Modul 4 SS Western Blot. Tag 1: Proteinbestimmung, SDS-PAGE-Gel-Herstellung S. 3. Tag 2: Gelelektrophorese, Western Blot, Blockierung S.

Transkript

1 Modul 4 SS 2015 Western Blot Tag 1: Proteinbestimmung, SDS-PAGE-Gel-Herstellung S. 3 Tag 2: Gelelektrophorese, Western Blot, Blockierung S. 6 Tag 3: Detektion der Proteine auf der Membran S. 10 1

2 Über das Praktikum: Es ist das Ziel dieses Praktikumsteils, das Prinzip und die Möglichkeiten einer Western Blot Analyse zu verdeutlichen. In einer begleitenden Vorlesung werden wir viel mehr Informationen geben, als nur die für die Durchführung des Versuches notwendigen. Damit möglichst jeder praktisch arbeiten kann, werden wir die Gruppen in zwei bis drei Untergruppen unterteilen. DAS GESAMTE SKRIPT MUSS VOR DEM KURS GELESEN WERDEN! Zu den Praktika sind mitzubringen: - gebundenes Protokollheft, Schreibzeug - Labormantel - Taschenrechner - Lineal - kleines Notizheft, das in die Labormanteltasche passt 1

3 Hintergrund Wir werden in diesem Versuch ein mit einem His-Tag versehenes Protein auf einem Western- Blot detektieren. Dafür können wir auf kommerziell erhältliche Antikörper zurückgreifen. Es gibt eine Reihe von kurzen Epitopen, die an Proteine angehängt werden können, um eine Detektion mit vorhandenen Antikörpern zu ermöglichen. Der His-Tag bietet zusätzlich noch die Möglichkeit ihn für eine Reinigung des Proteins über eine Nickel-beschickte Säule zu nutzen. Neben den essentiellen Komponenten des Western Blottings haben wir auch noch eine Protein-Bestimmung voran gestellt. Somit können Sie selber errechnen, wie viel Protein auf das SDS-PAGE Gel aufgetragen werden muss. Auch wenn einige von Ihnen eine Bradford-Quantifizierung bereits durchgeführt haben, ist es trotzdem eine gute Übung das Experiment wieder und wieder durchzuführen. Sollten Sie die Analyse bereits einmal durchgeführt haben, so versuchen sie doch möglichst ohne externe Anleitung durch das Experiment zu finden. Viel Spaß! 2

4 TAG 1 1. Protein-Bestimmung Benötigte Materialien: Bradford-Reagenz: 100 mg Coomassie brilliant blue G 250 (0.01 % (w/v)), lösen in 100 ml konz. Phosphorsäure (Endkonzentration: 8,5 %), 50 ml Ethanol (Endkonzentration: 5 % (v/v)), auffüllen mit H 2 O auf 1 l und anschließend filtrieren mit Faltenfilter, dunkel und kühl lagern. Durchführung: Der Proteingehalt der erhaltenen Periplasmapräparation und der positiv Kontrolle wird nun nach der Bradford-Methode bestimmt. Die Bradford-Methode zur Bestimmung der Proteinkonzentration beruht darauf, dass Coomaasie-Farbstoff (Brilliant Blue G250) aufgrund zweier Eigenschaften an die Proteine im Sauren bindet: Der Triphenylmethanrest bindet an die unpolaren Bereiche der Proteine und die anionischen Sulfonat-Gruppen interagieren im Sauren mit den kationischen Seitenketten (Arg-/Lys-Reste). Der Farbwechsel, der bei der Bindung des Farbstoffes an Proteine auftritt, ermöglicht eine Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration. Die Methode ist zwei- bis dreimal empfindlicher als die Lowryoder BCA-Methode. Folgende Verbindungen stören: Detergenzien wie Triton, SDS, Desoxycholat. Zur photometrischen Bestimmung der Proteinkonzentration (µg/µl) werden die Proben parallel zur Eichgerade in den Bradfordtest eingesetzt. Zur Erstellung der Eichgerade verwenden wir Rinderserumalbumin (BSA bovine serum albumin ). Der Test ist auf Eppendorfgefäße ausgelegt. Die Bradford-Reagenz wird zur Verfügung gestellt. Überlegen Sie mit ihren Betreuern, ob sie die Proteinlösungen verdünnen müssen. Alle Tests sollen als Doppelbestimmungen durchgeführt werden. Je 20 µl der (verdünnten) Extraktlösungen und der Proteinstandard-Lösungen (0; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 µg/µl Protein, Doppelbestimmungen) werden in eine Mikrotiterplatte vorgelegt. Anschließend werden mit einer Mehrkanalpipette je 180 µl Bradford-Reagenz zugegeben. Die Messung der Proben erfolgt bei 595 nm. Zur Auswertung werden die Proteinkonzentrationen der verdünnten Extrakte an der BSA-Eichkurve abgelesen und die Proteinkonzentration (µg/µl) der Ausgangslösungen unter Einbeziehung des Verdünnungsfaktors berechnet 2. SDS-Polyacrylamid-Gele vorbereiten Die SDS-Gelelektrophorese (SDS = Natrium-Dodecylsulfat) wird zur Auftrennung der Proteine durchgeführt. Für die diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese (nach Laemmli, 1970) werden 10%ige Trenn- und 4%ige Sammelgele verwendet. 3

