Entwicklung und Bewertung von praxisorientierten Maßnahmen zur Verringerung des Mycosphaerella anethi-befalls von Fenchelfrüchten

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1 Entwicklung und Bewertung von praxisorientierten Maßnahmen zur Verringerung des Mycosphaerella anethi-befalls von Fenchelfrüchten Laufzeit Forschungsstelle Projektleitung Förderung Julius Kühn - Institut (JKI) Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen Institut für Epidemiologie und Pathogendiagnostik Erwin-Baur-Str Quedlinburg Prof. Dr. Thomas Kühne Gefördert durch das Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz unter dem Förderkennzeichen aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestags. Problemstellung/Zielsetzung Der pilzliche Erreger Mycosphaerella anethi (anamorph Passalora punctum) führt im Arzneifenchelanbau (Foeniculum vulgare Mill.) seit ca. 20 Jahren zu hohen Ertragsausfällen. Im vorangegangenen Projekt ( ) wurde erstmals eine objektive Methode (semiquantitativer PTA-ELISA) zur Bestimmung und zum Vergleich der M. anethi-befallsstärken an Fruchtchargen entwickelt, der zur präzisen Untersuchung des Schadauftretens und der Ausbreitung von M. anethi in Arzneifenchelbeständen eingesetzt werden kann. Im aktuellen Projekt soll ein quantitativer genombasierter Pilznachweis (qpcr) entwickelt werden. Diese Methode soll den quantitativen PTA-ELISA ergänzen bzw. ersetzen, dessen Empfindlichkeit für den Nachweis des Pilzes bei latenter Infektion von Jungpflanzen bisher nicht ausreicht. Nachfolgend sollen Fruchtproben, die bereits im PTA-ELISA getestet wurden, in der qpcr quantifiziert werden, um die Sensitivität und Reproduzierbarkeit der Methoden zu vergleichen. Zur Untersuchung der Beeinflussbarkeit des Schadniveaus von M. anethi sollen Feldversuche angelegt werden, die pflanzenbauliche Maßnahmen sowie Pflanzenschutzmaßnahmen aufgreifen, die zur schnellen und nachhaltigen Verbesserung des praxisüblichen Anbaus geeignet wären. Die Wirkung von Fungiziden zur Bekämpfung von M. anethi wurde in der Vergangenheit in Feldversuchen bereits intensiv untersucht. Bewertungskriterien waren entweder Ertragsunterschiede oder der Doldenbefall nach visueller Bonitur. Allerdings fehlten in allen Versuchen Isolierstreifen zwischen den Parzellen zur Verhinderung der Konidienverbreitung im Gesamtbestand. Die zu erfassenden Unterschiede zwischen den Versuchsvarianten waren deshalb 1

2 gering, weil die Sekundärinfektionen jeweils über den gesamten Versuch gleichmäßig verteilt waren. Der Einsatz von Beizmitteln wurde bisher kaum wissenschaftlich untersucht bzw. es existieren keine verlässlichen Literaturangaben zu ihrer Wirkung. Alle bisherigen Versuche zur Ermittlung des Pflanzenabstandes, der Wirkung von Zwischensaaten und des Einflusses von Dünger auf die Pflanzenentwicklung und die Epidemiestärke wurden ebenfalls ohne Berücksichtigung der Wirkung des Konidienflugs durchgeführt. Die daraus resultierenden Ergebnisse sind deshalb zu überprüfen. Der Fruchtbefall der Varianten soll anschließend in der qpcr quantifiziert werden. Bei Fungiziden werden neben der Pflanzenverträglichkeit auch die Wirksamkeit der Mittel sowohl zur Eindämmung der epidemischen Verbreitung des Erregers als auch zur Verminderung des latenten Befalls geprüft. Daneben