 () INTENDED USE This product should only be used by appropriately trained personnel. Strict adherence to the protocol is recommended. Any deviation may affect the performance of this sensitive assay. If as a consequence the obtained optical density readings are low this may compromise the sensitivity of the assay. Pay attention to specific Notes and warnings throughout these Instructions for Use. Reagents from different batch numbers of kits are NOT interchangeable. If large numbers of tests are performed care should be taken to ensure that all reagents are from the SAME batch. All strips must be taken from the same foil pouch. Substitution of any component may lead to incorrect results. To avoid reagent contamination, only use new or clean plastic / glassware. Never return unused reagents to the bottles. Do not leave reagent bottles uncapped; any resulting evaporation or contamination will lead to inconsistent results. TMB substrate must not be exposed to light or water. Microbially contaminated, haemolysed or lipaemic serum and specimens containing particulate matter should not be used. Inaccurate sample dilution cannot be checked, as kit controls are ready to use. The use of calibrated pipettes and appropriate internal QC samples is recommended. When using automated assay systems, sample dilutors and other automated equipment, follow the manufacturer s instructions carefully. Particular attention should be given to the setup of the equipment and installation and connection to external services. All settings for automatic washers and readers must be followed carefully and equipment must be maintained and serviced according to the manufacturer s instructions. 4.3 STORAGE AND STABILITY This assay is intended for the in-vitro measurement of specific IgG antibodies against diphtheria toxoid present in serum, in order to determine protective status pre- and post vaccination. Sufficient materials are supplied to allow a maximum of 39 samples to be tested in duplicate or 87 in single, with a seven point calibration curve and two controls. The seven point calibration curve can be reduced to five points if measurement below.37 IU/mL is not required. BACKGROUND Anti-diphtheria toxoid antibodies are raised in response to vaccination with diphtheria toxoid protein. A patient s response to the immunisation may be assessed, subsequently, by the serological determination of the anti-diphtheria toxoid antibody level using this quantitative enzyme immunoassay technique. It should be noted that the reference method, particularly in Europe, may be the Vero Cell Assay (VCA). This assay gives a measurement of the amount of neutralising antibody of all immunoglobulin classes, not only IgG. Historically, comparison of commercial ELISA kits and the Vero Cell Assay has shown poor correlation, as the ELISA may detect a proportion of specific antibodies that may not neutralise the diphtheria toxoid. As the assay utilises the diphtheria vaccine for coating the plate, the assay gives a measurement of specific IgG antibodies produced in response to vaccination. 3 PRINCIPLE OF THE ASSAY Microwells are pre-coated with diphtheria toxoid antigen. The calibrators, controls and diluted patient samples are added to the wells and antibodies recognising the diphtheria toxoid antigen bind during the first incubation. After washing the wells to remove all unbound proteins, purified peroxidase labelled rabbit anti-human IgG ( chain specific) conjugate is added. The conjugate binds to the captured human antibody and the excess unbound conjugate is removed by a further wash step. The bound conjugate is visualised with 3,3,, tetramethylbenzidine (TMB) substrate which gives a blue reaction product, the intensity of which is proportional to the concentration of antibody in the sample. Phosphoric acid is added to each well to stop the reaction. This produces a yellow end point colour, which is read at 4nm. 4 PRECAUTIONS 4. WARNING All donors of human serum supplied in this kit have been serum tested and found negative for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and antibodies to human immunodeficiency virus (HIV and HIV) and hepatitis C virus. The assays used were either approved by the FDA (USA) or cleared for in vitro diagnostic use in the EU (Directive 98/79/EC, Annex II); however these tests cannot guarantee the absence of infective agents. Proper handling and disposal methods should be established as for all potentially infective material, including (but not limited to) users wearing suitable protective equipment and clothing at all times. Only personnel fully trained in such methods should be permitted to perform these procedures. This product contains sodium azide and ProClin 3 and must be handled with caution; suitable gloves and other protective clothing should be worn at all times when handling this product. Do not ingest or allow contact with the skin (particularly broken skin or open wounds) or mucous membranes. If contact does occur wash with a large volume of water and seek urgent medical advice. Explosive metal azides may be formed on prolonged contact of sodium azide with lead and copper plumbing; on disposal of reagent, flush with a large volume of water to prevent azide build up. The buffers and serum supplied in this kit contain various enzyme inhibitors as listed below. These are hazardous and should be handled with care. INHIBITOR Kathon Sodium Azide ProClin 3 Bromonitrodioxane Methylisothiazone CONCENTRATION.%.99%.4%.%.% ProClin is a trademark of Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA Kathon is an irritant and may cause sensitisation by skin contact. The stop solution contains 3M phosphoric acid, which is an irritant. Avoid contact with skin or eyes. Reagent spills should be cleaned up appropriately, observing local and environmental regulations. Insert Code: E4, Version th January, Page of The kit should be stored at -8 C and should not be frozen. Inappropriate storage temperatures will affect the results. Wash buffer diluted into a clean container can be stored at room temperature for a maximum of 4 weeks. The expiry date of the kit is shown on the outer label. SAMPLE COLLECTION AND STORAGE Blood samples should be collected by venepuncture allowed to clot naturally and the serum separated. The serum may be stored at -8 C for up to 48 hours prior to assay, or for prolonged storage kept undiluted at - C or below. Repeated thawing and freezing should be avoided. Serum samples should not be heat-inactivated, as this may give false positive results. 6 MATERIALS 6. MATERIALS SUPPLIED 6.. Instruction Leaflet: Giving full assay details. 6.. QC Certificate: Indicating the expected performance of the batch Diptheria Toxoid Coated Wells: breakapart 8 well strips coated with diphtheria toxoid derived from Corynebacterium diptheriae. Each plate is packaged in a re-sealable foil bag containing two desiccant pouches Sample Diluent: bottles containing ml of buffer for sample dilution. Coloured yellow, ready to use. 6.. Wash Buffer: bottle containing ml of a -fold concentrated buffer for washing the wells Diptheria Toxoid IgG Calibrators: 7 bottles each containing.ml of diluted human serum, with the following concentrations of anti-diptheria toxoid antibody: 3,,.333,.,.37,. and.4iu/ml. Ready to use Diptheria Toxoid IgG High Control: bottle containing.ml of diluted human serum containing antibodies to diphtheria toxoid. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use Diptheria Toxoid IgG Low Control: bottle containing.ml of diluted human serum containing antibodies to diphtheria toxoid. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use Diptheria Toxoid IgG Conjugate: bottle containing ml of purified peroxidase labelled antibody. Coloured red. Ready to use. 6.. TMB Substrate: bottle containing 4mL TMB substrate. Ready to use. 6.. Stop Solution: bottle containing 4mL of 3M phosphoric acid. Ready to use. 6. ADDITIONAL MATERIALS AND EQUIPMENT - not supplied 6.. Automatic microplate plate washer: This is recommended, however, plate washing can be performed manually. 6.. Plate reader: Capable of measuring optical densities at 4nm referenced on air Distilled or deionised water: This should be of the highest quality available Calibrated micropipettes: for dispensing, & μl. 6.. Multichannel pipette: Recommended for dispensing μl volumes of conjugate, substrate and stop solution Glass/plastic tubes: For sample dilution 7 ASSAY METHOD 7. PRE-ASSAY STEPS. Bring the kit to room temperature The kit is designed for room temperature operation (-4 C). Remove the kit from storage and stand at room temperature for approximately 6 minutes. Wells must not be removed from the foil bag until they have reached room temperature. Note: The kits may be maintained at room temperature for up to week.. Kit components Gently mix each kit component before use. 3. Wash buffer dilution Add ml of the wash buffer concentrate to 9mL of distilled water ( in dilution) into a clean container and mix. Smaller volumes can be diluted as appropriate. Note: Diluted wash buffer can be stored at room temperature for up to 4 weeks, therefore only dilute the appropriate amount.

