RESOLUTION OIV-OENO

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1 RESOLUTION OIV-OENO MOLEKULARBIOLOGISCHE VERFAHREN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON SACCHAROMYCES CEREVISIAE-WEINHEFEN UND ANDEREN BEI DER WEINBEREITUNG VORKOMMENDEN HEFEARTEN DIE GENERALVERSAMMLUNG, in Anbetracht von Artikel 2 Absatz 2 Ziffer iv des Übereinkommens vom 3. April 2001 zur Gründung der Internationalen Organisation für Rebe und Wein, auf Vorschlag der Sachverständigengruppe Mikrobiologie, BESCHLIESST, nachfolgende Verfahren zur Identifizierung von Saccharomyces cerevisiae-weinhefen und anderen önologisch bedeutsamen Hefearten zu verabschieden. BESCHLIESST, nachfolgendes Vorwort in das Dokument Molekularbiologische Verfahren zur Bestimmung von Saccharomyces cerevisiae-weinhefen und anderen bei der Weinbereitung vorkommenden Hefearten und das Dokument Molekularbiologische Verfahren zur Bestimmung von Milchsäurebakterien auf Trauben und im Wein [OENO MICRO ] einzufügen. Vorwort [zu OENO MICRO und OENO MICRO ] Ursprung, Entwicklung, Änderungen und Abfolge der verschiedenen Hefearten können durch spezifische molekularbiologische Techniken verfolgt werden, die eine Differenzierung und Typisierung von Hefestämmen ermöglichen. Für mikrobiologische Untersuchungen bei der Weinbereitung wurden in letzter Zeit verschiedene Techniken eingesetzt. Es handelt sich um empfindliche und spezifische Methoden, entsprechend dem jeweiligen Nachweisbedarf. Diese Methoden sind einfach, schnell, reproduzierbar, wirksam, zuverlässig und nicht kostspielig. Molekularbiologische Techniken für Identifizierungen können ohne vorherige Kultivierung, oder nach Anreicherung, oder auch nach Isolierung der Mikroorganismen durchgeführt werden. Sie ermöglichen eine bessere Kenntnis des Mikrobensystems, das sich an der Oberfläche von Trauben oder im Wein entwickelt. Ziel dieses Leitfadens ist es, Laboratorien bei mikrobiologischen Analysen zur Identifizierung von Saccharomyces cerevisiae-hefen oder anderen önologisch bedeutsamen Hefen [Oeno MICRo ] sowie bei der Identifizierung von Milchsäurebakterien auf Trauben und im Wein [Oeno MICRO ] zu unterstützen. Es wird auf die wesentlichen Anwendungen verfügbarer molekularbiologischer Techniken eingegangen. Auf die detaillierten Methoden wird im Literaturverzeichnis hingewiesen. MOLEKULARBIOLOGISCHE VERFAHREN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON SACCHAROMYCES CEREVISIAE-WEINHEFEN UND ANDEREN BEI DER WEINBEREITUNG VORKOMMENDEN HEFEARTEN Zur Identifizierung und Charakterisierung von Weinhefen in den verschiedenen Schritten der Herstellung, des Ausbaus und der Lagerung von Wein können kulturabhängige und kulturunabhängige Methoden zur Anwendung kommen. 1

2 KULTURABHÄNGIGE METHODEN BESTIMMUNG VON HEFESTÄMMEN AUF DER ART-EBENE rdnapcr-rflp (restriction fragments lenght polymorphism) PRINZIP: Es handelt sich um eine kulturabhängige Methode, da sie die Extraktion von DNA aus einer Reinkultur erfordert. Sie basiert auf der Amplifizierung spezifischer Regionen der rdna-wiederholungseinheiten (wie der "internal transcribed spacer" ITS1 und ITS2 und des eingebetteten 5,8S rrna-gens oder des 26S rrna-gens). Diese Regionen besitzen hochkonservierte Sequenzen und Sequenzen, die zwischen Stämmen unterschiedlicher Arten ein