Gebrauchsanleitung. IFU 0006DE, rev 6, copyright, Oktober 2014, Epigenomics AG M Epigenomics AG, Berlin, Deutschland

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1 Bitte diese Gebrauchsanleitung vor Gebrauch des Tests aufmerksam lesen und genauestens befolgen, um die Zuverlässigkeit der Testergebnisse sicher zu stellen. IFU 0006DE, rev 6, copyright, Oktober 2014, Epigenomics AG M Epigenomics AG, Berlin, Deutschland

2 Inhalt 1. Wichtige Hinweise Verwendungszweck Erläuterung des Testverfahrens Technologische Grundlagen des Testverfahrens Reagenzien Benötigte, aber nicht mitgelieferte Instrumente, Verbrauchsmaterialien und Reagenzien Warnhinweise Lagerung und Stabilität Testreagenzien und deren Vorbereitung für die Benutzung Testverfahren Vorbereitung der Reagenzien und der PCR-Reaktion Real-time PCR Geräteeinstellungen und Rohdatenprozessierung Auswertung der Daten Verfahren zur Qualitätskontrolle Externe Kontrollen Interne Kontrollen Interpretation der Ergebnisse Validität von Epi prolung BL Assay Testansätzen und Testläufen Validität einzelner Patientenproben Auswertung der Ergebnisse valider Testläufe und Patientenproben Interpretation der Ergebnisse valider Patientenproben Grenzen des Verfahrens Spezifische Leistungsdaten Analytische Leistungsfähigkeit Reproduzierbarkeit Kreuzreaktionen und interferierende Substanzen Klinische Leistungsfähigkeit Referenzen Kontaktinformation Page 2 of 18

3 1. Wichtige Hinweise Wichtig: Vor der Benutzung des Epi prolung BL real-time PCR-Kits sollten sich Anwender mit den Kitbestandteilen sowie den Anweisungen in dieser Gebrauchsanleitung vertraut machen. Bedeutung der verwendeten Symbole: Bitte Gebrauchsanleitung beachten Artikelnummer Für diagnostische in vitro Untersuchungen Chargennummer Verfallsdatum Hersteller Lagertemperatur Inhalt ausreichend für x Tests Page 3 of 18

4 2. Verwendungszweck Der Epi prolung BL real-time PCR-Kit ist ein in vitro Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Assay für die qualitative Detektion der Methylierung des SHOX2-Gens in Bisulfit-konvertierter DNA, die aus Saccomanno-fixierten humanen Bronchiallavage-Proben von Patienten gewonnen wurde, bei denen erstmalig eine Bronchoskopie wegen des Verdachts auf Lungenkrebs durchgeführt wurde. Das Testergebnis kann, zusätzlich zu vorhandenen klinischen und pathologischen Informationen, zur Unterstützung bei der Diagnose von Lungenkrebs hinzugezogen werden. 3. Erläuterung des Testverfahrens Lungenkrebs ist die zweithäufigste Krebsart bei Männern und Frauen und stellt ca. 15 % aller Krebsdiagnosen dar [1]. Aufgrund des Fehlens effektiver Vorsorgeuntersuchungen wird Lungenkrebs bei Patienten häufig erst mit dem Auftreten von verdächtigen Krankheitssymptomen oder zufällig durch bildgebende Verfahren diagnostiziert. Patienten mit Verdacht auf eine bösartige Lungenerkrankung werden in der Regel intensiven klinischen Untersuchungen, wie Thorax-CT und Bronchoskopie, unterzogen. Letztere ist die Methode der Wahl für die Bestätigung der Diagnose bei Verdacht auf einen Lungentumor, indem Gewebe oder eine zytologische Probe während der Bronchoskopie gewonnen und anschließend pathologisch bewertet wird. Die Prävalenz für Lungenkrebs in der Gruppe von Patienten mit Krebsverdacht liegt bei ungefähr %. Die Erstellung einer endgültigen Diagnose nach der ersten Bronchoskopie ist bei ungefähr der Hälfte dieser Patienten nicht möglich [2], was zusätzliche invasive diagnostische Untersuchungen notwendig macht. Selbst wenn die Anzeichen, Symptome und radiologischen Befunde so ausfallen, dass eine Diagnose einer malignen Lungenerkrankung offensichtlich erscheint, sind aufwendige invasive Methoden zur Gewinnung von Gewebe nötig, welches für eine endgültige Bestätigung des Vorhandenseins einer malignen Erkrankung geeignet ist. Die Methylierung der DNA ist ein wichtiger epigenetischer Prozess, der an grundlegenden biologischen Prozessen, wie Entwicklung und Zelldifferenzierung, beteiligt ist [3]. Aberrante DNA- Methylierung spielt eine wichtige Rolle bei der Krebsentstehung [4]. Epigenetische Veränderungen in den Methylierungsmustern bestimmter Gene wurden in verschiedenen Krebstypen identifiziert. So korreliert im Falle von Lungenkrebs eine erhöhte Methylierung des SHOX2 (short stature homeobox 2) Genlocus in bronchialen Flüssigkeiten, die während der Bronchoskopie gewonnen wurden, mit dem Vorhandensein einer malignen Lungenerkrankung [5]. Die Bestimmung der relativen DNA- Methylierung des SHOX2 Genlocus ist nach der Extraktion, Bisulfit-Konvertierung und Aufreinigung der DNA aus Bronchiallavage-Proben möglich. Mit dem Epi prolung BL real-time PCR-Kit wird die relative DNA-Methylierung des SHOX2 Genlocus in einem Hintergrund aus unmethylierter DNA in einem real-time PCR Assay auf der Basis der TaqMan -Technologie bestimmt. Relativ quantitative Werte des SHOX2-Methylierungsstatus aus der real-time PCR werden anschließend anhand eines Schwellenwertes in die qualitativen Testergebnisse Test positiv oder Test negativ dichotomisiert. Das Ergebnis des Epi prolung BL real-time PCR-Kit soll der Unterstützung bei der Diagnose von Lungenkrebs und als Ergänzung zu anderen diagnostischen Methoden dienen, insbesondere, wenn die Diagnose mit diesen Methoden nicht möglich oder unschlüssig ist. Der Test soll die Diagnose Page 4 of 18