2 Alternate EIA IU/mL No. samples 4. Sample dilution Dilute μl of each sample with μl of sample diluent and (:) and mix well. Note: Diluted sample must be used within 8 hours.. Strip and frame handling Place the required number of wells in the strip holder. Position from well A, filling columns from left to right across the plate. When handling the plate, squeeze the long edges of the frame to prevent the wells falling out. Note: Return unused wells to the foil bag immediately with the two desiccant pouches and re-seal tightly to minimise exposure to moisture. Take care not to puncture or tear the foil bag, see below. WARNING: Exposure of wells to moisture or contamination by dust or other particulate matter will result in antigen degradation, leading to poor assay precision and potentially false results. 7. ASSAY METHOD Maintain the same dispensing sequence throughout the assay.. Sample addition Dispense μl of each calibrator, control and diluted (:) sample into the appropriate wells of the plate provided. Note: Samples should be added as quickly as possible to the plate to minimise assay drift, and the timer started after the addition of the last sample. Incubate at room temperature for 3 minutes.. Washing The washing procedure is critical and requires special attention. An improperly washed plate will give inaccurate results, with poor precision and high backgrounds. After incubation remove the plate and wash wells 3 times with -3μL wash buffer per well. Wash the plate either by using an automatic plate washer or manually as indicated below. After the final automated wash, invert the plate and tap the wells dry on absorbent paper. Plates can be washed manually as follows: a. Flick out the contents of the plate into a sink. b. Tap the wells dry on absorbent paper. c. Fill each well with -3μL of wash buffer using a multichannel pipette. d. Gently shake the plate on a flat surface. e. Repeat a-d twice. f. Repeat a. and b. 3. Conjugate addition Dispense μl of conjugate into each well, blot the top of the wells with a tissue to remove any splashes. Note: To avoid contamination, never return excess conjugate to the reagent bottle. Incubate at room temperature for 3 minutes. 4. Washing Repeat step.. Substrate (TMB) addition Dispense μl of TMB substrate into each well, blot the top of the wells with a tissue to remove any splashes. Note: To avoid contamination never return excess TMB to the reagent bottle. Incubate at room temperature in the dark for 3 minutes. 6. Stopping Dispense μl of stop solution into each well. This causes a change in colour from blue to yellow. 7. Optical density measurement Read the optical density (OD) of each well at 4nm on a microplate reader, within 3 minutes of stopping the reaction. Note: See point in Section 8 below. 8 RESULTS AND QUALITY CONTROL. Reader settings This is a particularly sensitive assay, in order to accurately measure low samples, it is advisable not to subtract blank OD readings from the results and in addition optical densities should be read at 4nm without using a reference filter.. Quality control In order for an assay to be valid, all the following criteria must be met: Calibrators and controls must be included in each run. The value obtained for each control should be in the range specified on the QC Certificate. If the above criteria are not met, the assay is invalid and the test should be repeated. The curve shape should be similar to the calibration curve, shown on the QC Certificate. 3. Calculate mean optical densities (For assays run in duplicate only) For each calibrator, control and sample calculate the mean OD of the duplicate readings. The percentage coefficient of variation (%C.V.) for each duplicate OD should be less than %. 4. Plot calibration curve The calibration curve can be plotted either automatically or manually as follows by plotting the anti-diphtheria toxoid antibody concentration on the log scale against the OD on the linear scale for each calibrator:- Automatic - use appropriately validated software, and the curve fit that best fits the data. Manual - using log/linear graph paper, draw a smooth curve through the points (not a straight line or point to point). 6. Calculation of the control values Read the level of the anti-diphtheria toxoid antibody in the controls directly from the calibration curve. The value should fall within the range given on the QC Certificate. 7. Calculation of antibody levels in diluted samples Read the level of the anti-diphtheria toxoid antibody in the diluted samples directly from the calibration curve. Note: The calibrator values have been adjusted by a factor of to account for a : sample dilution. No further correction is required. 8. Assay calibration The assay is calibrated against the NIBSC diphtheria antitoxin reference preparation /496, results are reported in IU/mL, which is supplied by the National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC: 9. Limitations Pre- and post-vaccination samples should be run simultaneously. This kit may be used to aid diagnosis of immunodeficiency. Results must be confirmed by clinical findings and other serological tests. The results obtained from this assay are not diagnostic proof of lack of protection/protection against diphtheria or the presence or absence of immunodeficiency. 9 PROTECTIVE LEVELS The level of protective antibody in the normal population has been cited in the literature as between. and. IU/mL -4. The WHO guide line states minimum protective level is considered to be. IU/mL of diphtheria antitoxin in a serum sample. The higher level of. IU/mL is desirable for individual protection. Due to the wide ranges quoted above, it is recommended that each laboratory determine its own normal protective range. TYPICAL VALUES Anti-diphtheria toxoid IgG antibody levels were measured in serum from 8 normal adult blood donors (of unknown vaccination and immune status). The results displayed below, are provided for illustration only, and should not be used to calculate a normal range Anti-diphtheria toxoid IU/mL PERFORMANCE CHARACTERISTICS. PRECISION The intra- and inter-assay precision was measured using three samples within the range of the calibration curve. The concentration and % C.V. for each sample are given below: INTRA-ASSAY PRECISION n=6 Concentration (IU/mL) % C.V. Sample.9 6. Sample Sample INTER-ASSAY PRECISION n=3 Concentration (IU/mL) % C.V. Sample Sample.4 4. Sample CORRELATION Against an alternative anti-diphtheria toxoid EIA kit using 8 test samples... y =.96x +.86 R =.9.. Binding Site EIA IU/mL. Treatment of anomalous points If any one point does not lie on the curve, it can be removed. If the absence of this point means that the curve has a shape dissimilar to that of the sample calibration curve, or more than one point appears to be anomalous, then the assay should be repeated. Insert Code: E4, Version th January, Page of

3 VCA IU/mL Against the VCA test, using test samples y =.7336x R = Binding Site EIA IU/mL.3 INTERFERING SUBSTANCES A range of interfering substances has been spiked into an anti-diphtheria high and low sample, which have then been subsequently assayed. The method used to check these substances was based on the Interference Check A plus kit - Kokusai Shiyaku, Japan. Substance Bilirubin F (Free) Bilirubin C (Conjugate) Haemolysed Haemoglobin Chyle No interference was observed in any sample tested. Concentration 8.mg/dL.6mg/dL 48mg/dL 473 Units.4 ANALYTICAL SENSITIVITY Sensitivity was determined as the mean concentration given by determinations of the sample diluent. This equates to.6 IU/mL.. MEASURING RANGE The measuring range of the assay is IU/mL based on all 7 calibrators. REFERENCES. Pilars CE and Spiess H. (98). Diphtherie- und Tetanusantikorper bei Kindern und jungen Erwachsenen. Dtsch med Waschr, 6: Booy R et al. (99). Immunogenicity of combined diphtheria, tetanus and pertussis vaccine given at, 3 and 4 months versus 3, and 9 months of age. The Lancet, 339(879): Maple PA et al. (99). Diphtheria immunity in UK blood donors. The Lancet, 34: Melville-Smith M. Diphtheria and tetanus antitoxins. ELISA In the clinical microbiology laboratory, Editors Wreghitt TG and Morgan-Capner P, Published by the UK Public Health Laboratory Service.. WHO meeting report. (99) The Control of Diphtheria in Europe. WHO ref: EUR/ICP/EPI 4. Diphtherie Toxoid IgG Enzym-Immunoassay-Kit Zur in-vitro Diagnostik Bestell-Nr.: MK4 Hergestellt von: The Binding Site Group Ltd, PO Box 7, Birmingham B4 4ZB, UK. Vertrieb in Deutschland und Österreich durch: The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße A D-6873 Schwetzingen, Deutschland Telefon: +49 () Fax: +49 () office@bindingsite.de VERWENDUNGSZWECK Dieser Kit dient zur in-vitro Bestimmung von spezifischen IgG-Antikörpern gegen das Diphterie-Toxoid in Humanserum. Mit diesem Test kann der Impfschutz-Status vor und nach einer Impfung bestimmt werden. Der Kit enthält ausreichend Material um maximal 39 Proben in Doppelbestimmung oder 87 Proben in Einzelbestimmung, sowie eine Kalibrationskurve (7 Punkte) und Kontrollen, zu messen. Die 7-Punkt-Kalibrationskurve kann auch auf Kalibrationspunkte reduziert werden, falls die Messung von Konzentrationen unterhalb von,37 IU/mL nicht notwendig ist. EINFÜHRUNG Anti-Diphtherie-Toxoid-Antikörper werden als Antwort auf eine Impfung mit dem Diphterie-Toxoid-Protein gebildet. Die Immunantwort eines Patienten kann anschließend durch die serologische Bestimmung der Anti-Diphterie-Toxoid- Antikörperkonzentration mit diesem quantitativen Enzym-Immunoassay ermittelt werden. Es ist bekannt, dass speziell in Europa der Vero Cell Assay (VCA) als Referenzmethode angesehen wird. Mit diesem Test werden die neutralisierenden Antikörper aller Immunglobulinklassen erfasst, d. h. nicht nur IgG. Schon in der Vergangenheit wurde gezeigt, dass die Korrelation zwischen kommerziellen ELISA Kits und dem Vero Cell Assay schlecht ist, da die ELISAs einen Anteil an spezifischen Antikörpern, die das Diphterie Toxoid nicht neutralisieren, erfassen können. Zur Beschichtung der Mikrotiterplatten wird der Diphterie-Impfstoff verwendet, dadurch werden mit diesem Test die spezifischen IgG-Antikörper, die aufgrund der Impfung gebildet wurden, gemessen. 