hohes Maß an genetischer Variabilität zeigen. In den meisten Fällen haben die mittels PCR amplifizierten Produkte von Stämmen derselben Art und derselben Gattung gleiche Molekulargrößen und Arten derselben Gattung ähnliche Größen. Selbst bei gleicher Größe ist die Sequenz dieser amplifizierten Regionen je nach Art unterschiedlich. Die Sequenzdifferenz wird durch die Restriktionsanalyse sichtbar, wobei verschiedene Restriktionsendonukleasen wie Cfo I, Hae III, Hinf I, Dde I, Mbo I verwendet werden. Die Restriktionsmuster sind je nach Art unterschiedlich. Das Dde I-Enzym ist zur Differenzierung zwischen H. uvarum und H. guilliermondii erforderlich (Esteve-Zarzoso et al., 1999 und Cadez et al., 2002) sowie das Mbo I-Enzym zur Differenzierung zwischen C. zemplinina und C. stellata (Sipicki, 2004). Zusätzlich sollten andere Restriktionsenzyme zur Differenzierung von Arten der Gattung Saccharomyces und ihrer Hybriden eingesetzt werden (Gonzales et al., 2006). ERGEBNISSE: Diese Methodik wurde bereits angewendet, um ca. 145 Hefearten aus 26 verschiedenen Hefegattungen zu identifizieren, und die Restriktionsprofile aller identifizierten Arten wurden von Esteve-Zarzaso et al. (1999) und Zanol et al. (2010). beschrieben. Die entsprechenden Daten (ITS-5,8S) sind online zugänglich ( Esteve-Zarzoso et al. (1999) - Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8 S rrna gene and the two ribosomal internal transcribed spacers. Int. J. Syst. Bacteriolo 49: Fernández-Espinar et al. (2000) - RFLP analysis of the ribosomal transcribed spacers and the 5.8 S rrna gene region of the genus Saccharomyces: a fast method for species identification and the differentiation of flor yeasts. Antoine Van Leeuwenhoek 78: De Llanos et al (2004) - Identification of species of genus Candida by RFLP analysis of the 5.8 S rrna gene and the two ribosomal internal transcribed spacers. Antoine Van Leeuwenhoek 85: Baleiras Couto et al. (2005) Partial 26S rdna restriction analysis as a tool to characterise non- Saccharomyces yeasts present during red wine fermentations. Int. J. Food Microbiol 102,

3 Zanol G., Baleiras-Couto M.M., Duarte F.L. (2010) Restriction profiles of 26S rdna as a molecular approach for wine yeasts identification. Ciência e Técnica Vitivinícola 25: Cadez N., Raspor P., de Cock A.W.A.M., Boekhout T., Smith M.Th. (2002) Molecular identification and genetic diversity within species of the genera Hanseniaspora and Kloeckera. FEMS Yeast Research 1, Sipiczki M. (2004) Species identification and comparative molecular and physiological analysis of Candida zemplinina and Candida stellata. J. Basic Microbiol. 44 (6), González S.S., Barrio E., Gafner J., Querol A. (2006) Natural hybrids from Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus and Saccharomyces kudriavzevii in wine fermentations. FEMS Yeast Res 6, Sequenzierung der D1/D2 Region nach Amplifizierung mittels PCR Prinzip: Es handelt sich um eine kulturabhängige Methode, da sie die Extraktion von DNA aus einer Reinkultur erfordert. Sie basiert auf der Amplifizierung der D1/D2 Region des 26S RNA Gens und der anschließenden Sequenzierung des erhaltenen Amplikons. Die Sequenz von D1/D2 variiert bei unterschiedlichen Arten um mehr als 1 % und bei Stämmen, die zur gleichen Art gehören, um weniger als 