Listeria monocytogenes - vermittelter Gentransfer in vitro und in vivo

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1 Listeria monocytogenes - vermittelter Gentransfer in vitro und in vivo Von der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von Marc Hense aus Warstein

2 Inhaltsverzeichnis ' Einleitung Virale Vektoren Liposomen und andere synthetische Konjugate Nackte DNA Bakterien in der Gentherapie Listeria monocytogenes als Vektor Listerien für die somatische Gentherapie Die Gattung Listeria Das murine Listeria-Infektionsmodell Der Infektionszyklus von Listeria monocytogenes Zielsetzung der Arbeit Material und Methoden Geräte und Laborgegenstände Chemikalien Allgemein verwendete Puffer Organismen Bakterien Verwendete Escherichia coli (E. coli) Stämme Verwendete Listeria monocytogenes (X. monocytogenes) Stämme Eukaryotische Zellen Mäuse Kulturmedien Kulturmedien für Bakterien Kulturmedien für E. coli Stämme Kulturmedien für L. monocytogenes Stämme Kulturmedien für eukaryotische Zellen Antibiotika Arbeiten mit E. coli Kultivierung von E. coli Stämmen Langzeitlagerung von E. coli Stämmen Transformation von E. coli Stämmen Herstellung elektrokompetenter Zellen Elektrotransformation Herstellung CaCh-kompetenter Zellen CaCh-Transformation Nachweis von ß-Galaktosidase Arbeiten mit L. monocytogenes Kultivierung von L. monocytogenes Stämmen Langzeitlagerung von L. monocytogenes Stämmen Transformation von L. monocytogenes Stämmen Herstellung elektrokompetenter Zellen Elektrotransformation Standardisierung des Bakterienwachstums Nachweis von ß-Galaktosidase Arbeiten mit eukaryotischen Zellen Kulturbedingungen Ablösen adhärent wachsender Zellen

3 2.8.3 Zellzahlbestimmung Langzeitlagerung von Zellen Auftauen von Zellen CaPO 4 -Transfektion Nachweis von ß-Galaktosidase Molekularbiologische Methoden Agarosegelelektrophorese Isolierung von Nukleinsäuren Isolierung von Plasmid-DNA Isolierung von DNA aus Agarosegelen Isolierung von chromosomaler DNA Isolierung von RNA Präzipitation von Nukleinsäuren Ethanolpräzipitation Ethanol/Lithiumpräzipitation Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Photometrische Bestimmung Intensitätsvergleich mit Marker-DNA Modifikation von Nukleinsäuren Restriktionsanalyse von DNA Iigation von DNA Modifikation von Restriktionsschnittstellen Phenolextraktion Nachweis von spezifischen Nukleinsäuresequenzen Southern Blotting Radioaktive Markierung von Sonden Polymerase Ketten Reaktion (PCR) RT-PCR DNAse-Behandlung von RNA Reverse Transkription PCR Kolonie-PCR ß-Galaktosidase PCR CMV-Promotor PCR Sequenzierung von DNA Biochemische Methoden Biosynthetische Markierung von Proteinen Immunpräzipitation SDS-Gelelektrophorese optische Nachweismethoden GFP-Fluoreszenz-Mikroskopie Immunfluoreszenz-Mikroskopie Immunologische Methoden "enzyme-linked immunosorbent assay" (ELJSA) Durchfluß-Zytometrie Herstellung der Zellsuspension Durchführung der Zellfärbung 42 2: Messung am FACScan Zelluläre Assays Radioaktive Markierung von proliferierenden Zellen 43

4 Gewinnung von Milzzellen In vitro ReStimulierung von Milzzellen Zytotoxischer T-Zellassay Helfer-T-ZeUassay In vitro Infektion _ Standard-Zell-Infektionsprotokoll für L. monocytogenes Bestimmung intrazellulärer Bakterienzahlen In vivo Infektionsmodell Haltung der Mäuse Maus-Injektionen Organgewinnung Passagieren von Bakterien Histologie Fixierung von Organen Gefrierschnitte ß-Galaktosidase Färbung von Gefrierschnitten Haematologie Zytospin 47 3 Ergebnisse Etablierung eines in vitro Transfektionsmodells Konstruktion und Charakterisierung der Plasmide Konstruktion des Shuttle-Plasmids perl-3cmvß und seiner Derivate Konstruktion des Shuttle-Plasmids perl-3cmvgfp Analyse der Shuttle-Plasmide in Eukaryoten Prokaryotische Expressionsplasmide Vergleich der Expression von eukaryotischen und prokaryotischen Expressionsplasmiden in Prokaryoten Standardisierung des Bakterienwachstums Etablierung eines in vitro Infektions-Transfektions-Systems Intrazelluläres Wachstumsverhalten Nachweise eukaryotischer Expression der Reporterproteine Vergleichende in vitro Studien mit Reportergenexprimierenden Bakterien Spleißing als Nachweis eukaryotischer Expression Tetrazyklin unabhängige Expression Etablierung stabiler Transfektanten Zellspezifität der Bakterien-vermittelten Transfektion Durchflußzytometrischer Vergleich eukaryotischer und prokaryotischer Expression von GFP Analyse des Transfektionsvorganges Versuche mit isolierter DNA Analyse mit Mutanten Versuche mit der MnlAB2 Mutante Versuche mit L. innocua Versuche mit der AactA2AplcB2 Mutante Versuche mit der Ahly2 Mutante Versuche mit der Ahly2AplcB2AplcA2 Mutante Etablierung eines in vivo Transfektionsmodells LDso-Bestimmung rekombinanter Stämme 76

5 3.2.2 Plasmidstabilität Wachstumsverhalten der Bakterien in der Leber Immunantwort des Wirtes gegen den Vektor Immunantwort nach einmaliger Infektion Reinfektion Antikörper-Antwort In vivo Gentransfer ß-Galaktosidase als Reportergen GFP als Reportergen Versuche mit dem Wildtyp Versuche mit der L. monocytogenes Ahly2 Mutante Versuche mit der L. monocytogenes AactA2AplcB2 Mutante Depletion von Neutrophilen Funktionalität des Antikörpers RB6-8C i. p. Infektionsmodell i. v. Infektionsmodell In vivo Gentransfer nach Antikörper-Depletion Diskussion In vitro Gentransfer mit L. monocytogenes Evidenzen für erfolgreichen Transfer in vitro Transfer-Effizienz Mechanismus des Gentransfers In vivo Gentransfer mit L. monocytogenes In vivo Gentransfer mit verschiedenen Mutanten Antikörper-vermittelte Neutrophilen-Depletion in vivo Alternative Ansätze für ein auf L. monocytogenes basierendes Gentransfermodell Zusammenfassende Beurteilung von L. monocytogenes als Vektor für die somatische Gentherapie Zusammenfassung Abkürzungen Literatur 113

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