3 TESTPRINZIP Insert Code: E4, Version th January, Page 3 of Die Wells (Vertiefungen) der Mikrotiterplatten sind mit dem Diphterie-Toxoid-Antigen beschichtet. Die Kalibratoren, Kontrollen und zu testende Proben werden in den Wells inkubiert, so dass die Anti-Diphterie-Toxoid-Antikörper während der ersten Inkubation an das immobilisierte Antigen binden können. Nach dem Waschen der Wells - zum Entfernen des ungebundenen Proteins - gibt man das affinitätsgereinigte, mit Peroxidase markierte Kaninchen Anti-Human-IgG-Konjugat (-Ketten spezifisch) hinzu. Nach einer weiteren Inkubation und einem weiteren Waschvorgang - um das ungebundene Konjugat zu entfernen - wird das gebundene Konjugat mit Hilfe von 3,3',,' - Tetramethylbenzidin (TMB) sichtbar gemacht. TMB ergibt ein blaues Reaktionsprodukt, dessen Intensität proportional zur Antikörperkonzentration der Probe ist. Phosphorsäure wird in jedes Well pipettiert, um die Reaktion zu stoppen. Das daraus resultierende gelbe Reaktionsprodukt wird bei 4nm gemessen. 4 WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN 4. WARNUNGEN Jede Einzelspende von humanem Serum wurde untersucht und bezüglich Antikörper gegen das Human-Immunschwäche-Virus (HIV & ), das Hepatitis-C- Virus und gegen das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) als negativ befunden. Die hierfür verwendeten Tests sind entweder von der FDA (USA) zugelassen oder für den Gebrauch in der in vitro Diagnostik in der EU freigegeben (Directive 98/79/EC, Annex II). Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Auschluss dieser und anderer Infektionsträger. Umgangs- und Entsorgungsmethoden sollten denen für potentiell infektiösem Material entsprechen (inklusive dem Tragen entsprechender Schutzkleidung). Der Test sollte nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. Dieses Produkt enthält Natriumazid und ProClin 3 und muss mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden. Das Tragen von Handschuhen und anderer Schutzkleidung wird während des Umgangs mit diesem Produkt empfohlen. Verschlucken sowie Kontakt mit Haut (v.a. bei Verletzungen) oder Schleimhäuten vermeiden. Nach Kontakt Hautstelle mit viel Wasser abspülen und ärztlichen Rat einholen. Natriumazid kann mit Bleioder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser, nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden. Alle Puffer und Seren im Kit enthalten die unten aufgelisteten Enzym-Inhibitoren als Konservierungsmittel. Diese Substanzen sind als Gefahrstoffe anzusehen und müssen mit Vorsicht gehandhabt werden. INHIBITOR KONZENTRATION Kathon,% Natriumazid,99% ProClin 3,4% Bromonitrodioxan,% Methylisothiazon,% ProClin ist ein Warenzeichen der Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA

4 Kathon wirkt reizend und kann bei Hautkontakt zu einer Sensibilisierung führen. Die Stopp-Lösung enthält 3M Phosphorsäure, die Reizungen auslösen kann. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen. Verschüttete Reagenzien entsprechend beseitigen, dabei sind ökologische und gesetzliche Bestimmungen zu beachten. 4. VORSICHTSMASSNAHMEN Dieser Test sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal durchgeführt werden. Es wird empfohlen, die Arbeitsanleitung genau einzuhalten. Jegliche Abweichung kann die Qualität dieses empfindlichen Tests beeinflussen. Sollte dadurch die gemessenen Werte der optischen Dichten niedrig sein, kann dies die Sensitivität beeinträchtigen. Beachten Sie die spezifischen Hinweise und Warnungen in dieser Arbeitsanleitung. Reagenzien unterschiedlicher Chargen dürfen NICHT untereinander gemischt oder gemeinsam verwendet werden. Bei großem Testdurchsatz muss darauf geachtet werden, dass alle Reagenzien der GLEICHEN Charge entstammen. Alle Mikrotiterstreifen müssen aus demselben Folienbeutel entnommen werden. Der Austausch einer Testkomponente kann inkorrekte Ergebnisse zur Folge haben. Zur Vermeidung von Kontaminationen der Reagenzien immer saubere Plastik- oder Glasgefäße verwenden. Niemals unbenutztes Reagenz in die Flaschen zurückgeben. Reagenzienflaschen nicht für längere Zeit offen stehenlassen. Die daraus resultierende Verdunstung oder Verunreinigung führt zu widersprüchlichen Ergebnissen. TMB darf weder mit Licht noch mit Wasser in Berührung kommen. Die Verwendung mikrobiell oder mit Partikeln verunreinigter, hämolytischer oder lipämischer Seren vermeiden. Falsche Probenverdünnungen können nicht erkannt werden, da die Kit-Kontrollen gebrauchsfertig sind. Es wird empfohlen, kalibrierte Pipetten und geeignete interne Kontrollen zu verwenden. Bei der Verwendung von automatisierten Testsystemen, Probenverdünnern und anderem automatisierten Zubehör, sind die Anweisungen des Herstellers sorgfältig zu befolgen. Besondere Sorgfalt gilt der Aufstellung und Installation der Geräte und der Verbindung zu externen Systemen. Alle Einstellungen, die die automatisierten Wasch- und Lesegeräte betreffen, müssen sorgsam befolgt werden. Die Geräte müssen den Herstellerangaben entsprechend instand gehalten und gewartet werden. 4.3 LAGERUNG UND STABILITÄT Den Kit bei -8 C lagern, nicht einfrieren. Lagerung bei falscher Temperatur beeinflusst die Ergebnisse. Der verdünnte Waschpuffer ist in einem sauberen Gefäß bei Raumtemperatur bis maximal 4 Wochen haltbar. Die Haltbarkeit des Kits wird auf dem Außenetikett angegeben. PROBENENTNAHME UND -VORBEREITUNG Blutproben über Venenpunktur sammeln und auf natürliche Weise gerinnen lassen. Serum vom Gerinnsel trennen. Die Seren können bei -8 C bis zu 48 Stunden vor dem Test gelagert werden. Für eine längere Lagerung wird empfohlen, die Seren unverdünnt bei mindestens - C einzufrieren. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben vermeiden. Serumproben nicht hitzeinaktivieren, dies kann zu falsch-positiven Ergebnissen führen. 6 MATERIALIEN 6. GELIEFERTE MATERIALIEN 6.. Arbeitsanleitung: mit genauen Angaben zur Testdurchführung. 6.. QC-Zertifikate: mit chargenspezifischen Angaben zu den Kontroll- Sollwerten und der idealen Kalibrationskurve Diphtheria Toxoid Coated Wells (Diphterie Toxoid beschichtete Mikrotiterstreifen): Mikrotiterstreifen mit je 8 vereinzelbaren Wells, die mit von Corynebacterium diphteriae abgeleitetem Diphterie-Toxoid beschichtet sind. Die Streifen sind in einem wiederverschließbaren Folienbeutel, der zwei Beutel Trockenmittel enthält, verpackt Sample Diluent (Probenverdünnungspuffer): Flaschen mit je ml gebrauchsfertigem Puffer zur Probenverdünnung. Farbcodierung: gelb. 6.. Wash Buffer (Waschpuffer): Flasche mit ml eines -fach konzentrierten Puffers zum Waschen der Wells Diphtheria Toxoid IgG Calibrators (Diphterie-Toxoid-IgG-Kalibratoren): 7 Flaschen mit je,ml gebrauchsfertig verdünntem Humanserum, mit folgenden Konzentrationen an Anti-Diphterie-Toxoid-Antikörper: 3; ;,333;,;,37;, und,4 IU/mL Diphtheria Toxoid IgG High Control (Diphterie-Toxoid-IgG-Kontrolle, High Level): Flasche mit,ml verdünntem Humanserum, das Antikörper gegen Diphterie-Toxoid enthält. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben. Gebrauchsfertig Diphtheria Toxoid IgG Low Control (Diphterie-Toxoid-IgG-Kontrolle, Low Level): Flasche mit,ml verdünntem Humanserum, das Antikörper gegen Diphterie-Toxoid enthält. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben. Gebrauchsfertig Diphtheria Toxoid IgG Conjugate (Diphterie-Toxoid-IgG-Konjugat): Flasche mit ml gereinigtem, Peroxidase-markiertem Antikörper gegen Human-IgG. Farbcodierung: rot. Gebrauchsfertig. 6.. TMB Substrate (TMB-Substrat): Flasche mit 4mL TMB-Lösung. Gebrauchsfertig. 6.. Stop Solution (Stopp-Lösung): Flasche mit 4mL 3M Phosphorsäure. Gebrauchsfertig. 6. Benötigte, nicht im Kit enthaltene Materialien 6.. Automatisches Mikrotiterplatten-Waschgerät: ist empfehlenswert, aber die Platten können auch manuell gewaschen werden. 6.. Mikrotiterplatten-Reader: Messung der optischen Dichte in den Wells bei 4nm Destilliertes Wasser: Es sollte von höchster Qualität und frei von Metallionen sein Kalibrierte Mikropipetten: Zum Pipettieren von, & μl. 6.. Mehrkanal-Pipette: Zum Pipettieren von Volumina von μl Glas- oder Plastikgefäße: Zur Probenverdünnung. 7 TESTDURCHFÜHRUNG 7. Testvorbereitung. Kit auf Raumtemperatur erwärmen Die optimale Temperatur für die Testdurchführung liegt bei -4 C. Den Kit nach Entnahme aus dem Kühlschrank ca. 6 Minuten auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Die Wells bis zum tatsächlichen Gebrauch in der Folie belassen! Hinweis: Der Kit kann bis zu Woche bei Raumtemperatur gelagert werden.. Kit-Komponenten Jede Kit-Komponente vor Gebrauch kurz schütteln. 3. Waschpuffer verdünnen Dazu ml Waschpuffer-Konzentrat und 9mL destilliertes Wasser (/ Verdünnung) in ein sauberes Gefäß geben und mischen. Es können auch entsprechend kleinere Volumina verdünnt werden. Hinweis: Der verdünnte Puffer ist bei Raumtemperatur bis zu 4 Wochen haltbar; deshalb nur die benötigte Menge verdünnen. 