5 einer malignen Lungenerkrankung und die Entscheidungsfindung des Arztes zur Abklärung eines Verdachts auf Lungenkrebs unterstützen. 4. Technologische Grundlagen des Testverfahrens Das Epi prolung BL real-time PCR-Kit kombiniert HeavyMethyl TM, TaqMan Technologien und DDCT Auswertung für die Bestimmung der relativen SHOX2 DNA-Methylierung in einer Patientenprobe. Das Epi prolung BL real-time PCR-Kit detektiert zwei unabhängige Genbereiche gleichzeitig in einer einzigen real-time-pcr. Die Referenzreaktion ist eine methylierungsunspezifische PCR für die Quantifizierung der eingesetzten Gesamt-DNA-Menge basierend auf dem Beta-Actin Gen (ACTB). Die Marker-Reaktion ist eine methylierungsspezifische HeavyMethyl TM -PCR zur Quantifizierung der DNA- Methylierung des SHOX2 Genlocus. Die HeavyMethyl TM -Technologie basiert auf der Amplifikation von Bisulfit-behandelter DNA unter Verwendung methylierungsunspezifischer Primer in Verbindung mit methylierungsspezifischen blockierenden Oligonukleotiden, was eine sensitive und spezifische Amplifikation methylierter DNA ermöglicht [6]. Die Detektion der Amplifikation erfolgt mit TaqMan -Sonden. In TaqMan real-time PCR Assays wird die Anzahl der PCR-Zyklen, die nötig ist, um ein Fluoreszenzsignal über dem Hintergrundsignal zu erhalten, als Maß für die Anzahl der vorhandenen Zielmoleküle zu Beginn der Reaktion verwendet. Der Grenzwert, bei dem ein Signal über dem Hintergrundsignal detektiert wird, wird als Cycle Threshold (CT) bezeichnet. Für die Epi prolung BL real-time PCR werden DCT-Werte als die Differenz zwischen der methylierungsspezifischen SHOX2-PCR und der methylierungsunspezifischen Referenz-PCR für Beta-Actin der gleichen Probe in einer Reaktion (Duplex-Assay), ermittelt. Dieser DCT-Wert stellt einen quantitativen Wert für den Grad der Methylierung des SHOX2-Genlocus dar. Der durchschnittliche DCT-Wert einer Patientenprobe wird über den durchschnittlichen DCT-Wert einer Kalibratorprobe normalisiert (Differenz der DCT Werte = DDCT- Wert) [7,8]. Der Kalibrator ist eine DNA-Probe mit definiertem relativem Methylierungsgrad des SHOX2- Genlocus. Kleine Abweichungen in Probenmessungen aufgrund von Variationen in der PCR werden durch Verrechnen der Probendaten mit den Kalibratormessungen gemäß der DDCT-Methode (siehe oben) normalisiert. 5. Reagenzien Das Kit enthält die benötigten Reagenzien für 24 Bestimmungen (Patientenproben, Kontrollen und Kalibrator). Das Kit enthält ausreichend Material um 72 PCR Reaktionen durchzuführen. Zusätzlich zu den Patientenproben muss bei jeder PCR-Untersuchung eine Epi prolung BL Positive Control, eine Epi prolung BL Negative Control und ein Epi prolung BL Calibrator mit analysiert werden. Jede Kontrolle, der Kalibrator und die Patientenprobe müssen jeweils als dreifach PCR-Bestimmung untersucht werden: Epi prolung BL Master Mix: 3 Reaktionsgefäße mit je 330 µl, gebrauchsfertig Epi prolung BL Calibrator: 3 Reaktionsgefäße mit je 40 µl, gebrauchsfertig Die Konzentration der DNA des Epi prolung BL Calibrator ist auf einen bestimmten Wert eingestellt. Dieser basiert auf UV-Quantifizierung. Page 5 of 18

