Mikrobiologische Diagnostik bei STD und HIV

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1 Mikrobiologische Diagnostik bei STD und HIV Viren und Bakterien alte und neue Probleme in der Diagnostik

2 Der Darm Diarrhoe

3 Erreger von Diarrhoen Viral: Rotaviren Noroviren Adenoviren Astroviren Coronaviren (CMV) Bakteriell/Parasitär: Campylobacter Lamblien Kryptosporidien Salmonellen Shigellen EHEC/ETEC (Clostridium difficile) Amöben (Reise)

4 Nachweis von viralen Erregern Antigen: Noro-, Astro-, Rota- und Adenoviren PCR: Noro-, Adenoviren CMV aus Stuhl (pp65-antigen und CMV-PCR aus Plasma bei dieser Fragestellung wenig empfindlich) Abrechnung im EBM möglich

5 Nachweis von bakteriellen/parasitären Erregern Kulturverfahren: Antibiogram (aber häufig keine Antibiotikatherapie erforderlich) Antigen-Verfahren: Giardia lamblia (Immunfluoreszenz, ELISA) Campylobacter jejunii

6 Die Leber Hepatitis C

7 Hepatitis C Diagnostik Indirekter Virusnachweis Anti-HCV-Suchtest (z.b. ELISA) Anti-HCV-Bestätigungstest (Immuno-Blot) (HCV-spezifische T-Zellen) Direkter Virusnachweis Quantitative PCR (Real-Time PCR) Qualitative PCR (einzeln obsolet) Genotypisierung mittels Sequenzierung Genotypisierung mittels Genotyp-spezifischer PCR Genotypisierung mittels RFLP (RestriktionsFragment-Längen- Polymorphismus)

8 Vor- und Nachteile der Methoden zur Genotypisierung Genotyp spezifische PCR/RFLP günstig schnell Gute Detektion von Mischinfektion Einschränkung auf häufige Geno-und Subtypen Unterscheidung zwischen Relapse und Reinfektion nur möglich bei Geno- bzw. Subtyp Veränderung Punktmutationen können zur Fehlinterpretation führen Genotyp mittels Sequenzierung Teuer langsam Mischinfektionen können nur eingeschränkt detektiert werden (Ultra-Deep- Sequencing?) Seltene Geno- bzw Subtypen werden korrekt erkannt Unterscheidung zwischen Relapse und Reinfektion durch phylogenetische Analyse möglich Epidemiologische Untersuchungen sind möglich Punktmutationen führen nicht zur Fehlinterpretation

9 Auf Anti-HCV kann man lange warten Patient * * * * * Screening nach anti-hcv nicht genug Nach der ersten positiven HCV-RNA 37% anti-hcv positiv 3 Monate später 86% anti-hcv positiv 6 Monate später 5 3 5% ohne SeroKonversion nach 1 Jahr 1 * *

10 Ohne Anti-HCV geht es auch nicht Anti-HCV in der Probe ab Tag 130 positiv, Virus phylogenetisch der Indexpatientin zuzuordnen Gruener et al. Infection control and hospital epidemiology march 2009, vol. 30, no. 3

11 STD

12 Lues

13 Treponema pallidum Lues-Serologie Antikörper-Suchtest (z.b. ELISA) TPPA/TPHA: Treponema-pallidum Partikel- Agglutinations-Test VDRL FTA-ABS (Fluoreszenz-Treponema-Antikörper- Absorptions-Test)(IgM) Quantitative Lues-ELISA Bestätigungstest (Immuno-Blot) Lues-PCR

14 Lues-Serologie I TPPA FTA- Abs FTA- ABS- IgM VDRL Interpretation positiv positiv positiv positiv gesicherte Lues: Frische Infektion oder auch kurz nach Therapie positiv positiv negativ negativ gesicherte Lues: Seronarbe nach behandelter Lues oder langjährig bestehende (auch unbehandelte) Infektion positiv negativ negativ negativ unspezifische Reaktion, keine Lues negativ negativ negativ negativ keine Lues

15 Lues-Serologie II TPPA FTA- Abs FTA- ABS- IgM VDRL Interpretation positiv (1:1280) negativ/ schwach positiv positiv negativ Sehr frische Lues positiv (1:1280) positiv negativ Schwach positiv (1:1 od. 1:2) Alte Lues nicht aktiv nach Behandlung, VDRL wahrscheinlich unspezifisch positiv (>1:20000) positiv negativ Schwach positiv (1:1 od. 1:2) Aktive Lues, geringer Zellzerfall

16 Neisseria gonorhoe Kultureller Nachweis Langsam Gegen Störfaktoren empfindlich Antibiogramm möglich PCR Nachweis Schnell Weitgehend unempfindlich au Störfaktoren Kombination mit Chlamydia trachomatis Nachweis möglich Empfindlichkeit bei asymptomatischen Infektionen deutlich erhöht Antikörper Nachweis Keine Entscheidung ob eine akute Infektion vorliegt möglich

