Mikrobiologie 2. Vertretung. Prof. Dr. Nicole Frankenberg-Dinkel. Dr. Susanne Zehner. Follow us on:

Transkript

1 Mikrobiologie 2 Prof. Dr. Nicole Frankenberg-Dinkel Vertretung Dr. Susanne Zehner Follow us on:

2 Transkription Kontrolle der Transkription Translation

3 Wiederholung Transkription Erster Schritt der Expression der genetischen Information DNA RNA ( Protein) Die Sequenz eines DNA-Abschnittes wird umgeschrieben transkribiert und ein RNA-Molekül mit komplementärer Sequenz erzeugt. Synthese von RNA DNA RNA RNA-Pol 3 5 Taschenlehrbuch Biologie Genetik, ed. K. Munk, Thieme Verlag, 2010

4 Die bakterielle RNA-Polymerase +1

5 Regulation der RNA Polymerase durch s Faktoren a a 2 a 2 b a 2 bb = Kernenzym ai aii b b KERNENZYM Sequenz-unabhängig, Unspezifische Initiation der Transkription + s 70 vegetativ (hauptsächlicher s) s 32 Hitzeschock (für Notfälle ) s 54 Stickstoffmangel (für Notfälle ) SIGMA UNTEREINHEIT austauschbar, Promotorerkennung

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7 Promotorbereiche in E. coli

8 Die Transkriptionsinitiation

9 Die Transkriptionsinitiation

10 Die Elongationsphase

11 Termination der Transkription Rho-unabhängig Rho-abhängig

12 Die Transkriptions-termination

13 Die Transkriptions-Termination

14 Termination der Transkription-Rho-unabhängig

15 Transkription (Vergleich der Königreiche) Bakterien Archaea Eukaryoten RNAP ein Typ + Sigma-Faktor Promotor ein Typ (wie eukaryotische RNA pol.ii) + Kofaktoren RNA pol. I: rrna RNA pol. II: mrna RNA pol. III: trna viele Kofaktoren Initiator-Element Transkript monocistronisch oder polycistronisch monocistronisch oder polycistronisch monocistronisch Exons/Introns Terminator - Rho-abhängig - stem-loop, UA Stem-loop, UA??????????? gekoppelt an RNA- Prozessierung

16 RNA-Polymerasen der Archaea gleichen der eukaryotischen RNA-Pol. II mind. 10 UE + TATA-Box Bindeprotein + Transkriptionsfaktor B

17 Wiederholung Transkription 3 Schritte Initiation: Beginn der Transkription Erkennung der Promotorsequenz RNA-Polymerasen, geschlossener/ offener Komplex Elongation: RNA-Synthesephase Verlängerung der RNA-Kette Polymerase-DNA-RNA-Komplex Termination: Abschluss der Transkription Auflösung des Komplexes aus Enzym-DNA-RNA Terminatoren Knippers, Molekulare Genetik, Thieme Verlag

18 Molekulare Regulation-Genregulation Kontrolle der Transkription Kontrolle der mrna Stabilität Kontrolle der Translation Posttranslationale Modifikation

19 Grundlagen der Genregulation Ein Bruchteil der Gene sind ständig aktiv: konstitutive Expression Bestimmte Gene bei Bedarf an/abschalten: Genregulation Abhängig von Wachstumsphase, Nährstoffangebot, Umweltbedingungen Jedes Gen ist auf seine eigene Art reguliert Gene an verschiedenen Gen-Orten die unter gemeinsamer Kontrolle stehen: Regulon

20 1. Transkriptionskontrolle Genregulation Die Aktivität der RNA-Polymerase wird beeinflusst bei Erkennung der Promotorsequenz Initiation der Transkription Effizienz der Transkription Munk, Taschenlehrbuch Biologie, Genetik, Thieme Verlag

21 Steuerung der RNA-Polymerase durch σ- Faktoren RNA-Polymerase- Kernenzym core Sigma-Untereinheit ai aii b b + s 70 / vegetativ RpoD s 32 / Hitzeschock RpoH s 54 Stickstoffmangel RpoN + zahlreiche weitere Sigmafaktoren, z.b. σ38 (RpoS), σ24 (rpoe) Spezifische Promotorerkennung

