Chemische Proteinmodifikation - Im Wettbewerb mit der Natur

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Chantal Baumhauer
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1 Chemische Proteinmodifikation - Im Wettbewerb mit der atur Universität Wien Fakultät Chemie Institut für Biologische Chemie Prof. Dr. Christian Becker Währinger Str Wien, Austria Biological Chemistry 1

Chemie Prof. Dr. Christian Becker Währinger Str.

2 Inhalt - Was sind Proteine? - Ribosomale Proteinsynthese - Spezifische Modifikationen & Ihre erausforderungen - Chemische Proteinsynthese (istorische & Aktuelle Möglichkeiten) - Beispielsysteme Biological Chemistry 2

3 Was sind Proteine? Proteine = Eiweiße Makromoleküle, die linear aus Aminosäuren aufgebaut werden und unterschiedlich lang sein können (von 2 bis zu Aminosäuren). Sehr viele Kombinationsmöglichkeiten: Kettenlänge von 100 Aminosäuren = (= ) Verknüpfungsmöglichkeiten Biological Chemistry 3

werden und unterschiedlich lang sein können (von 2 bis zu 30.

4 Funktionen von Proteinen - Enzyme katalysieren praktisch alle chemische Reaktionen - ormone dienen als Signalstoffe - Rezeptoren leiten Signale in das Zellinnere weiter - Ionenkanäle leiten Ionen durch biologische Membranen, - Transporter befördern ihr Substrat über die Membran, - ämoglobin transportiert Sauerstoff - Antikörper binden an Fremdstoffe - Gerüstproteine des Zytoskeletts sorgen für Form und rganisation der Zelle - Faserproteine verleihen Festigkeit - istone verpacken die DA - DA- und (z.b. Polymerase, Transkriptionsfaktoren) RA-bindende Proteine vermitteln die Replikation des Erbguts und die Expression von Genen Biological Chemistry 4

Antikörper binden an Fremdstoffe - Gerüstproteine des Zytoskeletts sorgen für Form und rganisation der Zelle - Faserproteine verleihen Festigkeit - istone

5 Ribosomale Proteinsynthese 1. Transkription Umschreiben der DA in mra durch RA Polymerase 2. Translation Übersetzen der mra in ein Poylpeptid mit ilfe der Ribosomen (ca. 15 AS/s in Bakterien, aber nur ca. 2 AS/s in Eukaryonten) 3. Einführung von posttranslationalen Modifikationen, wie Glykosylierung, Lipidierung, Acetylierung etc. Biological Chemistry 5

Translation Übersetzen der mra in ein Poylpeptid mit ilfe der Ribosomen (ca.

6 Proteinbiosynthese - Proteine beliebiger Größe mit höchster Präzision - Korrekte Faltung - Menge pro Zelle variiert stark Crystal Structure of Dihydrofolate Reductase-Thymidylate Synthase from Cryptosporidium hominis Modeled structure of ternary REP-1: RabGGTase:Rab7 complex Rap-RBD complex assar et al. (1995) ature 375, Biological Chemistry 6

Reductase-Thymidylate Synthase from Cryptosporidium hominis Modeled structure of ternary

7 Posttranslationale Modifikationen in Proteinen Protein Chemistry 7 Becker, BioSpektrum 3/2011,

8 Warum chemische Proteinmodifikation & Synthese? - Einführen komplexer Modifikationen / Zugang zu homogenen Proteinpräparationen - Direkter Zugang zu Proteinen für biophysikalische und strukturelle Untersuchungen - Freie Variation der Polypeptidkette / Proteine mit neuen Eigenschaften - rtspezifische Markierung von Proteinen / Active Site Modifikationen - Entwicklung von Medikamenten auf Peptid- und Proteinbasis - Verknüpfung von Proteinen mit anderen (Bio-) Polymeren Biological Chemistry 8

biophysikalische und strukturelle Untersuchungen - Freie Variation der Polypeptidkette / Proteine mit neuen Eigenschaften -

9 Recombinante Expression Chemische Synthese Recombinante Expression - Molekularbiologie - Proteinreinugung - Selektive Modifikation Funktionale Proteine Chemische Synthese - Synthese von Bausteinen - Automatische Peptidsynthese - Bioaktive Peptide Analyse Massenspektrometrie in vitro Analyse (CD, Fluoreszenz, Lichtstreuung, Kalorimetrie) Zell-basierte Assays Biological Chemistry 9

von Bausteinen - Automatische Peptidsynthese - Bioaktive Peptide Analyse Massenspektrometrie in

10 Festphasensynthese von Peptiden (SPPS) - Peptide mit bis zu ~100 Aminosäuren - Chemische Synthese vom C- zum -Terminus Linker R 1 2 R 2 Boc Kopplungsreagenz Linker R 1 R 2 Boc Reinigung, Waschen & Filtrieren Entfernen der Boc-Gruppe Linker R 2 2 R 1 Reinigung, Waschen & Filtrieren R 3 Boc Kopplungsreagenz Linker R 1 R 2 R 3 Boc Reinigung, Waschen & Filtrieren Entfernen der Boc-Gruppe Wiederholen Abspaltung + Seitenkettenentschützung Aufreinigung Biological Chemistry 10

Linker R 2 2 R 1 Reinigung, Waschen & Filtrieren R 3 Boc Kopplungsreagenz Linker R 1 R 2 R 3 Boc Reinigung, Waschen &

11 Durchführung der Festphasensynthese Flüssigkeiten Stickstoff Vakuum Flüssigkeiten Manuell Automatisch Biological Chemistry 11

12 Reaktionseffizienz und Ausbeute Ausbeuten pro Kopplungsschritt: 99% Gesamtausbeute für ein Peptid aus 50 Aminosäuren: 61% Gesamtausbeute für ein Peptid aus 100 Aminosäuren: 37% Ausbeuten pro Kopplungsschritt: 98% Gesamtausbeute für ein Peptid aus 50 Aminosäuren: 37% Gesamtausbeute für ein Peptid aus 100 Aminosäuren: 13,5% Typische Ausbeute bei modernen Kopplungsmethoden: >99,9% Biological Chemistry 12

Kopplungsschritt: 98% Gesamtausbeute für ein Peptid aus 50 Aminosäuren: 37% Gesamtausbeute für ein

13 Größenlimitierung der Peptidsynthese Durchschnittliche Größe von Proteinen Proteingröße Proteindomänen Chemische Ligation Kent, S. B..; Dawson, P. Annu. Rev. Biochem 2000, 69: Biological Chemistry 13

14 Wie es begann? My entire yearning is directed towards the first synthetic enzyme (Letter to Adolf v. Baeyer, 1905) Emil Fischer ( ) obel Prize in Chemistry 1902 Synthesis of xytocin CYIQCPLG- 2 Vincent du Vigneaud ( ) obel Prize in Chemistry 1955 Biological Chemistry 14

15 elmut Zahn ( ) Panayotis Katsoyannis Wie es begann? First Chemical Protein Synthesis Synthesis of Insulin (51 aa) in Meienhofer et al., Zeitschrift für aturforschung, 18b,1963. Biological Chemistry 15

16 Wie es begann? The first synthetic enzyme: Bruce Merrifield ( ) obel Prize in Chemistry 1984 Ribonuclease A (124 aa) 1971 Ralph irschmann ( ) Biological Chemistry Gutte & Merrifield, JBC, 246, ,

17 Synthetische IV Protease (99 AS) 1988 Steve Kent Biological Chemistry Schneider & Kent, Cell 1988, 54,

18 Green Fluorescent Protein (GFP, 238 AS) Shumpei Sakakibara 1998 Biological Chemistry ichiuchi et al. (1998) PAS, 95:

19 Größenlimitierung der chemischen Proteinsynthese - Ligationsreaktionen nicht beliebig oft nacheinander anwendbar - Problematische Aufreinigung - Ausbeuteverluste - Synthese wird unrentabel - Bisher keine Synthese von nicht-repeptitiven Proteinen > 250 Aminosäuren Lösung: Kombination von chemischer Protein- / Peptidsynthese mit Biosynthese von Proteinen (z.b. in E. coli). Biological Chemistry 19

- Bisher keine Synthese von nicht-repeptitiven Proteinen > 250 Aminosäuren Lösung: Kombination von

20 Eigene Beispielsysteme Biological Chemistry 20

21 Übetragbare Spongiforme Enzephalopathien (TSE) Transmissible spongiform encephalopathies (TSE) are fatal neurodegenerative diseases Prion diseases are exceptional: Spontaneous, hereditary and transmissible forms are recognized Bacteria Virus Prion Protein-only hypotheses: Resistant to nucleic acid inactivation Size 10-1 µm nm Sensitive to protein modifying procedures Proteinaceous infectious particles (prion); 1982 Prusiner Biological Chemistry 21

22 Prozessierung von PrP C und Umwandlung in PrP Sc Biological Chemistry Tatzelt & Winklhofer, Amyloid-Journal of Protein Folding Disorders (2004) 11,

23 Semisynthetischer Ansatz für membrangebundenes PrP c S S ER signal octarepeats PrP C 179 C214 GPI anchor GPI signal recombinant PrP Glycan Glycan S S PrP C 179 C lipid anchor Semisynthesis S S PrP C 179 C lipid anchor Protein Chemistry 23

24 Aggregation von lipidiertem PrP Proteinase K digestion Thioflavin T Assay AFM + liposomes - liposomes Membrane-associated rprp Palm shows an extended lag-phase. Biological Chemistry 24

25 Zusammenfassung - Lipidiertes Prion Protein durch Kombination chemischer & molekularbiologischer Methoden omogen hergestellt werden. - Dieses Prion Protein ermöglicht die Untersuchung der membranabhängigen Umwandlung in eine toxische Variante des Proteins - Komplexe Strukturen wie GPI-Anker können so in Proteine eingebracht werden und helfen Krankheitsprozesse zu verstehen - ächste Schritte: In vivo Untersuchungen Biological Chemistry 25

26 Silaffin-induzierte Biomineralisation von Kieselsäure diatoms are unicellular algae highly elaborate, nanopatternd cell walls consisting mainly of hydrated Si 2 long chain polyamines and silaffin peptides have been identified as constituents of biosilica and to be involved in the silica deposition process M. Sumper, E. Brunner, ChemBioChem 2008, 9, Biological Chemistry 26

27 atürliche posttranslationale Modifikationen von Silaffinen Chemical Structure of natsil-1a 1 ε-,-dimethyllysine ε-,,-trimethyl-δ-hydroxylysine 2 P 3 C C C C C 3 P P P P P P 3 C C3 phosphoserine C3 n = 4-9 n = 4-9 C 3 C 3 C 3 Polyamine modified lysine (6-11 -methylpropyleneimine units). Kröger, S. Lorenz, E. Brunner, M. Sumper, Science 2002, 298, Biological Chemistry 27

28 Zusammenfassung Synthese unterschiedlich modifizierter Silaffin-Peptide Einfluß der Silaffin-Modifikationen auf die Silikat-Abscheidung Immobilisierung biotechnologisch interessanter Proteine Proof of Principle: egfp Verknüpfung mit Silaffin führt zur selektiven Verkapselung von GFP in Silikatmatrix Biological Chemistry 28

29 Danksagung Uni Wien Alex Kravchuk Claudia Bello Carolin Lechner Firouzeh Aladini Manuel Brehs am Ky Chu Karine Farbiarz Can Araman Former Group Members: Diana lschewski Sunanda Lahiri Financial Support CIPSM DFG Wacker Chemie BMBF Collaborations Johannes Buchner (TU München) Tilo Schwientek (Uni Köln) Roger Goody (MPI Dortmund) Martin Engelhard (MPI Dortmund) Jörg Tatzelt (LMU München) Peter Seeberger (MPI Golm) Biological Chemistry 29

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