Transkription in Prokaryoten (Bakterien)

Transkript

1 Einführung Transkription in Prokaryoten (Bakterien) Transkription in Eukaryoten - Eukaryotische RNA-Polymerasen - Transkription durch RNA-Polymerase II - Transkription durch RNA-Polymerase I & III - Genregulation in Eukaryonten Eukaryotische RNA-Polymerasen RNA-Polymerase Ort Produkte RNA-Polymerase I Nucleolus 18S, 28S, 5.8S rrna RNA-Polymerase II Nucleoplasma mrna, U1, U2, U4, U5 snrna RNA-Polymerase III Nucleoplasma trna, 5S rrna, U6 snrna mt-rna-polymerase Mitochondrien alle mitochondrialen RNAs 1

2 Evolution von RNA-Polymerasen Eukarya Archaea Bacteria Prokarya Transkription ist evolutionär konserviert Untereinheiten von RNA-Polymerasen Bacteria Archaea Eukarya I II III β β 2x α β -ähnlich β-ähnlich α-ähnlich konserviert in Archaea und Eukarya nur in Archaea nur in Eukarya 2

3 Untereinheiten der RNA-Polymerase II in Hefen UE Größe (kd) Funktion E. coli Homolog RPB1 RPB2 RPB3 RPB4 RPB5 RPB6 RPB7 RPB8 RPB9 RPB10 RPB11 RPB12 Total 191,6 138,8 35,3 25,4 25,1 17,9 19,1 16,5 14,3 8,3 13,6 7,7 513,6 bindet DNA βʼ trägt CTD bindet NTPs β Assemblierung α nicht essential, Stress-Antwort Ziel von Aktivatoren Assemblierung ω nicht essential, Stress-Antwort nicht bekannt Selektion der Startstelle Proteinkinase Assemblierung α nicht bekannt Die größte UE der RNAP II besitzt eine spezielle C-terminale Domäne (CTD) Rpb1 = größte UE der RNAP II CTD Rpc1 = größte UE der RNAP III β' = größte UE der bakt. RNAP 3

4 Die größte UE der RNAP II besitzt eine spezielle C-terminale Domäne (CTD) CTD CTD spielt wichtige Rolle bei der Interaktion der RNAP II mit Aktivator- Proteinen und beim Übergang von der Initiations- zur Elongationsphase. Im Initiationskomplex ist CTD nur wenig phosphoryliert, und wird vor der Elongations-phase an den zahlreichen S- und T-Resten stark phosphoryliert. Dies bewirkt eine deutliche konformationelle Änderung der CTDs und ermöglicht den Übergang zur Elongationphase. Bakterielle und eukaryotische RNAPs haben eine ähnliche Architektur Bakterielle RNAP Hefe RNAP II β Rpb2 αι Rpb3 β' ω αιi Rpb1 Rpb11 Rpb6 ähnliche Gesamtstruktur ('Krabbenschere') vergleichbare Positionen der homologen UE im Komplex 4

5 Transkription durch RNA-Polymerase II Im Unterschied zum bakteriellen RNAP-Holoenzym benötigt die RNAP II von Eukaryoten an die 80 verschiedene Proteine (Faktoren) für die Anlagerung an Promotoren, und weitere Faktoren während der Elongation. -Struktur und Komplexität von mrnas -Promotor-Struktur von RNAP II-Genen -Allgemeine Transkriptionsfaktoren -Ausbildung des Präinitiationskomplexes -Elongation und Termination -Regulation der Transkriptionsinitiation Struktur eukaryotischer mrna Kappe 5ʼ 7mGppp 5ʼ-nicht-translatierte Region Initiation AUG translatierte Region 3ʼ-nicht-translatierte Region UGA Termination Polyadenylierungs-Signal AAUAAA (A) ~200 3ʼ poly(a)-schwanz - Alle mrnas haben eine 5ʼ-Kappe und einen poly(a)-schwanz (mit Ausnahme der mrnas für Histone). - Die 5ʼ-Kappe und der 3ʼ poly(a)-schwanz sind wichtig für die Stabilität und die Translation der mrna. 5

6 Regulatorische Elemente für die Transkriptionsinitiation Bakterien (prokaryotische RNAP) Promotor Regulator- Sequenz Hefen (eukaryotische RNAP II) Säuger (eukaryotische RNAP II) Grundelemente eukaryotischer Promotoren Promotorbereich ('core promotor') - Assemblierungsbereich für den Prä-Initiationskomplex - Bindestelle für allgemeine Transkriptionsfaktoren - bestimmt Startstelle und Richtung der Transkription - oft aktiv in vitro, aber inaktiv in vivo - nicht jedes Element kommt in jedem Promotor vor, ca. 65% aller Gene im Humangenom haben z.b. keine TATA-Box 6

7 Grundelemente eukaryotischer Promotoren TFIIB Recognition Element TATA Box INitiatoR Element Downstream Core Element Downstream Promoter Element Identifizierung der allgemeinen Transkriptionfaktoren (mit Hilfe eines in vitro-transkriptionssystems) Promotor Transkribierte Region Analyse der Transkripte (Gel-Elektrophorese) Transkript DNA-Matrize + gereinigte RNAP II + 32 P-NTPs, Mg 2+ + fraktionierte Kernextrakte hinzugefügte Kernfraktionen A B C D A B C A B A C B C Fraktionen A und C enthalten die notwendigen Faktoren Analyse durch weitere Fraktionierung 7

8 Allgemeine Transkriptionfaktoren der RNAP II TFIID besteht aus dem TATA-Bindeprotein und TAFs TAFs sind TBP-assoziierte Faktoren mit unterschiedlichen Funktionen: - TAF1 und TAF2: Erkennung von Inr-Elementen (wichtig in Promotoren ohne TATA-Box) - TAF1: Phosphorylierung und Acetylierung von Histonen - TAF6 und TAF9: Erkennung von DPE-Elementen - TAF4 (und andere): Interaktion mit stromaufwärts gebundenen Transkriptionsfaktoren N C TBP ist das TATA-Bindeprotein: - bindet an die TATA-Box in der kleinen Rinne und krümmt die DNA - ist mit den TAFs assoziiert TBP-DNA-Komplex +1 8

9 Aufbau des Prä-Initiationskomplexes (PIC) 1. Bildung des DAB-Komplex 3. Rekrutierung von TFIIF und TFIIH 2. Rekrutierung von RNAP II und TFIIF 4. Entwindung der DNA und Phosphorylierung des CTD (Ser 5 in YSPTSPS) 5. Übergang zur Elongation Die Initiation der Transkription erfordert zusätzliche Faktoren Mediator stellt Verbindung zwischen CDT und Aktivatoren her Chromatin-Remodelling-Maschinen und Chromatin-Modifizierende Komplexe verändern die lokale Chromatin-Struktur und Zugänglichkeit 9

10 Regulation der Transkriptionsinitiation In vivo wird der Prä-Initiationskomplex durch weitere Faktoren reguliert : - Gen-spezifische Regulator-Proteine (Transkriptionsfaktoren) binden an stromaufwärts gelegene Sequenzen und regulieren die Ausbildung des PIC durch direkte oder indirekte Interaktion mit der RNAP II. - Der Mediator-Komplex aus ca. 25 Proteinen vermittelt zwischen Regulator-Proteinen und und der RNAP II. - Chromatin-Remodeling-Komplexe und Histon-Acetyl-Transferasen (HAT) ermöglichen oder verhindern den Zugang zur DNA. Elongation Während der Elongation koordiniert der CTD wichtige Aktivitäten: - Interaktion der RNAP mit Elongationsfaktoren für Phosphorylierung des CTD an Ser 2 und für RNA-Korrekturlesen (TFIIS). - Interaktion der entstehenden Prä-mRNA mit Faktoren der RNA-Prozessierung Capping Enzyme: - RNA-Triophosphatase - Guanyltransferase - Methyltransferase Komponenten der Splicing-Maschine Polyadenylierung: - CPSF: AAUAAA-Erkennung und Schneiden - Poly(A)-Polymerase: Poly(A) n -Synthese Interaktion CTD Phosphorylierung p-tefb TFIIH (positive transcription elongation factor b) 10

11 CAPPING Addition von 7-Methyl-Guanosin 1: Abspalten des g-phosphats vom 5 Ende der mrna (RNA-Triphosphatase) 2: Übertragung GMP (Guanyltransferase) 3: Methylierung Guanin (Methyltransferase) Polyadenylierung Zwei Komplexe werden durch den CTD der Pol II eigebracht: CPSF (cleavage and polyadenylation factor) CstF (Cleavage stimulation factor) - CPSF und CstF binden a Poly- Signal-Sequenz und schneiden mrna - Poly-A Polymerase synthetisiert poly- A-Sequenz - poly-a-bindeprotein bindet an poly- A-Sequenz 11

12 Elongation durch Nukleosomenstruktur wird durch FACT (facilitates chromatin transcription) ermöglicht FACT entfernt ein H2A-H2B Dimer VOR der Polymerase und assembliert das Histon NACH der Polymerase wieder Termination -kein Rho-ähnlicher Faktor bekannt -nach erfolgter 3'-Prozessierung synthetisiert die RNAP II weiter und beendet die Transkription oft erst hunderte von Basenpaaren weiter stromabwärts!!!! Was beendet die Termination? 12

13 Termination 1. Theorie (Torpedo-Modell) Eine 5'-3'-Ribonuclease (Hefe: Rat1; Mensch: Xrn2) bindet nach der 3'- Prozessierung an die zweite mrna (nun ohne Kappe) und baut sie ab, was die Termination einleitet ("zieht" die RNA aus RNA-Pol II!?) Termination 2. Theorie Transfer der Prozessierungsenzyme vom CTD zur mrna führt innerhalb der RNAP II zu einer konformationellen Änderung, welche die spontane Termination begünstigt. 13

14 Transkription durch RNA-Polymerase I - RNAP I ist auf die Transkription von rrna-genen spezialisiert - Transkription findet im Nucleolus statt - rrna-gene kommen in Batterien von mehreren hundert Kopien vor - rrna entspricht bis zu 80% der Gesamt-RNA einer Zelle. NTS transkribiert NTS transkribiert NTS transkribiert Transkription 18S 5.8S 28S Prozessierung 18S 28S Transkription durch RNA-Polymerase I UBF UCE SL1 Promotor RNAP I transkribierte Region RNAP I Promotor besteht aus zwei Elementen Promotor ('Core') von Position -45 bis +20 'Upstream Control Element' (UCE) von Position -180 bis UBF UBF = Upstream Binding Factor = Aktivator SL1 SL1 besteht aus TBP (TATA-Bindeprotein) und 3 TAFs und bindet an das Kernelement 14

15 Transkription durch RNA-Polymerase III RNAP III ist zuständig für die Synthese kleiner RNAs - trnas - 5S rrna - bestimmte snrnas RNAP III-transkribierte Gene sind über das gesamte Genom verteilt trna-gene besitzen intragene Kontrollelemente Box A Box B Transkription von trna-genen TFIIIB TFIIIC Box A Box B RNAP III Transkriptionsfaktor TFIIIC bindet an BoxA und BoxB Transkriptionsfaktor TFIIIB besteht aus TBP und TAFs RNAP III 15

16 Die Rolle von TBP Ein TBP-ähnliches Protein ist essentiell für die Transkription in Archaeen! Vermutung: die drei eukaryotischen RNA-Polymerasen stammen von einem gemeinsamen Vorläufer ab, der bereits TBP verwendet hat. 16