22 Transkriptionskontrolle durch alternative Sigma-Faktoren Beispiel: Hitzeschockantwort in E. coli Bei Temperaturerhöhung C: über 40 Proteine verstärkt synthetisiert Hitzeschock-Proteine HSP: u.a. molekulare Chaperone (DnaJ, DnaK, GroESL) helfen bei Proteinfaltung und Renaturierung Wie kommt es zur verstärkten Bildung der HSP? Alternativer Sigmafaktor: σ 32, σ H, RpoH Aktiviert Hitzeschock-Promotoren mit eigener Erkennungssequenz im Promotorbereich Promotor Standard σ70 TCTTGAC nt - TATAAT Heat shock σ32 CCTTGAA nt - CCCCAT

23 Transkriptionskontrolle durch alternative Sigma-Faktoren Regulation der Hitzeschockantwort durch RpoH/σ 32 P1 P3 P4 P5 rpoh mrna Abbau 30 C t 1/2 = 30 s s C ai aii b b RNA-Pol. Inhibiert die Translation von rpoh fördert Abbau von σ 32 hemmt Komplex mit RNA-Pol + P HS Aktivierung der Hitzeschockgene dnaj DnaJ Negative Rückkopplung Knippers, Molekulare Genetik, Thieme Verlag

24 1. Transkriptionskontrolle Genregulation Die Aktivität der RNA-Polymerase wird beeinflusst bei Erkennung der Promotorsequenz Initiation der Transkription Effizienz der Transkription Munk, Taschenlehrbuch Biologie, Genetik, Thieme Verlag

25 Transkriptionskontrolle durch Regulatoren Membran Signal Einkomponentensystem Zweikomponentensystem Signal input Phosphorelais in Bakterien Signal input input Regulator output DNA- Bindung Genregulation P H D Receiver Transmitter output DNA- Bindung Genregulation P P P H D H D Transmitter Receiver Überträger output DNA- Bindung Munk, Taschenlehrbuch Biologie, Genetik, Thieme Verlag Genregulation

26 Transkriptionskontrolle durch Regulatoren Aktivatoren und Repressoren Positive und negative Kontrolle der Genexpression 5 3 UAS RNA-Polymerase- Bindestelle Operator Promotor +1 ATG -35 region -10 region + _ Aktivator Repressor UAS: upstream activator sequences Munk, Taschenlehrbuch Biologie, Genetik, Thieme Verlag

27 Transkriptionskontrolle durch Regulatoren Aktivatoren und Repressoren Positive Kontrolle Negative Kontrolle Bindung des Aktivators an den Promotor/ activator site UAS Aktivierung der Transkription Induktion Coaktivator: kleines Signalmolekül das die Bindung des Aktivators an die DNA moduliert Bsp. CAP/CRP, NodD Munk, Taschenlehrbuch Biologie, Genetik, Thieme Verlag Bindung des Repressors an den Promotor/ Operator Unterdrückung der Transkription Repression Induktor: kleines Signalmolekül, dass die Ablösung des Repressors von der DNA bewirkt. Derepression = Aktivierung der Transkription Bsp. TetR, LacI

28 Transkriptionskontrolle durch Regulatoren Repressoren 5 3 UAS Promotor Operator +1 ATG -35 region -10 region Repressor Repressor (oft Dimere/Tetramere) sind fest an DNA gebunden, an Operator: palindromische Sequenz Bsp. CTATCATTGATAG (für TetR-Typ) O: überlappt meist mit dem Promotor der Gene Verdeckt den Promotor (3-D Struktur) Repressor verhindert die Bindung der RNA-Polymerase Keine Transkription

29 Transkriptionskontrolle durch Regulatoren Repressoren (TetR-Typ) Repressor ist an Operatorsequenz gebunden Transkription ist reprimiert Bindung der Induktoren an den Repressor Ablösung des Repressors vom Operator Transkription wird aktiviert

30 Transkriptionskontrolle durch Regulatoren Aktivatoren 5 3 UAS Promotor Operator +1 ATG Aktivator -35 region -10 region Bindung des Aktivators an die UAS führt zur Beugung der DNA Aktivator interagiert mit der RNA-Polymerase Verstärkt die Bindung der RNA-Pol am Promotor Stabiler Komplex am Promotor: verstärkt die Transkription

31 Transkriptionskontrolle durch Regulatoren Wechselwirkung des Aktivatorproteins CRP mit der RNA-Polymerase

32 Transkriptionskontrolle durch Regulatoren Membran Signal Einkomponentensystem Zweikomponentensystem Signal input Phosphorelais in Bakterien Signal input input Regulator output DNA- Bindung Genregulation P H D Receiver Transmitter output DNA- Bindung Genregulation P P P H D H D Transmitter Receiver Überträger output DNA- Bindung Munk, Taschenlehrbuch Biologie, Genetik, Thieme Verlag Genregulation

33 Transkriptionskontrolle durch Regulatoren Zweikomponenten-Regulatorsystem Sensorkinase besteht aus: Sensordomäne meist membranlokalisiert empfängt Umweltsignal Histidinkinasedomäne cytosolisch autophosphorylierung an His-Rest anschl. Transfer des Phosphat auf Antwortregulator (Asp-Rest) Antwortregulator: DNA-bindendes Protein aktiv nach Phosphorylierung eines konservierten Asp-Restes Spezifische Phosphatase zur Deaktivierung des Regulators

34 Transkriptionskontrolle durch Regulatoren Abgestufte Genregulation bei Bakterien Beispiel: Lactose-Verwertung in E. coli

35 Transkriptionskontrolle durch Regulatoren Gene der Lactoseverwertung in E. coli - Das lac-operon - Operon: Ein oder mehrere Gene, die in eine einzige RNA transkribiert werden und unter der Kontrolle einer einzigen regulatorischen Stelle liegen. LacI mrna Repressor

36 Transkriptionskontrolle durch Regulatoren Kontrolle der Transkription durch LacI-Repressor Repressor LacI Modell von Jacob und Monod 1961

37 Diauxie

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39 Positive Kontrolle der Transkription durch Aktivatorproteine

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41 Regulation des lac-operons durch Glc-Repression

42 Katabolitregulation oder Glucoserepression Glc-Mangel: EIIA~P hoch -> Stimulation der Adenylatcyclase

43 Transkriptionskontrolle durch Regulatoren Katabolit- bzw. Glucose-Repression Positive Regulation am Beispiel des lac-operons E. coli bevorzugt Glucose als Energie und C-Quelle Bei Glucose-Mangel steigt camp Konzentration in der Zelle Adenylatcyclase: ATP camp+ppi Aktivatorprotein für Zuckerverwertung: CRP (camp-rezeptorprotein) auch CAP (catabolite activator protein) camp bindet an CRP und ist Coinduktor

44 Transkriptionskontrolle durch Regulatoren Verallgemeinerungen für Bakterien Gene liegen häufig in Operons vor polycistronisch von einem Promotor aus transkribiert koordinierte Expression zusammengehöriger Gene konstitutive Expression: Effizienz von der Promotor-sequenz abhängig: starke/ schwache Promotoren regulierte Expression: Abhängig von bestimmten Sigmafaktoren Negative Regulation für viele σ 70 -abhängige Promotoren Positive Regulation, Aktivatorbindung an DNA für RNA-Pol- Interaktion notwendig

45 Molekulare Regulation-Genregulation Kontrolle der Transkription Kontrolle der mrna Stabilität Kontrolle der Translation Posttranslationale Modifikation

46 Regulatorische RNAs Kleine RNAs (small RNAs)- befinden sich in intergenischen Regionen, regulieren Transkription oder mrna Stabilität cis-antisense RNAproduziert vom Sinn-Strang eines Protein-kodierenden Gens Bindet Ziel mrna und führt dadurch zur Stabilisierung oder zum Abbau RNA Thermometer- Bilden Sekundärstruktur in der 5 -untranslatierten Region der mrna um die SD-Sequenz Verhindern Bindung des Ribosoms Temperaturerhöhung führt zum Aufschmelzen und zur Binden des Ribosoms

47 Vorhergesagte srnas in E. coli

48 Loop-loop- Interaktion Modell für srna Funktion

49 RNA Thermometer

50 Begriffe und Aufgaben Was ist: ein Regulon ein Operon ein Sigma-Faktor ein Promotor eine polycistronische RNA ein Operator Induktor, Aktivator, Repressor Katabolitrepression Regulatorische RNA Erklären Sie positive und negative Regulation des lac-operons! Erklären sie die Funktion alternativer Sigmafaktoren anhand der Hitzeschock- Antwort bei E. coli!