sollen Versuche mit nachweislich pilzfreien Pflanzen von Hochleistungssorten durchgeführt werden, die in vitro angezogen und vermehrt wurden. Vor einer gezielten Vermehrung von erregerfreiem Saatgut für den Praxisanbau muss geklärt werden, welche Abstände zu natürlich infizierten Feldbeständen und welche zeitlichen Anbaupausen im Fall einer nachgewiesenen Bodenübertragbarkeit des Pilzes gewählt werden müssen, damit ein Bestand gesund erhalten werden kann. Zu diesem Zweck soll die Ausbreitung des Erregers von einer Infektionsquelle in einen unbefallenen Bestand untersucht werden. Weiterhin ist zu klären, ob der Erreger im Boden überdauern und auf diesem Weg Fenchelpflanzen infizieren kann. Zur Bewertung des Befallsniveaus der Varianten stehen ein semi-quantitativer PTA-ELISA und eine qpcr-methode zur Verfügung. Für den Praxisanbau sollen nachfolgend geeignete Vorgehensweisen zur Reduzierung von Ertragsausfällen, zum optimierten Pflanzenschutzmitteleinsatz und zur Produktion von möglichst gesundem bzw. erregerfreiem Saatgut entwickelt werden. Sachstand 1. Optimierung der qpcr Die im vorangegangenen Projekt entwickelte quantitative PCR wurde fortlaufend weiteroptimiert und zu einer quantitativen Real-Time-PCR (qpcr) weiterentwickelt. Zur Erhöhung der Testsensivität waren mehrere Primermodifikationen notwendig, damit der Erreger auch in Jungflanzen sicher nachgewiesen werden konnte. Da der DNA-Gehalt aus Pilzmycel sehr starken Schwankungen unterlag, erfolgte eine Umstellung der Eichgerade von Pilz-Gesamt- DNA zu Klon-DNA. Für die Extraktion der DNA wurden zwei Kits von MP (MP Biomedicals, Germany) routinemäßig eingesetzt. Mit der qpcr konnte der Pilzbefall in Fenchelfrüchten und Pflanzen molekularbiologisch sicher quantifiziert werden. Der Feinnachweis des Erregers war auch molekularbiologisch schwierig, weil das Erregermycel in diesem Pflanzensentwicklungsstadium nur in äußerst geringer Menge vorhanden war, oft unterhalb der Nachweisgrenze. Erst bei ca. 50 Tage alten Pflanzen aus Freilandanzucht war M. anethi im Stängelgewebe sicher zu detektieren. Bei Fenchelpflanzen war die Probenaufbereitung und DNA-Extraktion durch zahlreiche Einzelschritte (Präparation, Trocknung, Gewichtsbestimmung, Mahlung, Absiebung, Extraktion, Reinigung, Verdünnung) sehr zeit- und kostenintensiv. Die Testung von Früchten war aufgrund des homogenen Probenmaterials einfacher. Der PTA- ELISA erlaubte dagegen eine schnellere, vereinfachte Testung von größeren Probenchargen. PTA-ELISA und qpcr lieferten bei Vergleichstestungen hochkorrelierte Ergebnisse bezüglich der Befallsrangfolge. Die ermittelten Erregerkonzentrationen unterschieden sich erwartungsgemäß stark voneinander. Mit dem serologischen Test wurde die äußerliche Kontamination des Probenmaterials gemessen. Der molekularbiologische Test ermittelte dagegen den DNA- Gehalt des vorhandenen Pilzmycels. 2. Vermehrung der Gewebekulturpflanzen und Erzeugung von erregerfreiem Saatgut Die in Gewebekultur gewachsenen, erregerfreien Hochleistungssorten wurden bereits zweima- 2