6 6. Benötigte, aber nicht mitgelieferte Instrumente, Verbrauchsmaterialien und Reagenzien 7. Warnhinweise Pipetten für Volumina von 0,5 10 μl (Eppendorf AG, oder gleichwertig) Pipettenspitzen mit Filter (z.b. VWR International GmbH , KOEHK-0518, , oder gleichwertig) Multipette Plus (Eppendorf AG, Katalog Nr , oder gleichwertig) Combitips plus 0,5 ml (Eppendorf AG, Katalog Nr , oder gleichwertig) Minishaker MS 2 (Carl Roth GmbH, Katalog Nr. L302.1), Vortex (VWR International GmbH, Katalog Nr ), oder gleichwertig Zentrifuge 5810 (Eppendorf AG) oder Zentrifuge Sigma 4-15C (Qiagen) geeignet für PCR Platten, oder gleichwertig Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System mit 7500 Software v2.0 (Life Technologies Co., Katalog Nr oder ) oder mit Software Version SDS v CFR Part 11 Module (Life Technologies Co., catalogue no ). MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0,1 ml (Applied Biosystems, Katalog Nr ) MicroAmp 96- & 384-Well Optical Adhesive Film (Applied Biosystems, Katalog Nr ). Einmalhandschuhe Dieses Produkt enthält keine gesundheitsgefährdenden oder gefährlichen Inhaltsstoffe. Immer Laborkittel und Einmalhandschuhe tragen. Zur Reinigung kontaminierter Oberflächen Wasser benutzen. 8. Lagerung und Stabilität -15 C Das Epi prolung BL real-time PCR-Kit wird auf Trockeneis versendet. -25 C Epi prolung BL real-time PCR-Kit nach Erhalt bei -25 C bis -15 C lagern. Die Reagenzien des Epi prolung BL real-time PCR-Kit sind bis zum angegebenen Verfallsdatum stabil, wenn sie gemäß Anweisung gelagert und gehandhabt werden. Verwenden Sie kein Material nach Ablauf des Verfallsdatums. Verwenden Sie keine Komponenten aus unterschiedlichen Herstellungschargen des Epi prolung BL real-time PCR-Kit! Page 6 of 18

7 9. Testreagenzien und deren Vorbereitung für die Benutzung PCR-Läufe bzw. Proben-Sets bestehen aus Patientenproben, die zusammen mit einer Epi prolung BL Positive Control und einer Epi prolung BL Negative Control untersucht werden (aus Epi prolung BL Work Flow Kontroll-Kit, M ). Jede Kontrolle und jede Patientenprobe wird als Dreifachbestimmung gemessen. Jeder PCR-Lauf beinhaltet eine Epi prolung BL Calibrator Probe, ebenfalls als Dreifachbestimmung, zur Sicherstellung der Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Läufen. Das Epi prolung BL real-time PCR-Kit enthält genügend Reagenzien um drei PCR-Läufe mit je sechs Patientenproben, einer Epi prolung BL Positive Control, einer Epi prolung BL Negative Control und einem Epi prolung BL Calibrator durchzuführen. Alternativ können mit einem Epi prolung BL Kit maximal 22 Patientenproben, eine Epi prolung BL Positive Control, eine Epi prolung BL Negative Control und ein Epi prolung BL Calibrator in einem Ansatz untersucht werden. Das Epi prolung BL real-time PCR-Kit wurde entwickelt und validiert für die Verwendung mit Bisulfitkonvertierter DNA aus Saccomanno-fixierten Bronchiallavage-Proben, die mit Hilfe des Epi prolung BL DNA Präparations-Kits (M ) hergestellt wurde. Bisulfit-konvertierte DNA kann bis zu 24 Stunden bei 2 C bis 8 C oder bis zu 14 Tage bei -25 C bis -15 C gelagert werden. 10. Testverfahren Zur Sicherstellung korrekter Ergebnisse muss jede Bisulfit-konvertierte DNA (Patienten-Proben oder Epi prolung BL Positive/Negative Control) als Dreifachbestimmung getestet werden Vorbereitung der Reagenzien und der PCR-Reaktion Die Vorbereitung der Reagenzien und das PCR Setup sollten getrennt von der Probenvorbereitung erfolgen. 1. Tauen Sie die gewünschte Anzahl Epi prolung BL Master Mix (MM) und Epi prolung BL Calibrator Probe (CAL) auf und warten Sie, bis die Reagenzien Raumtemperatur (18 C bis 25 C) erreicht haben. Nach dem Auftauen für 5 sec auf dem Vortex mischen und kurz zentrifugieren um Tropfen vom Deckel zu entfernen. Hinweis: Verwenden Sie Epi prolung BL Master Mix und Epi prolung BL Calibrator unmittelbar nach der Äquilibrierung auf Raumtemperatur! Ein Gefäß Epi prolung BL Calibrator ist ausreichend für einen PCR-Lauf und ein Gefäß Epi prolung BL Master Mix ist ausreichend für 30 Reaktionen. 2. Nutzen Sie immer die empfohlenen 96-well-Platten zusammen mit den oben genannten optischen Klebefolien (optical adhesive film) zum Versiegeln der Platten. 3. Empfohlene Belegung der 96-well-Platte: Nutzen Sie die Positionen A1-A3 für Epi prolung BL Calibrator Proben, A4-A6 für Epi prolung BL Positive Control und A7-A9 für Epi prolung BL Negative Control. Tabelle 1 zeigt ein Beispiel für einen PCR-Lauf bei maximaler Probenanzahl (22 Patientenproben, eine Epi prolung BL Positive Control und eine Epi prolung BL Negative Control). Zwischen 1 und 22 Patientenproben plus einer Epi prolung BL Negative Control, einer Epi prolung BL Positive Control und einer Epi prolung BL Calibrator Probe können gleichzeitig in einem PCR-Lauf gemessen werden. Page 7 of 18