1%. ERGEBNISSE: Mit der Sequenz der D1/D2 Region des 26S rrna Gens kann zwischen allen bekannter Hefearten unterschieden werden. Die Sequenz der D1/D2 Region des 26S rrna Gens ermöglicht die Klassifizierung und phylogenetische Identifizierung von unbekannten Isolaten, da die bestehende Datensammlung die umfangreichste für Hefegene ist. Kurtzman and Robnett (1997) - Identification of clinically important ascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in the 5' end of the large-subunit (26S) ribosomal DNA gene. J Clin Microbiol. 35, 5 : Kurtzman and Robnett (1998) - Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie Van Leeuwenhoek. 73, 4: Baleiras Couto et al. (2005) - Partial 26S rdna restriction analysis as a tool to characterise non- Saccharomyces yeasts present during red wine fermentations. Int. J. Food Microbiol 102, BESTIMMUNG VON WEINHEFEN AUF DER STAMM-EBENE RFLP (restriction fragments lenght polymorphism) von mitochondrialer DNA (mtdna) PRINZIP: Die mitochondriale DNA (mtdna) von S. cerevisiae ist ein kleines Molekül von Kb, dessen Variabilitätsgrad mittels Restriktionsanalyse aufgezeigt werden kann. 3

4 Der ausgeprägte Polymorphismus der mtdna gestattet es, die Variabilität weinspezifischer S. cerevisiae-stämme zu untersuchen. Es handelt sich um eine der meistverwendeten Methoden zur Charakterisierung von Weinhefen, die während der alkoholischen Gärung isoliert wurden. Querol et al. (1992) und López et al. (2001) haben die Analysenmethode vereinfacht: Es ist nunmehr lediglich eine Extraktion der Gesamt- DNA aus einer Reinkultur sowie eine Restriktionsanalyse mit den Restriktionsenzymen Hinf I oder Rsa 1 (Guillamón et al., 1994; Schuller et al, 2004; Lopes et al 2006) erforderlich. ERGEBNISSE: Diese Technik ermöglicht es, in kurzer Zeit eine große Anzahl von Stämmen zu identifizieren. Da sie schnell und sicher ist, und keinerlei PCR-Gerätschaften erfordert, eignet sie sich für einen Einsatz in der Weinindustrie. Querol et al. (1992) - A comparative study of different methods of yeast strain characterization. Syst. Appl. Microbiol. 15: Guillamón et al. (1994) - Rapid characterization of four species of the Saccharomyces sensu stricto complex according to mitochondrial DNA patterns. Int. J. Bacteriol. 44: López et al. (2001) - A simplified procedure to analyse mtdna from industrial yeast. Int. J. Food Microbiology 68: Schuller D, Valero E., Dequin S., Casal (2004) Survey of molecular methods for the typing of wine yeast strains. FEMS Microbiology Letters 231, Lopes C.A, Lavalle T.L, Querol A., Caballero A.C. (2006) Combined use of killer biotype and mtdna-rflp patterns in a Patagonian wine Saccharomyces cerevisiae diversity study. Antonie van Leeuwenhoek 89, Amplifizierung von Delta (δ)-sequenzen PRINZIP: Delta-Sequenzen sind Elemente von 0,3 Kb (334 bp) und flankieren die Ty1- Retrotransposons in S. cerevisiae. Im Genom von Hefen sind zwischen 35 und 55 Kopien von Delta-Sequenzen gefunden worden, entweder als Bestandteil des Ty1- Retrotransposons oder als isolierte Elemente. Diese Delta-Sequenzen sind jedoch in genomischen Regionen konzentriert, die an trna-gene angrenzen. Die Anzahl und Anordnung dieser Elemente weist innerhalb einer Art eine gewisse Variabilität auf, die Ness et al. (1993) zur Entwicklung spezifischer