3 lig (Frühjahr 2013 und 2014) in Erdkultur überführt und im Freiland zur Erzeugung von erregerfreiem Ausgangssaatgut ausgepflanzt. Die Erregerfreiheit der Früchte des Ernteguts (ca. 40 Mischproben aus je vier Pflanzen) wurde mehrmalig in der qpcr überprüft. Parallel dazu wurden die verbliebenen Pflanzen in Gewebekultur als definierte Gesundkontrolle für die molekularbiologischen Arbeiten erhalten. Das von diesen Pflanzen gewonnene Saatgut wurde im Frühjahr 2014 ausgesät. Von den Pflanzen wurden regelmäßig Proben genommen und auf Befallsfreiheit getestet. 3. Einfluss pflanzenbaulicher Maßnahmen In den beiden letzten Jahren wurden neun Fungizide und ein Beizmittel auf ihre Wirkung gegen M. anethi in Fenchel in Isolierparzellen mit Maistrennstreifen in Quedlinburg (JKI) und Bernburg (LLFG) getestet. Im letzten Jahr war die Witterung während der epidemischen Phase im Sommer an beiden Standorten so extrem, dass die Differenzierung der Fungizidwirkung verhindert wurde. In Quedlinburg unterband eine andauernde Trockenheit den Pilzbefall so nachhaltig, dass keine stärkeren Symptome auftraten. In Bernburg kam es nach einem Hagelsturm zur Lagerung des Fenchels und des Maisstreifens, was zu einem sehr starken gleichmäßigen Befall in allen Varianten führte. Die Anwendungen und Untersuchungen zur Wirkung alternativer Behandlungsmöglichkeiten (Pflanzenstärkungsmittel, Pflanzenabstand, Zwischensaaten, Düngung) wurden 2013 bereits durchgeführt. Die Ergebnisse wurden ebenfalls durch die Trockenheit negativ beeinflusst, die Varianten unterschieden sich bezüglich des M. anethi-befalls kaum. 4. Epidemiologische Analysen Zur Ermittlung der Ausbreitung des M. anethi-befalls nach künstlicher Inokulation in einem unbefallenen Fenchelbestand wurden mehrere Reihen der Sorte Berfena gedrillt. An einem Ende der Parzelle wurden die Pflanzen siebenmalig künstlich inokuliert. Nachfolgend konnten nur vereinzelte Konidienlager an den behandelten Pflanzen bonitiert werden, eine epidemische Vereitung konnte nicht initiiert werden. Der Versuch wird 2014 wiederholt. Durch die zunehmende Bedeutung der Schäden durch M. anethi-befall wurde die Suche nach resistenten Herkünften und Sorten zu einem wichtigen Ziel in der Züchtungsforschung an Fenchel. In der aktuellen Fenchelzüchtung wurden noch keine modernen Labortechniken zur Befallseinschätzung von M. anethi und zur nachfolgenden Selektion von weniger anfälligen Genotypen eingesetzt. Die Auswahl der Kreuzungseltern erfolgte ausschließlich durch Sichtbonitur der Doldenstiele. Zur Ermittlung potentieller Resistenzquellen wurden 60 Fenchelakzessionen und -sorten aus dem IPK Gatersleben auf dem Versuchsfeld in Quedlinburg ausgesät (Horstsaat). Bedingt durch die lange Trockenphase im Sommer 2013 kam es zu vermehrten, stressbedingten Balttverlusten. Der Erregerbefall war nur äußerst gering, auch bei den sonst sehr anfälligen Vergleichssorten. Die Saatguttestung (Erntegut) mittels qpcr ergab nur bei drei Varianten einen sehr geringen Fruchtbefall. Im Jahr 2014 wurden die überwinterten Wurzeln der Genbankherkünfte ausgespflanzt und dreimalig inokuliert. Die Fruchttestung erfolgt im Herbst, momentan laufen die Boniturarbeiten. In diesem Jahr ist der Erstbefall an fast allen zweijährigen Pflanzen bereits deutlich früher aufgetreten als erwartet. Durch den momentan schnellen Wechsel von heißer und feuchter Witterung sind die äußeren Bedingungen für einen starken M. anethi-befall äußerst günstig. Die Bodenübertragung von M. anethi ist bedeutsam, weil Fenchel