8 Tabelle 1: Beispiel für die empfohlene Plattenbelegung. CAL: Epi prolung BL Calibrator-Probe; S: Patientenprobe; PC und NC: Epi prolung BL Positive und Negative Control des Epi prolung BL Work Flow Kontroll-Kits A CAL CAL CAL PC PC PC NC NC NC B S1 S1 S1 S2 S2 S2 S3 S3 S3 S4 S4 S4 C S5 S5 S5 S6 S6 S6 S7 S7 S7 S8 S8 S8 D S9 S9 S9 S10 S10 S10 S11 S11 S11 S12 S12 S12 E S13 S13 S13 S14 S14 S14 S15 S15 S15 S16 S16 S16 F S17 S17 S17 S18 S18 S18 S19 S19 S19 S20 S20 S20 G S21 S21 S21 S22 S22 S H Vorbereitung der PCR-Platten: Geben Sie 10 µl Epi prolung BL Master Mix in jede zu verwendende Vertiefung der PCR Platte. Geben Sie 10 µl Epi prolung BL Calibrator (CAL) in jede für Calibrator ( CAL ) vorgesehene Vertiefung der PCR Platte. Geben Sie 10 µl Bisulfit-konvertierte und gereinigte Epi prolung BL Positive Control DNA in die für Positivkontrollen (PC) vorgesehenen Vertiefungen der PCR Platte. Geben Sie 10 µl Bisulfit-konvertierte und gereinigte Epi prolung BL Negative Control DNA in die für Negativkontrollen (NC) vorgesehenen Vertiefungen der PCR Platte. Geben Sie 10 µl Bisulfit-konvertierte und gereinigte Patienten-DNA in die für Patientenproben (S) vorgesehenen Vertiefungen der PCR Platte. 2. Verschließen Sie die Platte mit der vorgesehenen Folie (optical adhesive film). 3. Zentrifugieren Sie die PCR-Platte für 1 min bei 2000 ± 100 x g in einer Plattenzentrifuge. Fahren Sie fort mit der Vorbereitung des real-time PCR-Geräts. Die PCR-Platte kann bis zu 1 h bei 2 C bis 8 C im Dunkeln gelagert werden. Hinweise: Es wird empfohlen nur die Proben innerhalb eines PCR-Laufs zu analysieren, die auch innerhalb einer Proben-Präparation prozessiert wurden. Neben dem benötigten Material für Proben, Epi prolung BL Calibrator und Epi prolung BL Work Flow-Kontrollen, enthält jedes Gefäß von Epi prolung BL Master Mix genügend zusätzliches Material für die Durchführung von 3 zusätzlichen Kontrollreaktionen, z.b. PCR-Kontrollen ohne Template, wenn nötig. Page 8 of 18

9 10.2. Real-time PCR Geräteeinstellungen und Rohdatenprozessierung Die folgenden Einstellungen beziehen sich auf das Applied Biosystems 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument, mit der Softwareversionen SDS v CFR Part 11 Module und 7500 Software v2.0. Einzelheiten zu Programmeinstellungen, Benennung der Proben, etc. sind in der Bedienungsanleitung der entsprechenden Software beschrieben. Wählen Sie die folgenden Detektoren/Targets, Reporter/Dyes und Quencher: Tabelle 2: Detektor/Dye Einstellungen für Epi prolung BL real-time PCR Detektor / Target Name Reporter / Dye Einstellung Quencher Einstellung SHOX2 FAM keine ACTB JOE keine Reference dye ROX keine Definieren Sie das Temperaturprofil, wie nachfolgend dargestellt: Table 3: Einstellungen des Temperaturprofils für die Epi prolung BL real-time PCR Stage Step Temperature ( C) Time (min) Cycles Ramp rate : % : % data collection :15 75 % Sample volume 20 µl Definieren Sie die Probennamen wie folgt: Tabelle 4: Probennamen für die Epi prolung BL real-time PCR Art der Probe Name/Bezeichnung Patientenprobe Laborspezifische Bezeichnung BL Positive Control PC BL Negative Control NC BL Calibrator CAL Auswertung der Daten Die folgenden Einstellungen gelten für die Softwareversionen SDS v CFR Part 11 Module und 7500 Software v2.0. Einzelheiten zum Ändern der Analyseeinstellungen, der Datenextraktion usw. sind in den Bedienungsanleitungen der entsprechenden Software beschrieben. 1. Schließen Sie leere Wells der PCR-Platte und solche, die nicht ausgewertet werden sollen, von der Analyse aus. 2. Verwenden Sie die folgenden Werte für threshold und baseline (Tabelle 5) Page 9 of 18