4. Verdünnung der Proben μl jeder Probe mit μl Probenverdünnungspuffer verdünnen (:) und gut mischen. Hinweis: Die verdünnten Proben müssen innerhalb von 8 h gemessen werden.. Umgang mit Streifen und Rahmen Die benötigte Anzahl Wells aus dem Folienbeutel entnehmen und in den Rahmen setzen. Dabei von Position A ausgehend die Spalten von links nach rechts auffüllen. Achten Sie darauf, die langen Seiten des Rahmens zusammenzudrücken, damit die Wells nicht herausfallen können. Hinweis: Um die Kontaktzeit mit der Luftfeuchtigkeit zu minimieren, die nicht verwendeten Wells sofort in den wiederverschließbaren Folienbeutel mit dem Trockenmittel geben und gut verschließen. Darauf achten, dass der Folienbeutel nicht beschädigt wird. ACHTUNG: Kontakt mit Feuchtigkeit oder Verunreinigung durch Staub oder andere Partikel kann einen Antigen-Abbau verursachen. Daraus resultiert eine schlechte Präzision und potentiell falsche Ergebnisse. 7. TESTDURCHFÜHRUNG Alle Reagenzien in der gleichen Reihenfolge pipettieren.. Pipettieren der Kalibratoren, Kontrolle und Proben μl von jedem Kalibrator, jeder Kontrolle und jeder verdünnten (:) Probe in das dafür laut Plattenschema vorgesehene Well pipettieren. HINWEIS: Die Proben müssen so schnell wie möglich pipettiert werden; die Inkubationszeit läuft ab Zugabe der letzten Probe. 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.. Waschen der Platte Sorgfältiges Waschen der Wells ist wichtig für eine hohe Präzision und genaue Testergebnisse. Bei nicht korrekt gewaschenen Wells können ungenaue Ergebnisse mit schlechter Präzision und hohem Hintergrund auftreten. Nach der Inkubation die Wells dreimal mit -3μL Waschpuffer waschen. Das Waschen kann mit einem automatischen Platten-Waschgerät oder manuell erfolgen. Nach dem letzten Waschschritt die Wells durch leichtes Klopfen auf eine absorbierende Unterlage (z.b. Papiertücher) trocknen. Manuelles Waschen: a. Den Inhalt der Wells in den Ausguss schütten, dabei die langen Seiten des Rahmens zusammendrücken. b. Die Wells auf einer absorbierenden Unterlage (z.b. Papiertücher) leicht ausklopfen. c. -3µL Waschpuffer in der Arbeitskonzentration in die Wells pipettieren. d. Die Mikrotiterplatte auf einer flachen Unterlage stehend leicht schütteln. e. Zweimaliges Wiederholen der Schritte a bis d. f. Die Wells wie unter a und b entleeren. 3. Pipettieren des Konjugats µl Konjugat in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier abtrocknen, um Spritzer zu entfernen. Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges Konjugat in die Konjugat-Flasche zurückgeben. 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 4. Waschen der Platte Siehe Abschnitt.. Pipettieren von Substrat (TMB) Nach dem Waschen μl TMB in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier abtrocknen, um Spritzer zu entfernen. Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges TMB in die TMB-Flasche zurückgeben. 3 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. 6. Reaktionsende μl Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren. Die Farbe schlägt von blau nach gelb um. 7. Farbmessung Die optische Dichte (OD) bei 4nm in jedem Well mit einem Mikrotiterplatten- Reader innerhalb von 3 Minuten nach Zugabe der Stopp-Lösung bestimmen. Hinweis: Siehe Punkt in Abschnitt 8. 8 ERGEBNISSE UND QUALITÄTSKONTROLLE. Einstellung des Readers Dieser Test ist besonders empfindlich. Um Proben mit niedrigen Konzentrationen akkurat zu messen, wird empfohlen, von den Proben-OD-Werten keinen Leerwert (Blank) abzuziehen. Die OD-Messung sollte bei 4nm ohne Referenzfilter erfolgen.. Qualitätskontrolle Nur, wenn alle nachfolgend aufgeführten Kriterien erfüllt sind, ist der Test gültig. Kalibratoren und Kontrolle müssen bei jedem Testansatz mitgeführt werden. Die Ergebnisse der Kontrollen müssen in dem angegebenen Wertebereich (siehe QC-Zertifikat) liegen. Die berechnete Kalibrationskurve sollte der auf dem QC-Zertifikat abgebildeten Kalibrationskurve ähnlich sein. Ist dies nicht der Fall, ist der Test ungültig und muss wiederholt werden. Insert Code: E4, Version th January, Page 4 of

5 Anzahl der Proben VCA IU/mL Alternativer EIA IU/mL 3. Berechnung der mittleren optischen Dichte (nur bei Doppelbestimmung) Für jeden Kalibrator und jede Kontrolle und Probe die mittlere optische Dichte (OD) der Doppelbestimmungen berechnen. Der Variationskoeffizient (%VK) der Doppelbestimmungen sollte jeweils unter % liegen. 4. Erstellen der Kalibrationskurve Die Kalibrationskurve kann entweder automatisch oder manuell erstellt werden. Dazu wird die Anti-Diphterie-Toxoid-IgG-Antikörperkonzentration auf der logarithmischen Skala gegen die OD-Werte auf der linearen Skala für jeden Kalibrator aufgetragen. Automatisch: Geeignete, validierte Software verwenden. Kalkulationsmodus verwenden, der am besten zu den Daten passt. Manuell: Halblogarithmisches Millimeterpapier verwenden, eine Ausgleichskurve durch die Punkte legen (keine Gerade oder Punkt-zu-Punkt- Verbindung).. Umgang mit abweichenden Kalibrationspunkten Liegt ein Messpunkt nicht auf der Kalibrationskurve, so kann er weggelassen werden. Der Test sollte wiederholt werden, wenn die daraus resultierende Kalibrationskurve deutlich von der im QC-Zertifikat angegebenen Kurvenform abweicht oder, wenn mehrere Kalibrationspunkte zu starke Abweichungen aufweisen. 6. Berechnung der Antikörper-Konzentrationen in den Kontrollen Die Anti-Diphterie-Toxoid-IgG-Antikörper-Konzentrationen der Kontrollen können direkt aus der Kalibrationskurve abgelesen werden. Die Kontrollwerte müssen in den im QC-Zertifikat angegebenen Bereich fallen. 7. Berechnung der Antikörper-Konzentrationen in den Proben Die Anti-Diphterie-Toxoid-IgG-Antikörper-Konzentrationen der Proben können direkt aus der Kalibrationskurve abgelesen werden. Hinweis: Die Standard-Probenverdünnung von : ist in der Kalibrationskurve bereits berücksichtigt. Es sind keine weiteren Korrekturen nötig. 8. Kalibration des Tests Der Test ist gegen die NIBSC Diphtherie-Antitoxin-Referenzpräparation /496 kalibriert. Die Ergebnisse werden in IU/mL angegeben. 9. Grenzen des Tests Proben zur Testung von Pre- und Post-Impfung sollten immer gemeinsam getestet werden. Dieser Testkit dient zur Unterstützung der Diagnose von Immundefekten. Ein positives Ergebnis muss durch den klinischen Befund und andere serologische Untersuchungen bestätigt werden. Die Testergebnisse können nicht als diagnostischen Beweis für das Vorliegen bzw. Nichtvorliegen eines Impfschutzes gegen Diphterie oder eines Immundefektes verwendet werden. 9 IMPFSCHUTZ In einer normalen Population wird ein Impfschutz bei einer Antikörperkonzentration zwischen, und, IU/mL in der Literatur angegeben -4. In den WHO -Richtlinien wird eine Diphterie-Antitoxin-Konzentration von, IU/mL als minimaler Impfschutz angegeben. Eine höhere Konzentration von, IU/mL ist für einen individuellen Schutz wünschenswert. Da der oben aufgeführte Bereich sehr weit ist, wird empfohlen, dass jedes Labor seinen eigenen Impfschutz-Bereich ermittelt. TYPISCHE WERTE Anti-Diphtherie-Toxoid-IgG-Antikörper-Konzentrationen wurden in Seren von 8 normalen Blutspendern, wobei keine Informationen über Impfung und Immunstatus vorlagen, ermittelt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Grafik aufgeführt. Diese Werte sind nur zur Veranschaulichung gedacht, hiermit sollte kein Normalbereich berechnet werden. 3 LEISTUNGSDATEN Anti-Diphtherie Toxoid IU/mL. PRÄZISION Die Intra- und Inter-Assay-Präzision wurde mit drei Proben, deren Antikörper- Konzentrationen innerhalb der Kalibrationskurve liegen, bestimmt. Die mittlere Konzentration und der Variationskoeffizient (%VK) sind nachfolgend angegeben: INTRA-ASSAY-PRÄZISION n=6 Konzentration (IU/mL) % VK Probe,9 6, Probe,46 6, Probe 3,6 4,. KORRELATION Gegen einen alternativen Anti-Diphtherie-Toxoid-EIA Kit unter Verwendung von 8 Proben... y =,96x +,86 R =,9.. Binding Site EIA IU/mL Gegen den Vero Cell Assay (VCA unter Verwendung von Proben y =,7336x +,868 R =, Binding Site EIA IU/mL.3 INTERFERIERENDE SUBSTANZEN Seren mit hoher und niedriger Anti-Diphtherie-Toxoid-Konzentration wurden mit verschiedenen, potentiell störenden Substanzen versetzt und anschließend mit diesem Kit getestet. Die verwendete Methode basiert auf dem Interference Check A plus Kit von Kokusai Shiyaku, Japan. Substanz Bilirubin F (Frei) Bilirubin C (Konjugiert) Hämolysiertes Hämoglobin Chylus Konzentration 8,mg/dL,6mg/dL 48mg/dL 473 Units Es wurden keine Störungen bei den getesteten Proben gefunden..4 ANALYTISCHE SENSITIVITÄT Die Sensitivität wird als die mittlere Konzentration von Messungen des Probenverdünnungspuffers ausgedrückt und ist gleich,6 IU/mL.. MESSBEREICH Der Messbereich dieses Tests liegt bei einer 7-Punkt-Kalibrationskurve zwischen 3,-,4 IU/mL. REFERENZEN. Pilars CE and Spiess H. (98). Diphtherie- und Tetanusantikorper bei Kindern und jungen Erwachsenen. Dtsch med Waschr, 6: Booy R et al. (99). Immunogenicity of combined diphtheria, tetanus and pertussis vaccine given at, 3 and 4 months versus 3, and 9 months of age. The Lancet, 339(879): Maple PA et al. (99). Diphtheria immunity in UK blood donors. The Lancet, 34: Melville-Smith M. Diphtheria and tetanus antitoxins. ELISA In the clinical microbiology laboratory, Editors Wreghitt TG and Morgan-Capner P, Published by the UK Public Health Laboratory Service.. WHO meeting report. (99) The Control of Diphtheria in Europe. WHO ref: EUR/ICP/EPI 4. INTER-ASSAY-PRÄZISION n=3 Konzentration (IU/mL) % VK Probe 4,4 7, Probe,4 4, Probe 6,73,8 Insert Code: E4, Version th January, Page of