17 Neisseria gonorrhoe Ein empfindlicher Erreger

18

19 Chlamydia trachomatis Antigen-Nachweis (obsolet) Abstrich PCR-Nachweis Erststrahl-Urin (Morgenurin) Abstrich Bei positivem PCR-Nachweis molekulargenetische Differenzierung Lymphogranuloma venereum möglich (Serovare L1-L3) Antikörper-Nachweis

20 Lunge

21 Community-acquired Pneumonia (CAP) Häufigkeit Sehr häufig (40-50%) Gelegentlich (5-10%) Selten (<5%) Ca 20-25% Erreger S. pneumoniae H. influenzae M. pneumoniae Enterobacteriaceae RSV, Adenoviren Influenzaviren, Parainfluenzaviren Legionella spp. S. aureus C. pneumoniae, (Pseudomonaden) Erreger ungeklärt

22 Problemmaterial Sputum Echtes Sputum, kein Speichel Mikroskopie wichtig Genügend Granulozyten Nicht zu viele Plattenepithelien (Speichel Kontamination) Schnelle Verarbeitung erforderlich

23 Procalcitonin Christ-Crain & Müller, Swiss Med Wkly 2005;135:451-60

24 Kinetik von Zytokinen, PCT und CRP nach Applikation von Endotoxin

25 Procalcitonin <0.1 ng/ml Keine antibiotische Therapie ng/ml Klinische Entscheidung ng /ml Antibiotikatherapie (Penicillin V oder Aminopenicillin ggf. mit β-lacatamase- Hemmer) >0.5 ng/ml Indikator für septischen Verlauf

26 Diagnostische Probleme Chlamydophilia pneumoniae Anzucht nur im Speziallabor möglich und zeitaufwändig Serologie mit großem diagnostischen Fenster (2-3 Wochen nach Erkrankung bis zur IgM Bildung) IgM-Bildung bleibt bei erneuter Infektion aus Mycoplasma pneumoniae Anzucht nur im Speziallabor möglich und zeitaufwändig Serologie mit großem diagnostischen Fenster (12 Tage nach Erkrankung bis zur IgM Bildung) Kälteagglutinine mit hoher Unspezifität behaftet

27 Virale CAP Antigen-Teste für RSV, Adeno- und Influenzaviren vorhanden PCR-Teste möglich, aber keine Kostenerstattung im EBM Keine spezifische Therapie für RSV und Adenoviren (Versuche mit Ribavirin bzw. Cidofovir bei schwer Immunsupprimierten)

28 Mycobakterium tuberculosis Robert Koch-Institut: SurvStat, Datenstand:

29 TBC Screening Tine Test seit 2005 nicht mehr erhältlich Mendel-Manthoux Test mit 2 TU (tuberculin units) Tuberkulin RT23 des Statens Institut Kopenhagen

30 γ-interferon-teste T-Spot.TB Elispot-Verfahren Material: Heparin- oder Citrat-Blut Probe ohne speziellen Zusatz bis zu 8h stabil CD4+T-Zellzahl bis zu 40/µl möglich (sinkender NPV!!) Quantiferon Gold Quantitatives Verfahren Spezielles Abnahmesystem Eingeschränkte Probenstabilität Mindest-CD4+T-Zellzahl 200/µl.

31 Wie funktionierts? Die T-SPOT.TB Antigene (ESAT-6 & CFP 10) befinden sich beide in der RD1 Region des M.tuberculosis. Die RD1 Region ist nicht in den BCG Stämmen vorhanden (diese Region ging bei der Entwicklung von M. bovis BCG aus M. bovis zwischen 1908 und 1931 am Institut Pasteur verloren) Die RD1 Region ist ebenfalls nicht in den meisten Umwelt Mycobakterien vorhanden, einschliesslich M. avium.

32

33 Was wird erkannt?

34 Sensitivität und Spezifität TSpot TB

35 Die Zukunft

36 Keimdifferenzierung mittels MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Keimidentifizierung innerhalb von 10 Minuten Reinkulturen notwendig (Kurzkultur meistens ausreichend) Noch nicht aus primären Patientenmaterial möglich Antibiotika-Resistenz noch nicht beurteilbar

37 Funktionsprinzip MALDI-TOF Bakterien auf der Targetplatte werden aufgebrochen und ionisiert Bruchstücke benötigen unterschiedlich lange bis sie auf dem Detektor auftreffen

38

39 IBIS Abbott PLEX-ID

40 Abbott PLEX-ID Hohe Sensitivität Schnelle Ergebnisse Auch aus Patientenmaterial möglich (aber bisher nicht für alle Erreger) Hohe Anschaffungskosten Bisher Antibiotikaresistenz nur im Sinne MRSA Nachweis und VRE-Nachweis Auch unbekannte Erreger werden erkannt (Entdeckung von Influenza A/H1N1sw wurde mit dem Abbott PLEX-ID identifiziert)

41 Vielen Dank für ihre Aufmerksamkeit

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