10 Tabelle 5: Einstellungen für die Auswertung der Epi prolung BL real-time PCR Target Threshold Baseline Start Baseline End ACTB SHOX Verfahren zur Qualitätskontrolle Externe Kontrollen Das Epi prolung BL Work Flow Kontroll-Kit (M ) enthält Epi prolung BL Positive Control und Epi prolung BL Negative Control. Diese Kontrollen müssen innerhalb jeder unabhängigen Patientenproben-Präparation unter Verwendung des Epi prolung BL DNA Präparations-Kit (M ) prozessiert und in jedem PCR-Lauf mit Epi prolung BL real-time PCR-Kit (M ) gemessen werden, um die korrekte Ausführung des kompletten Arbeitsablaufs zu überwachen und die Validität der Testergebnisse zu gewährleisten. Die CT-Werte der Epi prolung BL Positive / Negative Control müssen innerhalb der Validitätsgrenzen liegen, die in Tabelle 6 spezifiziert sind. Wenn eine Kontrolle außerhalb ihres Validitätsbereiches liegt, sind die dazugehörigen Testergebnisse invalide und dürfen nicht verwendet werden. Sämtliche Patientenproben des entsprechenden Testansatzes müssen nochmals gemessen werden. Wenn Ihre Laborqualitätsvorschriften einen häufigeren Einsatz von Kontrollen vorschreiben, folgen Sie diesen Vorschriften Interne Kontrollen Der Referenzassay detektiert ACTB (Actin-beta) DNA und erlaubt somit eine Beurteilung der Menge an amplifizierbarer DNA in jeder Patientenprobe. Dieser Assay bestimmt, ob die Proben-Präparation genügend DNA in ausreichender Konzentration und Qualität ergeben hat und wird für die Berechnung des DCT-Wertes verwendet. Der CT-Wert der ACTB-PCR für eine valide Probe muss 29 sein. CT-Werte > 29 bei der ACTB-PCR weisen auf eine zu geringe DNA-Konzentration oder eine Inhibition der PCR hin, was zu falsch-negativen Ergebnissen führen kann. 12. Interpretation der Ergebnisse Dieser Abschnitt beschreibt die Auswertung der real-time PCR-Daten des Epi prolung BL real-time PCR-Kit. Die Analyse basiert auf cycle threshold Werten (CT) des ACTB- und des m SHOX2-Assays und wird in einzelne Schritte untergliedert: 1. Interpretation der CT-Werte von Epi prolung BL Calibrator, Epi prolung BL Negative und Positive Control zur Validierung des Testansatzes / PCR-Laufs. 2. Ausschluss einzelner Proben mit niedriger DNA-Konzentration gemäß den CT-Werten des ACTB- Assays. 3. Berechnung der DCT- und DDCT-Werte für jede Probe. 4. Interpretation der DDCT-Werte. Page 10 of 18

11 12.1. Validität von Epi prolung BL Assay Testansätzen und Testläufen Jeder PCR-Lauf oder Testansatz (ein oder mehr Patientenproben prozessiert zusammen mit Epi prolung BL Positive Control und Epi prolung BL Negative Control) wird als valide betrachtet, wenn die Kriterien in Tabelle 6 für Epi prolung BL Work Flow-Kontrollen und Epi prolung BL Calibrator Proben innerhalb der spezifizierten Validitätsbereiche liegen. Sollte eine Epi prolung BL Calibrator Probe außerhalb des vorgegebenen Bereichs sein, muss der PCR-Lauf wiederholt werden. Tabelle 6: Validitätsgrenzen für Epi prolung BL Positive und Negative Control und Epi prolung BL Calibrator. Kontrolle m SHOX2 Ergebnis 1 ACTB Ergebnis 2 DCT Ergebnis 3 Epi prolung BL Negative Control 2 oder 3 von 3 Replikaten CT* 38 2 oder 3 von 3 Replikaten CT* NA Epi prolung BL Positive Control CT*s (alle Replikate) 37 CT*s (alle Replikate) 31 NA Epi prolung BL Calibrator NA CT*s (alle Replikate) 32 1 Methylierung des SHOX2 Gens, 2 Beta-Actin DNA, 3 DCT = CT[mSHOX2] CT[ACTB], *Cycle Threshold DCT (alle Replikate) -2.6 bis Validität einzelner Patientenproben Die Ergebnisse einzelner Proben sind valide, wenn der Lauf valide ist (gemäß 12.1) und die in Tabelle 7 aufgeführten Kriterien für die Dreifachbestimmungen der Proben erfüllt sind. Invalide Proben dürfen nicht für die weitere Analyse der Daten verwendet werden. Tabelle 7: Kriterien für die Validität der Proben basierend auf den CT-Werten der ACTB-PCR. Proben Replikate ACTB Ergebnis Validität der Probe 2 oder 3 von 3 CT 29 valide 2 oder 3 von 3 CT > 29 invalide Page 11 of 18