6 Coffret ELISA de dosage des anticorps anti-toxine diphterique IgG Pour un usage en diagnostic in vitro Référence : MK4 Produits fabriqués en Angleterre par la société : The Binding Site Group Ltd., PO Box 7, Birmingham B4 4ZB, UK Distribués en France par la société : The Binding Site France, 4 rue des Glairaux, BP6, 38 St Egrève Cedex Téléphone : Fax : info@bindingsite.fr UTILISATION Ce coffret permet de quantifier in vitro les anticorps anti-toxine diphtérique de classe IgG présents dans le sérum afin de déterminer le statut pré et post vaccination. Au maximum, il est possible de tester 39 échantillons en double ou 87 en simple avec 7 points de calibration et deux contrôles. La courbe de calibration en 7 points peut être réduite à points en supprimant les points bas si des mesures en dessous,37 UI/mL ne sont pas requises. PRESENTATION GENERALE Les anticorps anti-toxine diphtérique sont obtenus en réponse à la vaccination par la toxine diphtérique. La réponse immunitaire d un patient peut être estimée correctement par la détermination sérologique du taux d anticorps anti-toxine diphtérique en utilisant ce coffret. Il faut noter que la méthode de référence, en Europe notamment, est le «Vero Cell Assay» (VCA). Ce test permet de déterminer la quantité d anticorps neutralisants quelle que soit sa classe et non pas uniquement ceux de type IgG. La corrélation entre les coffrets ELISA commerciaux et le test VCA est mauvaise. Ceci est dû au fait que les coffrets ELISA peuvent détecter une proportion d anticorps spécifiques ne neutralisant peut-être pas la toxine diphtérique. Ce test utilisant de la toxine diphtérique coatée au fond des puits, permet de quantifier les anticorps spécifiques de classe IgG produits après vaccination. 3 PRINCIPE DU TEST Les micropuits sont recouverts avec de la toxine diphtérique. Les calibrateurs, les contrôles et les échantillons dilués sont déposés dans les puits permettant ainsi la liaison des anticorps dirigés contre la toxine diphtérique durant la première incubation. Après avoir rincé les puits pour éliminer toutes les protéines non accrochées, un conjugué de lapin anti-igg humaines (chaîne spécifique) couplés à la péroxydase est ajouté. Le conjugué se lie aux anticorps humains fixés et le conjugué en excés est éliminé par une étape de lavage. Le conjugué lié est visualisé avec du tétraméthylbenzidine 3,3,, (TMB) qui donne un produit de réaction bleu. Son intensité est proportionnelle à la concentration d anticorps dans l échantillon. De l acide phosphorique est ajouté à chaque puits pour stopper la réaction. Le produit final est coloré en jaune et la densité optique est lue à 4nm. 4 PRECAUTIONS 4. AVERTISSEMENT Tous les sérums humains fournis dans ce coffret ont été testés et trouvés négatifs pour l antigène de surface de l hépatite B (Ag HBs), pour le virus de l hépatite C et pour les anticorps anti-virus de l immunodéficience humaine (HIV and HIV). Les tests utilisés ont soit été approuvés par la FDA (USA) ou accepté pour un usage en diagnostic in-vitro par l union européenne (Directive 98/79/EC, Annexe II); néanmoins ces tests ne peuvent garantir l absence d agents infectieux Tous les échantillons doivent donc être manipulés comme des produits potentiellement infectieux. Seul un personnel qualifié dans la manipulation d échantillons potentiellement infectieux est autorisé à utiliser ce coffret. Ce produit contient de l azide de sodium et ProClin 3 et doit être manipulé avec précaution; des gants appropriés et d autres vêtements de protection doivent être portés lors de toutes manipulation. Ne pas ingérer ou avoir de contact avec la peau (spécialement sur les zones abîmées) ou des muqueuses. S il y a contact, laver abondamment avec de l eau et demander un avis médical. Des azides de métaux explosifs peuvent se former par contact prolongé entre de l azide de sodium et les tuyauteries en plomb et cuivre; pour éliminer les réactifs, rincer avec un large volume d eau pour prévenir tout dégât. Les tampons et sérums fournis dans ce coffret contiennent plusieurs inhibiteurs d enzymes listés ci-dessous. Les manipuler avec précaution. Ils sont dangereux et doivent manipulés avec précaution. INHIBITEUR Kathon Azide de sodium ProClin 3 Bromonitrodioxane Methylisothiazone CONCENTRATION,%,99%,4%,%,% ProClin est une marque déposée par Rohm and Haas Corp. Philadelphie, PA Le kathon est un irritant et peut induire une sensibilisation en cas de contact avec la peau. La solution stop contient de l acide phosphorique 3M qui est irritant. Eviter tout contact avec la peau et les yeux. Les éclaboussures de réactifs doivent être nettoyées de façon appropriée en observant les réglementations locales et environnementales. 4. PRECAUTIONS Ce réactif doit être utilisé par un personnel formé. Il est recommandé de suivre scrupuleusement le protocole. Toute déviation peut affecter les performances de ce test sensible. Si les densités optiques obtenues sont basses, ceci peut affecter la sensibilité du test. Les réactifs des coffrets ayant des numéros de lots différents ne sont pas interchangeables. Si de grandes séries de tests doivent être réalisées, vérifier que tous les réactifs aient le même numéro de lot. Toutes les barrettes utilisées doivent être issues du même sachet aluminium. La substitution de certains réactifs peut induire des résultats incorrects. Afin d éviter la contamination des réactifs, utiliser uniquement de nouveaux récipients ou des récipients propres en verre ou en plastique. Ne jamais remettre les réactifs non utilisés dans leur flacon d origine. Ne pas laisser les réactifs sans bouchon ; l évaporation ou la contamination des réactifs peut induire des résultats incorrects. Le substrat TMB ne doit pas être exposé à la lumière ou mis en contact avec de l eau. Les échantillons hémolysés, lipidiques, contaminés par des bactéries ou contenant des particules de matière ne doivent pas être utilisés. La dilution des échantillons ne peut pas être vérifiée puisque les contrôles des coffrets sont prêts à l emploi. L utilisation de pipettes calibrées et de contrôles de qualité interne est recommandée. Lorsque vous utilisez des systèmes d analyses automatisés, diluteurs d échantillons et autres équipements automatisés, suivez les instructions du fabricant avec soin. Une attention particulière devra être accordée à l'installation de l'équipement et à l'installation et la connexion à des services externes. Tous les paramètres pour les laveurs et lecteurs automatisés doivent être suivis attentivement et les équipements doivent être maintenus et entretenus selon les instructions du fabricant. 4.3 STOCKAGE ET STABILITE Le coffret doit être stocké à -8 C et ne doit pas être congelé. Des températures de stockage non appropriées affecteraient les résultats. Le tampon de lavage dilué dans un récipient propre peut être stocké à température ambiante pendant 4 semaines. La date de péremption du coffret est indiquée sur l étiquette extérieure. COLLECTE ET STOCKAGE DES ECHANTILLONS Les échantillons doivent être prélevés par ponction veineuse et le sérum doit être séparé après coagulation. Le sérum peut être stocké à -8 C pendant 48 heures avant les tests ou congelés à C minimum pour une conservation plus longue. Les congélations et décongélations répétées doivent être évitées. Les sérums ne doivent pas être inactivés par la chaleur, ceci peut induire des faux positifs. 6 REACTIFS 6. MATERIEL FOURNI 6.. Une fiche technique : donnant tous les détails de la technique. 6.. Un certificat de contrôle de qualité : indiquant les performances du lot Diphteria Toxoid Coated Wells (puits) : x 8 puits sécables recouverts de toxine diphtérique. Chaque plaque est emballée dans un étui contenant deux dessiccateurs Sample Diluent (diluant échantillon) : flacons de ml de tampon pour la dilution des échantillons. Il est coloré en jaune et prêt à l emploi. 6.. Wash Buffer (tampon de lavage) : flacon de ml de tampon de lavage concentré fois pour le lavage des puits Diphteria toxoid IgG Calibrator (calibrateur) : 7 flacons contenant,ml de sérum humain dilué. Les concentrations sont les suivantes : 3 ; ;,333 ;, ;,37 ;, et,4 UI/mL. Ils sont prêts à l emploi Diphteria Toxoid IgG High Control (contrôle haut) : flacon contenant,ml de sérum humain contenant des anticorps anti-toxine diphtérique. La valeur est donnée dans le certificat de contrôle qualité. Il est prêt à l emploi Diphteria Toxoid IgG Low Control (contrôle bas) : flacon contenant,ml de sérum humain contenant des anticorps anti-toxine diphtérique. La valeur est donnée dans le certificat de contrôle qualité. Il est prêt à l emploi Diphteria toxoid IgG Conjugate (conjugué) : flacon contenant ml d anticorps anti-igg humain couplé à la péroxydase. Il est coloré en rouge et prêt à l emploi. 6.. TMB Substrate (substrat TMB) : flacon contenant 4mL de substrat TMB. Il est prêt à l emploi. 6.. Stop Solution (solution d arrêt) : flacon contenant 4mL d acide phosphorique 3M. Elle est prête à l emploi. 6. MATERIEL NECESSAIRE ET NON FOURNI 6.. Laveur automatique de plaque : recommandé, cependant les lavages manuels sont également possibles. 6.. Lecteur de plaque : capable de mesurer les densités optiques à 4nm Eau distillée ou désionisée : elle doit être de très bonne qualité Micropipettes calibrées : pour la distribution de volumes de à µl. 6.. Pipette multicanaux : recommandée pour le dépôt de µl de conjugué, substrat et de solution d arrêt Tubes en verre/plastique : pour la dilution des échantillons. 7 PROTOCOLE 7. ETAPES PREALABLES. Ramener le coffret à température ambiante Le coffret est opérationnel à une température comprise entre et 4 C. Avant utilisation, laisser le coffret à température ambiante pendant environ 6 minutes. Ne pas retirer les barrettes de leur sachet aluminium durant cette période. Attendre que les barrettes soient à température ambiante. Note : Les coffrets peuvent être gardés à température ambiante pendant une semaine.. Composants du coffret Mélanger chaque composant du coffret avant utilisation. Insert Code: E4, Version th January, Page 6 of