überwiegend mehrjährig angebaut wird. Nach der ersten Vegetationsperiode verbleiben nach dem Drusch große Mengen von befallenen Blatt- und Stängelresten auf dem Feld. Ob die Konidien im Boden verbleiben und Neuaussaaten auf direktem Weg infizieren können, ist bisher noch nicht untersucht worden. Die Diskussion über die Samenübertragbarkeit von M. anethi war immer sehr eng mit der Bedeutung von infizierten Ernterückständen und der Bodenübertragbarkeit des Erregers verbunden. Mit der entwickelten qpcr sollen Ernterückstände sowie Bodenproben von Fel- 3

4 dern und Topfversuchen (mit eingearbeitetem Inokulationsmaterial) auf potenzielle Infektionsreservoirs von M. anethi untersucht werden. Die Untersuchungsergebnisse stehen noch aus. Projektbezogene Veröffentlichungen Taubenrauch, K.; Gabler, J.; Pank, F.; Krüger, H.; Hau, B. Einfluss der Stärke des Mycosphaerella anethi-befalls auf den Ertrag und die qualitätsbestimmenden Merkmale der Arzneifenchelsorte Magnafena (Foeniculum vulgare Mill.) Gewürzpflanzen, Bernburg, , Tagungsband S Taubenrauch, K.; Gabler, J.; Pank, F.; Krüger, H.; Hau, B. Auswirkungen des Mycosphaerella anethi-befalls auf Ertrag und qualitätsbestimmende Inhaltsstoffe von Arzneifenchelsorten (Foeniculum vulgare Mill.) Gewürzpflanzen, Bernburg, , Tagungsband S Samenübertragbarkeit von Mycosphaerella anethi Gewürzpflanzen, Bernburg, , Tagungsband S Mycosphaerella anethi-befall an Körnerfenchel: Möglichkeiten der Schadensverringerung. Teil 1 Gemüse (2008), Heft 3, S. 41 Mycosphaerella anethi-befall an Körnerfenchel: Möglichkeiten der Schadensverringerung. Teil 2 Gemüse (2008), Heft 4, S Mykologische Untersuchungen von Mycosphaerella anethi an Fenchel (Foeniculum vulgare Mill.) Mitt. Julius Kühn-Institut (2008), 417, Dualkulturen von Fenchel (Foeniculum vulgare Mill.) und Mycosphaerella anethi - Symptombildung und Ausbreitung Mitt. Julius Kühn-Institut (2008), 417, 388 Entwicklung einer PCR-Methode zum Nachweis von Mycosphaerella anethi an Fenchelsaatgut 18. Bernburger Winterseminar Arznei- und Gewürzpflanzen, Bernburg, , Tagungsband S. 44 4

5 Taubenrauch, K.; Hau, B.; Kühne, T. Mycosphaerella anethi - ein samenübertragbarer Schaderreger an Fenchel 57. Deutsche Pflanzenschutztagung, Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, , Julius Kühn-Archiv, S. 401 Taubenrauch, K.; Hau, B.; Kühne, T. Ermittlung des Befallsniveaus von Mycosphaerella anethi an Fenchelfrüchten 57. Deutsche Pflanzenschutztagung, Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, , Julius Kühn-Archiv, S. 402 Projektvorstellung: Entwicklung einer quantitativen Methode zum Nachweis von Mycosphaerella anethi an Fenchelfrüchten Tagung Arzneipflanzenanbau in Deutschland - mit koordinierter Forschung zum Erfolg, Neustadt an der Weinstraße, , Tagungsband S. 193 Erste Ergebnisse zur quantitativen Ermittlung des Mycosphaerella anethi-befalls an Fenchelfrüchten Tagung Arzneipflanzenanbau in Deutschland - mit koordinierter Forschung zum Erfolg, Neustadt an der Weinstraße, , Tagungsband S. 194 Bewertung von Arzneifenchelchargen bezüglich des quantitativen Befalls von Mycosphae-rella anethi 6. Fachtagung Arznei- und Gewürzpflanzen, Deutscher Fachausschuss für Arznei-, Gewürzund Aromapflanzen, Humboldt Universität zu Berlin, Berlin, , Tagungsband S