12 12.3. Auswertung der Ergebnisse valider Testläufe und Patientenproben DDCT-Werte der Proben werden gemäß der folgenden Methode berechnet: 1. Ersetzen aller CT-Werte, die durch die Software (Versionen SDS v CFR Part 11 Module oder 7500 Software v2.0) als leeres Feld oder als Undetermined angegeben sind, durch den numerischen CT-Wert 40 (entspricht der maximalen Anzahl von Zyklen). 2. Berechnung des DCT für jedes der drei validen Epi prolung BL Calibrator (CAL) Replikate entsprechend der folgenden Formel: DCT CAL = CT[SHOX2 CAL ] CT[ACTB CAL ] 3. Berechnung des Mittelwerts der drei validen Epi prolung BL Calibrator DCT CAL -Werte definiert als M(DCT CAL ): M(DCT CAL ) = (DCT CAL,1 + DCT CAL,2 + DCT CAL,3 ) / 3 4. Berechnung des DCT für jedes der zwei oder drei Proben-Replikate (mit CT[ACTB] 29) entsprechend der folgenden Formel (i: Proben-Replikate 1 bis 3): DCT Probe,i = CT[SHOX2 Probe,i ] CT[ACTB Probe,i ] 5. Berechnen Sie den Mittelwert der DCT Probe -Werte der zwei bzw. drei validen Proben-Replikate definiert als M(DCT Probe ): M(DCT Probe ) = (DCT Probe,1 + DCT Probe,2 ) / 2 oder M(DCT Probe ) = (DCT Probe,1 + DCT Probe,2 + DCT Probe,3 ) / 3 6. Berechnung des DDCT für jede Probenmessung entsprechend der folgenden Formel: DDCT Probe = M(DCT Probe ) M(DCT CAL ) Page 12 of 18

13 12.4. Interpretation der Ergebnisse valider Patientenproben Die Interpretation des Testergebnisses einer einzelnen Patientenprobe basierend auf DDCT Probe erfolgt entsprechend Tabelle 8. Tabelle 8: Interpretation der Testergebnisse basierend auf den DDCT Probe -Werten. DDCT Probe BL Positive Control, BL Negative Control, BL Calibrator Validität der Probe CT[ACTB] 29 Interpretation 9.5 valide valide positiv > 9.5 valide valide negativ 13. Grenzen des Verfahrens Dieses Produkt ist nur für den Einsatz mit Bisulfit-konvertierter DNA validiert, welche aus Saccomanno-fixierter Bronchiallavage unter Verwendung des Epi prolung BL DNA Präparations-Kits (M ) gewonnen wurde. Diese Produkt muss durch Personal mit Erfahrung in molekularbiologischen Techniken, insbesondere von real-time PCR, gehandhabt werden. Die allgemeinen Empfehlungen zur Organisation und Verfahrensanweisungen des Labors, um DNA- Kontaminationen zu vermeiden, müssen befolgt werden. Um Verschleppungseffekte zwischen Patientenproben zu vermeiden, wird die Benutzung von Einmalpipetten und -pipettenspitzen empfohlen. Alle Testergebnisse des Epi prolung BL real-time PCR-Kits müssen im Zusammenhang mit dem klinischen Hintergrund des Patienten, epidemiologischen Daten und anderen verfügbaren Informationen betrachtet werden. 14. Spezifische Leistungsdaten Die Leistungsdaten wurden für den Epi prolung BL Reflex Assay, bestehend aus den drei Produkten Epi prolung BL DNA Präparations-Kit (M ), Epi prolung BL real-time PCR-Kit (M ) and Epi prolung BL Work Flow Kontroll-Kit (M ), evaluiert Analytische Leistungsfähigkeit Die Quantifizierungsgrenze des Epi prolung BL Reflex Assay wurde durch die Analyse von drei verschiedenen Mischungen (0.1 %, 0.8 %, 1.6 %) künstlich methylierter DNA in DNA aus peripheren Blutlymphozyten (PBL) bestimmt. Jede Mischung wurde seriell auf vier Konzentrationen verdünnt. Jede Verdünnung wurde viermal in unabhängigen Reaktionen mit dem Epi prolung BL DNA Präparations-Kit prozessiert. Die Quantifizierungsgrenze war die niedrigste Konzentration, bei der der Test bei der Analyse mit dem Epi prolung BL real-time PCR-Kit stabile DDCT-Werte für jede einzelne Mischung ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengefasst. Page 13 of 18

14 Tabelle 9: Quantifizierungsgrenze. Zur Bestimmung der Quantifizierungsgrenze wurden DNA Mischungen aus künstlich methylierter DNA und DNA aus PBL analysiert. Analyt Quantifizierungsgrenze (Gesamt-DNA) Quantifizierungsgrenze (methylierte DNA) DNA Mischung ng 0.31 ng Reproduzierbarkeit Die Reproduzierbarkeit des Epi prolung BL Reflex Assay wurde durch die Analyse von drei verschiedenen Pools aus frischen, maximal 14 Tage bei Umgebungstemperatur gelagerten Bronchiallavage- Proben (Pool 1 3) und drei verschiedenen Mischungen aus künstlich methylierter DNA (0.1 %, 0.8 %, 1.6 %) in PBL DNA validiert. Die Pools wurden aus individuellen Proben zusammengestellt, so dass sie Methylierungsniveaus über (negativ, Pool 1) und unter (positiv, Pool 2 und 3) dem Schwellenwert von 9.5 (entsprechend Tabelle 8) ergaben. Jeder Bronchiallavage-Pool, jede Mischung und Kontrollen des Epi prolung BL Work Flow Kontroll-Kits wurden in drei Replikaten und in neun getrennten Ansätzen mit dem Epi prolung BL DNA Präparations-Kit prozessiert. Jeder Ansatz wurde mit dem Epi prolung BL real-time PCR-Kit analysiert. In jedem Test-Ansatz wurden unterschiedliche Chargen Epi prolung BL DNA Präparations-Kit, Epi prolung BL Work Flow Kontroll-Kit und Epi prolung BL real-time PCR-Kit kombiniert. Als zusätzliche Quelle für Variabilität erfolgte die Prozessierung der Ansätze durch drei verschiedene Laborassistenten, auf drei verschiedenen real-time PCR-Geräten und an verschiedenen Tagen. Die Ergebnisse der Studien sind in Tabelle 10 und Tabelle 11 zusammengefasst. Tabelle 10: Reproduzierbarkeit von Probenmessungen. MW: Mittelwert, SD: Standardabweichung, %CV: Variationskoeffizient Name MW DDCT SD Min Max %CV Pool 1 13,02 1,44 11,54 19,02 11,06 Pool 2 7,86 0,29 7,23 8,58 3,69 Pool 3 5,48 0,25 5,14 6,01 4,56 Mischung (0,1 %) 10,98 0,45 10,01 11,72 4,10 Mischung (0,8 %) 8,15 0,30 7,63 8,78 3,68 Mischung (1,6 %) 6,85 0,27 6,32 7,54 3,94 Tabelle 11: Reproduzierbarkeit von Kontrollmessungen. MW: Mittelwert, SD: Standardabweichung, %CV: Variationskoeffizient Name MW CT[ACTB] SD CT[ACTB] %CV [ACTB] MW CT[SHOX2] SD CT[SHOX2] %CV [SHOX2] BL Positive Control BL Negative Control 26,39 0,29 1,14 31,89 1,01 3,18 31,01 0,36 1,56 39,99 0,34 0,84 Page 14 of 18

15 14.3. Kreuzreaktionen und interferierende Substanzen Kreuzreaktivität des Epi prolung BL Reflex Assay wurde durch die Analyse von Epi prolung BL Work Flow Kontrollen untersucht, die zusätzlich mit DNA aus solchen Bakterien versetzt waren, die häufig in den Atemwegen von Patienten mit einer Lungenerkrankung vorkommen. Folgende Organismen wurden untersucht und hatten keinen Einfluss auf die Leistungsfähigkeit des Tests: Mycobacterium sp., Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa und Chlamydophila pneumoniae. Die Leistungsfähigkeit des Epi prolung BL Reflex Assay wurde auch in der Anwesenheit verschiedener Substanzen evaluiert, die häufig in Proben von Patienten mit Symptomen einer Lungenerkrankung vorkommen. Zwei Pools von Bronchiallavage-Proben wurden mit potentiell interferierenden Substanzen versetzt. Die folgenden Substanzen wurden untersucht und hatten keinen Einfluss auf die Leitungsfähigkeit des Tests: Hämoglobin (50 µg/ml), Glucocorticoid (300 µg/l), Salbutamolsulfat (400 µg/l), unkonvertierter (nicht Bisulfit-behandelter) genomischer DNA (1 µg), Mucin (2,5 µg/ml) und Tabakrauchkondensat Klinische Leistungsfähigkeit Die klinische Leistungsfähigkeit des Epi prolung BL real-time PCR-Kit wurde mit dem Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System in einer retrospektiven Fall-Kontroll-Studie untersucht. Die Studie beinhaltete Proben von Patienten mit bestätigtem Lungenkrebs aller Typen (Fälle) und Proben von Patienten mit gutartiger Lungenerkrankung (Kontrollen). Bisulfit-konvertierte DNA wurde aus 250 Saccomanno-fixierten Bronchiallavage-Proben einzelner Patienten mit Hilfe des Epi prolung BL DNA Präparations-Kit hergestellt und konvertierte DNA mit Epi prolung BL real-time PCR-Kit analysiert. Von 79 Patienten mit gutartiger Lungenerkrankung (Kontrollen) mit validen Messungen wurden 75 Proben mit einem SHOX2 DDCT > 9,5 bestimmt (Test negativ), was eine klinische Spezifität von 95 % ergab (95 % Konfidenzintervall [88 %; 99 %]). Von 75 Proben mit der Diagnose Lungenkrebs (Fälle) mit validen Messungen wurden 61 Proben mit einem SHOX2 DDCT 9,5 bestimmt (Test positiv). Dies ergab eine klinische Sensitivität von 81 % (95 % Konfidenzintervall [71 %; 89 %]). Tabelle 12 fasst die Ergebnisse zusammen. Tabelle 12: Klinische Leistungsfähigkeit des Epi prolung BL Reflex Assay Kontrollen gesamt Fälle gesamt Fälle NOS* Fälle NSCLC Fälle SCLC Anzahl der Proben Valide Ergebnisse** Test positiv Test negativ *) Krebstyp nicht weiter spezifiziert (not otherwise specified). **) Die Bestimmung der klinischen Sensitivität und Spezifität erforderte Proben mit finaler klinischer Diagnose. Der Anteil invalider Ergebnisse aufgrund geringen DNA-Gehalts in diesen langzeitgelagerten Proben ist signifikant höher als in frischen Probenpopulationen (Validitätsrate größer als 90 %), wie in der Bedienungsanleitung vorgegeben. Page 15 of 18

16 Abbildung 1 zeigt die ROC (Receiver Operating Characteristic) Analyse für die klinische Leistungsfähigkeit in Abhängigkeit vom Schwellenwert. Abbildung 1: ROC Analyse. Rote Linien zeigen die Sensitivität und Spezifität am Schwellenwert DDCT 9,5 Page 16 of 18

17 15. Referenzen 1. Jemal, Siegel, Ward, Hao, Xu, Murray and Thun. Cancer Statistics, CA Cancer J Clin, 58:71-96 (2008) 2. Roth K, Hardie JA, Andreassen AH, Leh F, Eagan TM. Predictors of diagnostic yield in bronchoscopy: a retrospective cohort study comparing different combinations of sampling techniques. BMC Pulm Med, 8:2 (2008) 3. Robertson KD. DNA methylation and human disease. Nat Rev Genet, 6: (2005) 4. Ting AH, McGarvey KM, Baylin SB. The cancer epigenome components and functional correlates. Genes Dev, 20: (2006) 5. Schmidt B, Liebenberg V, Dietrich D, Schlegel T, Kneip C, Seegebarth A, Seemann S, Distler J, Tetzner R, Weickmann S, Wille U, Liloglou T, Walshaw M, Fleischhacker M, Witt C, Field JK. SHOX2 DNA Methylation for the Diagnosis of Lung Cancer Based on Bronchial Aspirates. Manuscript submitted (2010) 6. Cottrell SE, Distler J, Goodman NS, et al. A real-time PCR assay for DNA-methylation using methylation-specific blockers. Nucleic Acids Res, 32:e10 (2004) 7. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 25:402-8 (2001) 8. Winer J, Jung CK, Shackel I, Williams PM. Development and validation of real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction for monitoring gene expression in cardiac myocytes in vitro. Anal Biochem, 270:41-9 (1999) 16. Kontaktinformation Das Epi prolung BL real-time PCR-Kit wird hergestellt von: Epigenomics AG Geneststrasse Berlin, Deutschland Für weitere Informationen und Hilfestellungen senden Sie bitte eine an: support@products.epigenomics.com oder rufen unter folgender Telefonnummer an: Page 17 of 18

18 Informationen für den Käufer Durch den Kauf dieses Produktes erhält der Käufer unter gewissen Roche Patenten die Erlaubnis, es für Dienstleistungen im Bereich der in vitro Diagnose beim Menschen einzusetzen. Es wird hiermit kein allgemeines Patentlizenzrecht oder ein Lizenzrecht irgendeiner Art außer diesem speziellen, sich aus dem Kauf ergebenden Recht, das Produkt zu benutzen, gewährt. Applied Biosystems und MicroAmp sind eingetragene Warenzeichen der Life Technologies Corporation. Multipette und Combitips eingetragene Warenzeichen der Eppendorf AG. TaqMan ist ein eingetragenes Warenzeichen von Roche Molecular Systems, Inc. HeavyMethyl TM ist ein Warenzeichen der Epigenomics AG. Page 18 of 18

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