7 Nb d'échantillons 3. Dilution du tampon de lavage Ajouter les ml de tampon concentré à 9mL d eau distillée (dilution au /) dans un récipient propre et mélanger. Si le coffret n est pas utilisé en une fois, il est possible de diluer de plus petits volumes en respectant la dilution préconisée. Note : Le tampon dilué peut être stocké 4 semaines à température ambiante. 4. Dilution de l échantillon Diluer µl de chaque échantillon avec µl de diluant échantillon (/) et mélanger bien. Note: L échantillon dilué doit être utilisé dans les 8 heures suivant la dilution.. Manipulation des barrettes Sortir le nombre nécessaire de puits et les enfiler sur le cadre. A partir de la position A, remplir les colonnes de gauche à droite. Lors de la manipulation du cadre, le maintenir dans le sens de la longueur afin d empêcher les barrettes de sortir de leur logement. Note : Les puits non utilisés doivent être remis dans la pochette avec deux dessiccateurs correctement fermée pour protéger de la poussière. Attention de ne pas trouer ou déchirer la pochette, voir ci-dessous. ATTENTION : L exposition des puits à l humidité ou la contamination avec de la poussière ou des particules de matière induit une dégradation de l antigène conduisant à une faible précision des résultats et potentiellement à des résultats faux. 7. PROCEDURE Maintenir la même séquence de dépôt durant tout le test.. Dépôt de l échantillon Déposer μl de chaque calibrateur et contrôle prêts à l emploi et de chaque échantillon dilué (au /) dans les puits appropriés de la plaque. Note : Les échantillons doivent être déposés sur la plaque aussi rapidement que possible, le décompte du temps doit commencer après l addition du dernier échantillon. Incuber à température ambiante 3 minutes.. Lavage La procédure de lavage est très importante et requiert une attention spéciale. Une plaque mal lavée donnera des résultats incorrects avec une précision faible et un bruit de fond important. Après incubation, laver trois fois les puits avec à 3µL de tampon de lavage en utilisant un laveur automatique ou manuellement comme indiqué ci-dessous. Après le lavage final, renverser la plaque et sécher les puits en tapant la plaque sur du papier absorbant. Les plaques peuvent être lavées manuellement comme suit : a. Vider le contenu de la plaque. b. Taper les puits sur du papier absorbant. c. Remplir chaque puits avec à 3µL de tampon de lavage en utilisant une pipette multicanaux. d. Agiter doucement la plaque sur une surface plane. e. Répéter les étapes a à d fois. f. Répéter a et b. 3. Dépôt du conjugué Déposer µl de conjugué dans chaque puits, essuyer le dessus des puits avec un tissu pour éliminer les éclaboussures. Note : Afin d éviter les contaminations, ne jamais remettre l excès de conjugué dans le flacon d origine. Incuber à température ambiante pendant 3 minutes. 4. Lavage Répéter l étape.. Addition du substrat TMB Déposer μl de substrat TMB dans chaque puits, essuyer le dessus des puits avec un tissu pour éliminer les éclaboussures. Note : Afin d éviter les contaminations, ne jamais remettre l excès de TMB dans le flacon d origine. Incuber 3 minutes à température ambiante dans l obscurité. 6. Arrêt de la réaction Déposer µl de solution d arrêt dans chaque puits. Ceci induit un changement de couleur du bleu au jaune. 7. Mesure de la densité optique La densité optique (DO) de chaque puits doit être lue à 4nm à l aide d un lecteur de plaques dans les 3 minutes suivant l arrêt de la réaction. Note : Cf. paragraphe de la section 8 ci-dessous. 8 RESULTATS ET CONTROLE DE QUALITE. Paramètres de lecture Ce test est particulièrement sensible. Pour mesurer de façon fiable des échantillons bas, il est conseillé de ne pas soustraire les DO du blanc aux résultats. De plus, les densités optiques doivent être lues à 4nm sans utiliser un filtre de référence.. Contrôle de qualité Pour valider le test, tous les critères suivants doivent être respectés : Les calibrateurs et les contrôles doivent être inclus dans chaque test. Les valeurs des contrôles doivent être dans les gammes spécifiées sur le certificat de contrôle de qualité. La forme de la courbe doit être similaire à la courbe de calibration présentée dans le certificat de contrôle de qualité. Si les critères ci-dessus ne sont pas respectés, le test est invalide et doit être répété. 4. Courbe de calibration La courbe de calibration peut être tracée de façon automatique ou manuelle en plaçant la DO moyenne à 4nm (échelle linéaire) sur l axe des Y et les concentrations de chaque calibrateur en anticorps anti-toxine diphtérique (échelle logarithmique) sur l axe des X. Automatique utiliser un logiciel validé approprié et une courbe qui suit les données. Manuelle utiliser du papier graphique log/lineaire ; tracer une courbe qui passe par les points (pas une droite ni une courbe point à point).. Traitement des points anormaux Si seul un point n est pas sur la courbe, il peut être supprimé. Si en l absence de ce point, la courbe a une forme différente de celle du certificat de contrôle de qualité ou si plusieurs points ne sont pas sur la courbe, le test doit être répété. 6. Calcul des valeurs de contrôle Lire la concentration en autoanticorps anti-toxine diphtérique de chaque contrôle à partir de la courbe de calibration. Les valeurs des contrôles doivent être comprises dans les limites indiquées sur le certificat de contrôle qualité. 7. Calcul des concentrations d autoanticorps dans les échantillons dilués Lire la concentration en autoanticorps anti-toxine diphtérique des échantillons dilués directement à partir de la courbe de calibration. Note : Les valeurs des calibrateurs ont été ajustées par un facteur pour tenir compte de la dilution de l échantillon au /. Aucune autre conversion n est requise. 8. Calibration du test Le test est calibré en UI/mL par rapport à la préparation de référence NIBSC /496 contenant de l antitoxine diphtérique. 9. Limites Les échantillons pré et post vaccination doivent être traités simultanément. Ce coffret peut être utilisé pour une aide au diagnostic d immunodéficience. Les résultats doivent être confirmés par l observation clinique et d autres tests sérologiques. Les résultats obtenus avec ce coffret ne peuvent être considérés comme une preuve diagnostique du manque ou pas de protection contre la diphtérie ou d immunodéficience ou non. 9 TAUX PROTECTEURS Le taux d anticorps protecteurs chez la population normale est suivant les sources de, à, UI/mL. Le guide issu du WHO recommande une protection minimum de, UI/mL d anti-toxine diphtérique. Un taux de, UI/mL est souhaitable pour une protection individuelle. Compte tenu de la variation des taux, il est recommandé aux laboratoires d établir leur propre gamme de référence. VALEURS ATTENDUES Le taux d anti-toxine diphtérique IgG a été mesuré dans 8 sérums de donneurs adultes de sang (dont la vaccination et l état immunitaire sont inconnus). Les résultats sont indiqués ci-dessous, ils ne sont fournis qu à titre indicatif et ne doivent pas être utilisés pour établir des normales. 3 PERFORMANCES Anti-toxine diphtérique UI/mL. PRECISION La précision intra- et inter-essai ont été déterminées en utilisant trois échantillons inclus dans la gamme de mesure. La concentration et le % C.V. pour chaque échantillon sont donnés ci-dessous : PRECISION INTRA-ESSAI n=6 Concentration (UI/mL) % C.V. Echantillon,9 6, Echantillon,46 6, Echantillon 3,6 4, PRECISION INTER-ESSAI n=3 Concentration (UI/mL) % C.V. Echantillon 4,4 7, Echantillon,4 4, Echantillon 6,73,8 3. Calcul des densités optiques moyennes (pour des tests réalisés en double) Pour chaque calibrateur, contrôle et échantillon, calculer la moyenne des DO du duplicat. Le coefficient de variation (CV en %) pour chaque duplicat doit être inférieur à %. Insert Code: E4, Version th January, Page 7 of

8 VCA UI/mL Autre EIA UI/mL. CORRELATION Contre un autre coffret EIA d anti-toxine diphtérique sur 8 sérums.. y =,96x +,86 R =,9 Anti-toxoide diftérico IgG Kit Inmunoenzimático Para uso diagnóstico in-vitro Código producto: MK4... Binding Site EIA UI/mL Contre le «Vero Cell Assay» (VCA).sur sérums INTERFERENCES Différentes substances interférentes ont été ajoutées à des échantillons positifs ou négatifs et testés. La technique utilisée pour vérifier ces substances est le test japonaise : Interference Check A plus - Kokusai Shiyaku. Substance Bilirubine libre Bilirubine conjuguée Hémoglobine hémolysée Chyle Aucune interférence n a été observée. Concentration 8,mg/dL,6mg/dL 48mg/dL 473 unités.4 SENSIBILITE ANALYTIQUE La sensibilité a été déterminée par la concentration moyenne obtenue par tests sur le diluant de l échantillon. Elle est de,6 UI/mL.. GAMME DE MESURE La gamme de mesure de ce test est de 3,-,4 UI/mL basée sur les 7 calibrateurs. REFERENCES y =,7336x +,868 R =, Binding Site EIA UI/mL. Pilars CE and Spiess H. (98). Diphtherie- und Tetanusantikorper bei Kindern und jungen Erwachsenen. Dtsch med Waschr, 6: Booy R et al. (99). Immunogenicity of combined diphtheria, tetanus and pertussis vaccine given at, 3 and 4 months versus 3, and 9 months of age. The Lancet, 339(879): Maple PA et al. (99). Diphtheria immunity in UK blood donors. The Lancet, 34: Melville-Smith M. Diphtheria and tetanus antitoxins. ELISA In the clinical microbiology laboratory, Editors Wreghitt TG and Morgan-Capner P, Published by the UK Public Health Laboratory Service.. WHO meeting report. (99) The Control of Diphtheria in Europe. WHO ref: EUR/ICP/EPI 4. Fabricado por: The Binding Site Group Ltd, PO Box 7, Birmingham B4 4ZB, U.K. The