Primer genutzt haben: δ 1 und δ 2 eignen sich zur Unterscheidung von S. cerevisiae-stämmen. Legars und Karts (2003) haben diese Technik optimiert, indem sie zwei neue Primer erstellt haben: δ 12 und δ 21, die zwischen δ 1 und δ 2 angeordnet sind. Die Verwendung von δ 12 und δ 21 oderδ 12 mit δ 2 ermöglicht es, einen stärker ausgeprägten Polymorphismus aufzuzeigen, der auf dem Elektrophoresegel von einer größeren Anzahl von Banden wiedergegeben wird. ERGEBNISSE: Legras und Karts (2003) ist es durch die Verwendung einer Kombination von δ 12 und 2 δ 1 oder δ 12 mit δ 2 gelungen, 53 im Handel erhältliche Stämme voneinander 4

5 zu unterscheiden. Schuller et al. konnten mittels der Primer δ 12 und δ 2 eine große Anzahl von Weinhefestämmen voneinander unterscheiden. Ness et al. (1993) - Identification of yeast strains using the polymerase chain reaction. J. Sci. Food Agric. 62: Legras and Karst (2003) - Optimisation of interdelta for Saccharomyces cerevisiae strain characterization. FEMS Microbiol. Lett. 221: Schuller et al. (2004) - Survey of molecular methods for the typing of wine yeast strains. FEMS Microbiol. Lett. 231: Genotypisierung durch Mikrosatelliten PRINZIP: Mikrosatelliten sind kurze Sequenzen, die sich aus Tandem-Wiederholungen von ein bis zehn Nukleotiden zusammensetzen. Diese Sequenzen sind im Hefegenom in kodierenden und nicht-kodierenden Regionen zu finden, ihr Anteil in kodierenden Regionen ist jedoch geringer. Mikrosatellitenmarker sind polymorphe Loci, deren allele Diversität die Differenzierung von Stämmen ein und derselben Hefeart ermöglicht.. Die polymorphen Mikrosatelliten aus verschiedenen Loci sind bekannt und können für die Typisierung von S. cerevisiae-stämmen eingesetzt werden (Legras et al. 2005). Die durch die Kombination von mindestens 6 Mikrosatelliten erhaltenen Profile ermöglichen eine wirksame Differenzierung von S. cerevisiae-stämmen. ERGEBNISSE: Mikrosatellitenmarker werden häufig als Genmarker in Studien der Genkartierung und Populationsgenetik eingesetzt. Die Kombination von sechs Mikrosatelliten-Loci hat sich als hoch diskriminierende und reproduzierbare Technik erwiesen und zeigt zudem geographische und technologische Verwandtschaften zwischen Stämmen auf. Die polymorphen Loci sind für die Bestimmung des Profils von S. cerevisiae-stämmen während der Gärung leicht zu verwenden. Schuller et al. (2004) - Survey of molecular methods for the typing of wine yeast strains. FEMS Microbiol. Lett. 231: Legras et al. (2005) - Selection of hypervariable microsatellite loci for the characterization of Saccharomyces cerevisiae strains. Int J Food Microbiol. 102: Schuller and Casal (2007) - The genetic structure of fermentative vineyard-associated Saccharomyces cerevisiae populations revealed by microsatellite analysis. Antonie van Leeuwenhoek 91:

6 KULTURUNABHÄNGIGE METHODEN QUANTITATIVE PCR (qpcr) ANWENDUNGSGEBIET: Schnellnachweis und Quantifizierung von Hefearten in Most oder Wein PRINZIP: Diese Methode beruht auf der Verwendung universeller Hefeprimer, die für die variablen D1/D2-Domänen des 26S-rRNA-Gens entwickelt wurden. Es handelt sich dabei um eine der wenigen Gensequenzen, die für alle bekannten Arten von Ascomyceten- Hefen verfügbar ist. Die Quantifizierung ist nach Bestimmung der für die Überschreitung des Schwellensignals notwenigen Anzahl der Polymersiationszyklen möglich. Je höher die DNA im Muster der betreffenden Art ist, desto weniger Zyklen sind zur Schwellenüberschreitung notwendig.die Kalibrierungskurven ermöglichen eine präzise Quantifizierung. ERGEBNISSE: Die Technik ist zur Quantifizierung von Candida stellata, Dekkera bruxellensis, Hanseniaspora uvarum und Saccharomyces cerevisiae in gemischten Fermentationsansätzen verwendet worden, und zwar sowohl in synthetischen Medien als auch in Wein. Versuchsreihen zeigten eine Linearität über 5 Zehnerpotenzen hinweg. Die Nachweisgrenze liegt bei 10 2 KBE/ml. Wenn die Proben weitere Wein-Mikroorganismen (Hefen und Bakterien) enthalten, die nicht Gegenstand der Untersuchung sind, beeinträchtigt dies die qpcr-untersuchung nicht in nennenswerter Weise. Für den Nachweis und die Bestimmung verschiedener Nicht-Saccharomyces-Hefen wurde eine schnelle qpcr-methode entwickelt, wobei artspezifische Primer für C. zemplinina, T.delbrueckii, I. orientalis, und M. pulcherrima verwendet wurden (Zott et al., 2010). Hierro, Esteve-Zarzoso, Gonzalez, Mas and Guillamon et al. (2006) - Real-Time Quantitative PCR (QPCR) and Reverse Transcription-QPCR for Detection and Enumeration of Total Yeasts in Wine. Applied and environmental microbiology 72(11): Zott K, Claisse O, Lucas P, Coulon J, Lonvaud-Funel A, Masneuf-Pomarede I (2010) Characterization of the yeast ecosystem in grape must and wine using real-time PCR. Food Microbiology 27: PCR DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis) ANWENDUNGSGEBIET: Identifizierung von Hefearten in Most oder Wein PRINZIP: Diese Methode beruht auf der Amplifizierung von 26S-rDNA von Hefen unter Verwendung der universellen Primer U1 (in Verbindung mit einer GC-Klammer) und U2. Die Amplifizierungsfragmente werden in einem denaturierenden Polyacrylamidgel (Gradient von 20 bis 60% Harnstoff und Formamid) gemäß ihrer Länge und ihrer 6

7 Nukleotidzusammensetzung aufgetrennt. Die Amplifizierungsfragmente von Interesse werden direkt aus dem Gel geschnitten und zur Identifizierung der Mikroorganismenart sequenziert, wobei auf die 26S-DNA Sequenzdatenbank der Hefen Bezug genommen wird. Einer der Vorteile besteht in der Möglichkeit, auch lebensfähige, aber nicht kultivierbare Hefen identifizieren zu können, deren DNA ebenfalls amplifiziert ist ERGEBNISSE: Diese Technik ist verwendet worden, um Mikroorganismenpopulationen sowohl aus Trauben- als auch aus Weinproben zu analysieren, und hat zur Identifizierung von verschiedenen Hefearten geführt (Candida diversa, Candida sorboxylosa, Candida stellata, Dekkera bruxellensis, Hanseniaspora occidentalis, Hanseniaspora uvarum, Issatchenkia hanoiensis, Issatchenkia occidentalis, Issatchenkia orientalis, Issatchenkia terricola, Kluyveromyces thermotolerans, Metschnikowia pulcherrima, Pichia kluyveri, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycodes ludwigii, Torulaspora delbrueckii, Zygosaccharomyces bailii). Hefepopulationen von mehr als 10 3 Zellen/ml werden mittels PCR-DGGE in geeigneter Weise nachgewiesen und identifiziert. PCR-DGGE ist kein quantitatives Verfahren. Cocolin L, Heisey A, and Mills D.A. et al (2001) - Direct Identification of the Indigenous Yeasts in Commercial Wine Fermentations. Am. J. Enol. Vitic. 52:1: