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1 Inhalt 1 Was ist denn Molekularbiologie, bitteschön? Das Substrat der Molekularbiologie, oder: Molli-World für Anfänger Was brauche ich zum Arbeiten? Sicherheit im Labor Einige grundlegende Methoden Nucleinsäure ist gleich Nucleinsäure und auch wieder nicht Methoden zur DNA-Präparation Bakterienmedien Präparation von Plasmid-DNA Minipräparation Maxipräparation Präparation von Phagen-DNA Präparation einzelsträngiger DNA mittels Helferphagen Präparation von genomischer DNA Die Reinigung von Nucleinsäuren Phenol-Chloroform-Extraktion Anionenaustauschersäulen Glasmilch / Silica-Membranen Cäsiumchlorid-Dichtegradient Fällung mit PEG Dialyse Magnetic Beads Proteinbindende Filtermembranen Alkohol-Fällung Konzentratoren Exonuclease-Phosphatase-Verdau Konzentrieren von Nucleinsäuren Alkohol-Fällung Konzentratoren Speed-vac Aussalzen Konzentrationsbestimmung von Nucleinsäurelösungen Das Werkzeug Restriktionsenzyme Gele Agarosegele

2 X Inhalt DNA-Fragmente aus Agarosegelen isolieren Polyacrylamidgele (PA-Gele) DNA-Fragmente aus PA-Gelen isolieren Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) Kapillarelektrophorese Mikrochip-Kapillarelektrophorese Blotten Southern Blot Northern Blot Dot und Slot Blot Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die Standard-PCR Neue Entwicklungen Tipps zur Verbesserung der PCR Nested PCR Multiplex PCR Amplifikation langer DNA-Fragmente (> 5kb) PCR-Anwendungen Reverse Transkription - Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) Rapid Amplification of cdna Ends (RACE) Amplifikation zufälliger Produkte Klassische quantitative PCR Real-time quantitative PCR Inverse PCR Biotin-RAGE und Supported PCR Mutagenese mit modifizierten Primern Amplification Refractory Mutation System (ARMS) in-situ-pcr Cycle Sequencing cdna-synthese Einzelzell-PCR RNA Methoden der RNA-Isolierung Methoden der mrna-isolierung Reverse Transkription (cdna-synthese) In-vitro-Transkription (RNA-Synthese) Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) RNA-Interferenz (RNAi)

3 Inhalt XI 6 Die Klonierung von DNA-Fragmenten Die Grundlagen des Klonierens Klonieren von PCR-Produkten Klonieren mit Rekombinase-Systemen Mit welchen Vektoren klonieren? Plasmide Phagen Cosmide PACs und BACs YACs Welche Bakterien? Herstellen kompetenter Zellen und Transformation Probleme beim Klonieren Die Lagerung von Klonen Wie man DNA aufspürt Herstellung von Sonden Methoden zur Herstellung markierter Sonden Hybridisierung Nachweis der markierten DNA Autoradiographie Nicht-radioaktive Nachweismethoden Screenen von rekombinanten DNA-Banken Two-hybrid system Phage display DNA-Analyse Sequenzierung Radioaktive Sequenzierung Nicht-radioaktive Sequenzierung, automatische Sequenziergeräte Schrotschuss-Sequenzierung Kurioses zum Thema Sequenzieren: Octamere Minisequenzierung Pyrosequenzierung zum Ersten Pyrosequenzierung zum Zweiten Weitere Methoden der Massen-Parallelsequenzierung Die Zukunft der Sequenzierung Methoden zur Analyse von DNA auf Mutationen Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) Single-strand conformation polymorphism (SSCP)

4 XII Inhalt Denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE) Temporal temperature gradient electrophoresis (TTGE) Heteroduplexanalyse (HA) Amplification refractory mutation system (ARMS) Enzymatische Spaltung von Fehlpaarungen (EMC) Protein truncation test (PTT) Untersuchung der Funktion von DNA-Sequenzen Untersuchung der Transkription in Geweben Ribonuclease protection assay (RPA) Real-time quantitative PCR (RTQ-PCR) in-situ-hybridisierung Chromosomale Lokalisierung eines Gens (FISH) in-situ-pcr Microarrays Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Mutagenese in-vitro-translation Expressionssysteme Bakterielle Expressionssysteme Baculovirus-Expressionssysteme Weitere Expressionssysteme Heterologe Expression in Säugerzellen Transfektionsmethoden Kotransfektion mehrerer Gene Transiente und stabile Transfektionen Reportergene Transgene Mäuse Methoden des Gentransfers Regulation der Transgenexpression Das Tet-System Das Ecdyson-System Gentherapie Genomik Tipps für die Karriereplanung, oder: Der ganz kleine Macchiavelli für Jungforscher Zu guter Letzt

5 Inhalt XIII 12 Anhang Nützliche Tabellen Standardlösungen Glossar Wer, was, wo? Lieferanten / Adressen Literatur Register

6

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