Binding Site Spain S.L.U., C/ Balmes 43 4º 3ª, 86 Barcelona Teléfono 977 Fax: info@bindingsite.es web: UTILIZACIÓN Este kit está preparado para la medición in vitro de anticuerpos anti-toxoide diftérico IgG específicos presentes en el suero, con el fin de determinar el estado de protección pre- y post-vacunación. Se suministra material suficiente para analizar un máximo de 39 muestras en duplicado o bien 87 en un único ensayo, con una curva de calibración de siete puntos y dos controles. Los siete puntos de calibración pueden reducirse a cinco si no se requieren mediciones por debajo de.37 UI/mL. GENERALIDADES Los anticuerpos anti-toxoide diftérico aumentan en respuesta a la vacunación con la proteína toxoide diftérica. La respuesta del paciente a la inmunización puede ser, por tanto, comprobada mediante la determinación serológica del nivel de anticuerpos anti-toxoide diftérico utilizando este enzimoinmunoensayo cuantitativo. Se ha de tener en cuenta que el método de referencia, especialmente en Europa, es el ensayo Vero Cell (VCA). Dicho ensayo proporciona una medida de la cantidad de anticuerpo neutralizante de todos los tipos de inmunoglobulinas, no solo de IgG. Históricamente las comparativas de kits comerciales ELISA y el ensayo Vero Cell han mostrado correlaciones pobres, ya que el ELISA puede detectar una proporción de anticuerpos específicos que no neutraliza el toxoide diftérico que no puede neutralizar el toxoide diftérico. El ensayo utiliza la vacuna diftérica para sensibilizar la placa, por lo que ofrece una medida de los anticuerpos IgG producidos en respuesta a la vacunación. 3 PRINCIPIO DEL MÉTODO Los pocillos se encuentran sensibilizados con el antígeno toxoide diftérico. Los calibradores, controles y muestras diluidas de pacientes se añaden a los pocillos y los anticuerpos que reconocen el antígeno toxoide diftérico se unen durante la primera incubación. Tras el lavado de los pocillos para eliminar las proteínas no unidas, se añade un conjugado de conejo purificado anti-igg (específico de cadena ) humana marcado con peroxidasa. El conjugado se une al anticuerpo humano capturado y el exceso de conjugado no unido se elimina mediante un lavado posterior. El conjugado unido se visualiza con el sustrato 3,3,, tetrametilbenzidina (TMB) que da un producto de color azul cuya intensidad es proporcional a la concentración de anticuerpo en la muestra. Se añade ácido fosfórico a cada pocillo para parar la reacción, lo que produce un color amarillo final que se lee a 4nm. 4 PRECAUCIONES 4. AVISOS Insert Code: E4, Version th January, Page 8 of Los sueros humanos suministrados en el kit han sido sometidos a screening para donantes, resultando negativos a la presencia del antígeno de superficie de la hepatitis B y a la presencia de los anticuerpos de la ante los virus HIV, HIV y HCV. Las técnicas usadas están aprobadas por la FDA (USA) o para el diagnóstico in vitro por la UE (Directiva 98/79/EC, Anexo II). Sin embargo los sobredichos ensayos no garantizan la ausencia de agentes infecciosos. Por lo tanto, deben tratarse los reactivos como potencialmente infecciosos. Tanto la manipulación como los métodos de eliminación de desechos deberán realizarse conforme a la normativa de materiales infecciosos y solo personal adecuadamente instruido deberá efectuar el test. Los componentes del kit contienen azida sódica y ProClin 3 y debe ser manipulados con precaución; use guantes y vestuario protector adecuado en todo momento al manipular este producto. No trague ni permita el contacto con la piel o las mucosas (especilamente si hay heridas). En caso de contacto, lave con abundante agua y consulte a un médico. Con el plomo y el cobre pueden formarse azidas metálicas explosivas. Cuando se elimine el reactivo, lave con mucha agua los recipientes para evitar la acumulación de azida. Los tampones y sueros suministrados con este kit contienen diferentes inhibidores enzimáticos según sigue. Son productos peligrosos y se deben manipular con precaución. INHIBIDOR CONCENTRACIÓN Kathon,% Azida sódica,99% ProClin 3,4% Bromonitrodioxano,% Metilisotiazona,% ProClin es marca de of Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA

9 Kathon es un producto irritante y puede producir sensibilización en contacto con la piel. La solución de parada contiene ácido fosfórico 3M. Es irritante y debe evitarse el contacto con la piel y ojos. Los métodos de eliminación de desechos deberán realizarse conforme a la normativa local de materiales infecciosos. 4. ADVERTENCIAS Este producto debe ser utilizado únicamente por personas correctamente entrenadas. Se recomienda seguir el protocolo de forma estricta. Cualquier desviación puede afectar a la funcionalidad de este sensible ensayo. Si como consecuencia se obtienen lecturas de densidades ópticas inferiores, la sensibilidad del ensayo puede quedar comprometida. Ponga especial atención a los avisos y Notas que encontrará en estas instrucciones de uso. NO se pueden intercambiar reactivos de distintos lotes. Si se ha de realizar un elevado número de ensayos, se debe asegurar que todos los reactivos sean del MISMO lote. Deben tomarse todas las tiras del mismo envoltorio. La sustitución de cualquier componente puede conducir a resultados erróneos. Utilice únicamente material plástico o de vidrio limpio. Nunca devuelva reactivos no utilizados a los viales. No deje viales de reactivo abiertos; cualquier posible contaminación o evaporación dará resultados inconsistentes. El sustrato TMB no debe se expuesto a la luz o al agua. Muestras hemolizadas, lipémicas, con material particulado o contaminación microbiana no deben ser utilizadas. No se puede comprobar una posible dilución de muestra incorrecta ya que los controles están listos para su uso. Se recomienda la utilización de pipetas calibradas y muestras CQ internas apropiadas. Al usar sistemas de ensayo automatizados, diluyentes de muestra y otros equipos automáticos, siga con atención las instrucciones del fabricante. Se debe tener especial cuidado con la configuración e instalación del equipo y la conexión a servicios externos. Se deben seguir con atención todos los parámetros de los lectores y de los aclaradores automáticos y seguir las instrucciones del fabricante para el mantenimiento del equipo. 4.3 CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD El kit debe conservarse a -8ºC y no debe congelarse. Temperaturas de conservación no adecuadas afectarán a los resultados. El tampón de lavado diluido en una botella limpia puede conservarse a temperatura ambiente durante un máximo de 4 semanas. La fecha de caducidad de este kit se muestra en la etiqueta exterior. OBTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS Las muestras de sangre se han de obtener por punción en vena, dejar que coagule de modo natural y separar el suero. El suero puede conservarse a -8ºC hasta 48 horas, o a -ºC sin diluir para periodos superiores. Evitar congelaciones y descongelaciones repetidas. Las muestras de suero no deben ser inactivadas por calor ya que esto puede ocasionar resultados falsos positivos. 6 MATERIALES 6. MATERIAL SUMINISTRADO 6.. Hoja de instrucciones: Indica todos los detalles del ensayo. 6.. Certificado QC: Indica la funcionalidad esperada del lote Diphtheria Toxoid Coated Wells (Pocillos sensibilizados con Toxoide diftérico): tiras de 8 pocillos separables, sensibilizados con toxoide diftérico de Corynebacterium diphtheriae. La placa se suministra en una bolsa que puede volver a cerrarse y que contiene dos bolsas de desecante Sample Diluent (Diluyente de muestra): botellas con ml de tampón para dilución de la muestra. Listo para uso. Coloreado en amarillo. 6.. Wash Buffer (Tampón de lavado): botella con ml de tampón concentrado veces para el lavado de los pocillos Diphtheria Toxoid IgG Calibrators (Calibradores de Toxoide Diftérico IgG): 7 viales cada uno con,ml de suero humano diluido, con las siguientes concentraciones de anticuerpo anti-toxoide diftérico: 3; ;,333;,;,37;, y,4 UI/mL. Listo para uso Diphtheria Toxoid IgG High Control (Control elevado Toxoide Diftérico IgG): vial con,ml de suero humano diluido con anticuerpos antitoxoide diftérico. El valor esperado se indica en el certificado QC. Listo para uso Diphtheria Toxoid IgG Low Control (Control bajo Toxoide Diftérico IgG): vial con,ml de suero humano diluido con anticuerpos anti-toxoide diftérico. El valor esperado se indica en el certificado QC. Listo para uso Diphtheria Toxoid IgG Conjugate (Conjugado Toxoide Diftérico IgG): vial con ml de anticuerpo humano purificado IgG marcado con peroxidasa. Color rojo. Listo para uso. 6.. TMB Substrate (SustratoTMB): botella con 4mL de sustrato TMB. Listo para uso. 6.. Stop Solution (Solución de parada): botella con 4mL de ácido fosfórico 3M. Listo para uso. 6. MATERIAL ADICIONAL Y EQUIPO NO SUMINISTRADO 6.. Lavador automático de microplacas: Su uso es recomendable, aunque las placas pueden lavarse manualmente. 6.. Lector de microplacas: Capaz de medir densidades ópticas a 4nm en referencia al aire Agua destilada o desionizada: Ha de ser de la calidad más alta disponible Micropipetas calibradas: Para dispensar, y µl. 6.. Pipeta multicanal: Recomendada para dispensar volúmenes de µl de conjugado, solución sustrato y solución de parada Tubos de vidrio/plástico: Para dilución de la muestra. 7 METODOLOGÍA DE ENSAYO 7. PASOS PRE-ENSAYO. Lleve el kit a temperatura ambiente Los kits están diseñados para su uso a temperatura ambiente (-4 C). Retire el kit de la cámara frigorífica y déjelo a temperatura ambiente durante aproximadamente 6 minutos. Los pocillos no deben sacarse de su envoltorio hasta que hayan alcanzado la temperatura ambiente. Nota: los kits pueden mantenerse a temperatura ambiente hasta una semana. Insert Code: E4, Version th January, Page 9 of. Componentes del kit Mezcle cuidadosamente cada componente del kit antes de su uso. 3. Dilución del tampón de lavado Añada ml del tampón de lavado concentrado a 9mL de agua destilada (dilución a ) en un recipiente limpio y mezcle. Pueden prepararse volúmenes más pequeños diluyendo adecuadamente. Nota: El tampón de lavado diluido puede conservarse a temperatura ambiente hasta 4 semanas, por tanto diluya únicamente la cantidad necesaria. 4. Dilución de la muestra Diluya µl de cada muestra con µl de diluyente de muestra (:) y mezcle bien. Nota: La muestra diluida debe utilizarse dentro de las 8 horas siguientes a la dilución.. Manipulación de tira y marco Coloque el número de pocillos necesarios en el soporte de las tiras. Posicione a partir del pocillo A, rellenando las columnas de izquierda a derecha a través de la placa. Cuando manipule la placa, apriete los largos bordes del marco para evitar que los pocillos caigan fuera. Nota: Vuelva a colocar inmediatamente los pocillos no utilizados en su envoltorio junto a las dos bolsitas de desecante, y séllelo fuertemente para minimizar su exposición a la humedad. Tenga cuidado de no perforar o rasgar el envoltorio, ver más abajo. ATENCIÓN: La exposición de los pocillos a la humedad o a contaminación por polvo u otro material particulado provocará la degradación del antígeno, dando como resultado una pobre precisión del método y potencialmente resultados falsos. 7. METODOLOGÍA DE ENSAYO Mantenga la misma secuencia de dispensación durante todo el proceso.. Adición de la muestra Dispense µl de cada calibrador, control y muestra diluida (:) en los pocillos adecuados de la placa. Nota: Las muestras deben añadirse lo más rápidamente posible a la placa para minimizar la deriva del ensayo, y conectar el timer tras la adición de la última muestra. Incube a temperatura ambiente durante 3 minutos.. Lavado El procedimiento de lavado es crítico y requiere una atención especial. Un lavado inadecuado de la placa dará resultados inexactos, con una pobre precisión y fondos elevados. Tras la incubación retire la placa y lave 3 veces con -3µL de tampón de lavado por pocillo. Puede lavar la placa tanto con un lavador de placas automático o manualmente como se indica a continuación. Después del último lavado automático, invierta la placa y golpee los pocillos sobre papel secante. Las placas pueden lavarse de modo manual como sigue: a. Sacuda el contenido de la placa en un fregadero b. Golpee los pocillos sobre papel secante c. Pipetee -3µL de tampón de lavado en cada pocillo con una pipeta multicanal d. Agite la placa suavemente en una superficie plana e. Repita a-d dos veces. f. Repita a y b. 3. Adición del conjugado Dispense µl de conjugado en cada pocillo, seque la parte superior de los pocillos con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras. Nota: No devuelva cantidades que sobren de conjugado al vial original del reactivo, con el fin de evitar su contaminación. Incube a temperatura ambiente durante 3 minutos. 4. Lavado Repita el paso.. Adición del sustrato (TMB) Dispense µl de sustrato TMB en cada pocillo, seque la parte superior de los pocillos con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras. Nota: Nunca devuelva cantidades sobrantes de TMB a la botella de reactivo, para evitar su contaminación. Incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 3 minutos. 6. Parada Dispense µl de solución de parada en cada pocillo. De este modo se produce un cambio de color de azul a amarillo. 7. Medición de la densidad óptica Lea la densidad óptica (OD) de cada pocillo a 4nm en un lector de microplacas, dentro de los 3 minutos siguientes a la parada de la reacción. Nota: vea el punto en la sección 8 a continuación. 8 RESULTADOS Y CONTROL DE CALIDAD. Ajustes del lector Este es un ensayo particularmente sensible. Es recomendable que, para medir muestras bajas con precisión, no se sustraigan las lecturas de OD del blanco de los resultados. Además las densidades ópticas deben leerse a 4nm sin utilizar filtro de referencia.. Control de calidad Para que un ensayo sea válido se han de cumplir los siguientes requisitos: Se han de incluir controles y calibradores en cada ensayo. El valor obtenido para cada control ha de entrar en el rango especificado en el certificado QC. Si estos requisitos no se cumplen el ensayo no es válido y debe repetirse. La forma de la curva ha de ser similar a la curva de calibración que se muestra en el certificado QC.

10 Nº.muestras VCA UI/mL EIA Alternativo UI/mL 3. Cálculo de densidades ópticas medias (Solo para ensayos que se lleven a cabo en duplicado) Calcule la media de DO de las lecturas duplicadas para cada calibrador, control y muestra. El %CV para cada duplicado de DO ha de ser menor al %. 4. Trazado de la curva de calibración Se puede trazar la curva de calibración de modo manual o automático, con los valores de concentración de anticuerpo anti-toxoide diftérico en la escala log frente a la DO en la escala lineal, para cada calibrador: Automático utilice un software adecuado y validado y el ajuste de curva que mejor se adapte a los datos. Manual utilice papel gráfico log/lineal y dibuje una suave curva a través de los puntos (no una línea recta o punto a punto).. Tratamiento de puntos anómalos Si alguno de los puntos no entra en la curva, puede eliminarse. Si la ausencia de dicho punto implica que la forma de la curva es distinta a la curva de calibración de muestra, o más de un punto parece ser anómalo, el ensayo debe repetirse. 6. Cálculo de los valores de control Lea el nivel de anticuerpo anti-toxoide diftérico directamente de la curva de calibración. El valor debe entrar dentro del rango indicado en el certificado QC. 7. Cálculo del nivel de anticuerpo en las muestras diluidas Lea el nivel de anticuerpos anti-toxoide diftérico en las muestras diluidas directamente de la curva de calibración. Nota: Los valores de calibrador han sido ajustados en un factor de para tener en cuenta la dilución de la muestra :. Por tanto, no hace falta ninguna corrección posterior. 8. Calibración del ensayo El ensayo se encuentra calibrado frente a la preparación de referencia de antitoxina diftérica NIBSC //496. Los resultados se indican en UI/mL. 9. Limitaciones Se deben ensayar simultáneamente las muestras pre- y post-vacunación. Este kit puede utilizarse como ayuda en el diagnóstico de inmunodeficiencia. Los resultados deben confirmarse mediante otros resultados serológicos y la historia clínica del paciente. Los resultados de este ensayo no son una prueba diagnóstica de la falta de protección frente a la difteria o de la presencia o ausencia de inmunodeficiencia. 9 NIVELES DE PROTECCIÓN En la bibliografía se indica que el nivel protector de anticuerpo en la población normal está entre, y, UI/mL -4. La guía de la OMS indica que se considera que el nivel mínimo protector de antitoxina diftérica en una muestra de suero es de,ui/ml, y que el nivel de, UI/mL es deseable para una protección individual. Dado los amplios rangos indicados, se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios rangos normales de protección. VALORES TÍPICOS Se midieron los niveles de anticuerpos anti-toxoide diftérico IgG en sueros de 8 donantes de sangre adultos normales, cuyo estado de vacunación e inmunización era desconocido. Los resultados indicados a continuación son únicamente ilustrativos y no deben utilizarse para calcular un rango de normalidad. 3. CORRELACIÓN Se ensayaron 8 muestras frente a un kit EIA anti-toxoide diftérico alternativo... y =.96x +.86 R =.9.. Binding Site EIA UI/mL Se ensayaron muestras frente al ensayo Vero Cell (VCA) y =.7336x R = EIA Binding Site UI/mL.3 SUSTANCIAS INTERFERENTES Se añadió una serie de sustancias interferentes a una muestra elevada y otra baja de anti-difteria, y se analizaron posteriormente. El método utilizado para comprobar dichas sustancias se basó en el kit Interference Check A plus - Kokusai Shiyaku, Japón. Sustancia Bilirrubina F (libre) Bilirrubina C (Conjugada) Hemoglobina hemolizada Quilo Concentración 8,mg/dL,6mg/dL 48mg/dL 473 Unidades No se observaron interferencias en ninguna de las muestras ensayadas..4 SENSIBILIDAD ANALÍTICA Se determinó la sensibilidad como la concentración media obtenida por ensayos del diluyente de muestra. El resultado es,6 UI/mL.. RANGO DE MEDIDA El rango de medida del ensayo es 3,-,4 UI/mL, basándose en los 7 calibradores. REFERENCIAS Anti-toxoide diftérico UI/mL. Pilars CE and Spiess H. (98). Diphtherie- und Tetanusantikorper bei Kindern und jungen Erwachsenen. Dtsch med Waschr, 6: Booy R et al. (99). Immunogenicity of combined diphtheria, tetanus and pertussis vaccine given at, 3 and 4 months versus 3, and 9 months of age. The Lancet, 339(879): Maple PA et al. (99). Diphtheria immunity in UK blood donors. The Lancet, 34: Melville-Smith M. Diphtheria and tetanus antitoxins. ELISA In the clinical microbiology laboratory, Editors Wreghitt TG and Morgan-Capner P, Published by the UK Public Health Laboratory Service.. WHO meeting report. (99) The Control of Diphtheria in Europe. WHO ref: EUR/ICP/EPI 4. CARACTERÍSTICAS DEL ENSAYO. PRECISIÓN Se midió la precisión intra- e inter-ensayo utilizando 3 muestras en el rango de la curva de calibración. Se muestra a continuación la concentración y %CV para cada una: PRECISIÓN INTRA-ENSAYO n=6 Concentración (UI/mL) % CV Muestra,9 6, Muestra,46 6, Muestra 3,6 4, PRECISIÓN INTER-ENSAYO n=3 Concentración (UI/mL) % C.V. Muestra 4,4 7, Muestra,4 4, Muestra 6,73,8 Insert Code: E4, Version th January, Page of