5 Stammlösungen (werden zur Verfügung gestellt): Ammoniumpersulfatlösung Acrylamid-Stammlösung: 100mg/ml 30% (w/v) Acrylamid 0,8% (w/v) Methylenbisacrylamid Trenngelpuffer (1 l-ansatz): 1,5 M Tris/HCl ph 8,8 Sammelgelpuffer (1 l-ansatz): 1,0 M Tris/HCl ph 6,8 SDS-Stammlösung (80 ml Ansatz): TEMED 10% (w/v) SDS fertige Lösung Probenpuffer (6-fach konzentriert; 20 ml Ansatz): 1,5 ml 1 M Tris/HCl ph 6,8 6 ml 10% SDS 6,5 ml Glycerin 3 ml Mercaptoethanol 3 ml 0,5% Bromphenolblau Elektrodenpuffer 3 g Tris/HCl ph 8,8 14,4 g Glycin 1 g SDS mit Aq dest. auf 1000 ml auffüllen Isopropanol zum Überschichten Zusammensetzung der Trenn- und Sammelgele (Ansatz für ein kleines Gel): 10 %iges Trenngel: 3 ml Acrylamid-Stammlösung 2,25 ml Trenngelpuffer 90 l SDS-Stammlösung 3,66 ml H 2 O 9 l TEMED (N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin) 45 l APS (Ammoniumperoxodisulfat) 4 %iges Sammelgel: 0,825 ml Acrylamid-Stammlösung 0.75 ml Sammelgelpuffer 60 l SDS-Stammlösung 4,35 ml H 2 O 7,5 l TEMED 30 l APS 4

6 Gelherstellung. Die Gelgieß-Apparatur wird nach Anleitung zusammengebaut. Die Lösungen für die 4%igen und 10%igen Gele werden nach den obigen Angaben ohne TEMED und APS in kleinen Bechergläsern zusammen pipettiert. Anschließend werden TEMED und APS zur 10%igen Gellösung hinzugegeben, um die Polymerisation zu starten. Gleich darauf wird das 10 %ige Trenngel zwischen zwei gereinigte und entfettete Glasscheiben gefüllt und dann mit Isopropanol überschichtet. Nach 30 min ist das Gel vollständig auspolymerisiert. Das überstehende Isopropanol wird abgekippt und die Gelgieß-Apparatur anschließend aufrecht aufgestellt, damit das verbliebene Isopropanol abdampfen kann. TEMED und APS werden zur Sammelgellösung gegeben. Die fertige Sammelgellösung (s. o.) wird eingefüllt und der Taschenformer eingesetzt. Nach erfolgter Polymerisation ( 30 min) werden die Gele in feuchte Zellstofftücher und abschließend in Plastikfolie eingewickelt und bis zum nächsten Kurstag bei 4 C im Kühlschrank gelagert. Die Gele halten sich über mehrere Tage bis Wochen. 5

7 TAG 2 3. Probenvorbereitung und SDS-Gelelektrophorese Es werden von den zu analysierenden Periplasmapräparation 12,5, 25 und 50 µg Protein auf das Gel aufgetragen. Die Positivkontrolle ist ein gereinigtes Protein mit His-Tag. Davon werden 5 µg geladen. Als Negativkontrolle verwenden wir Zellextrakt des verwendeten S. oneidensis Stammes (natürlich ohne mit His-Tag exprimiertes c-typ Cytochrom), von dem 50 µg aufgetragen werden. Als Standard werden 6 µl eines kommerziell erhältlicher Proteinmarker aufgetragen. Alle Proben werden in einem Eppendorfgefäß mit 1,0 M Tris/HCl-Puffer ph 6,8 auf den gewünschten Proteingehalt verdünnt, mit 6-fach Probenpuffer entsprechend versetzt, damit ein Gesamtvolumen von 20µl vorliegt. Zur vollständigen Denaturierung werden die Proben 5 min im Wasserbad bei 95 C erhitzt. Pro Tasche werden 20 µl Probe aufgetragen. Der Auftrag sollte in folgender Reihenfolge erfolgen: Tabelle 1: Beladungsschema für das SDS-Gel Marker 6 µl Positiv- Kontrolle 5 µg Protein- Fraktion 12,5 µg Protein- Fraktion 25 µg Protein- Fraktion 50 µg Negativ- Kontrolle 50 µg Elektrophoresebedingungen. Die Elektrophorese erfolgt bei Raumtemperatur und konstant gehaltener Spannung. Beim Einwandern der Probe ins Sammelgel werden 100 V vorgewählt. Sobald die Lauffront ins Trenngel eingewandert ist, wird auf 150 V umgestellt. Die Elektrophorese wird gestoppt, wenn sich die Farbfront ca. 2 mm vor Gelende befindet. Während das Gel läuft bereiten wir den Western Blot vor 4. Western-Blot Denaturierte Proteine, die im SDS-Gel nach der Größe aufgetrennt wurden, werden bei diesem Verfahren durch Anlegen eines elektrischen Feldes auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen und fixiert. Dort können die Proteine dann detektiert werden. Zum Proteintransfer dient das Semi-Dry-Verfahren. 6

8 Zur Verfügung gestellte Lösung: Blotting-Puffer Ponceau-S-Lösung Tris 40 g Glycin 20 g Methanol 50 ml Ethanol 150 ml mit Aq. dest. auf 1000 ml auffüllen 1 g Ponceau-S 5 ml Essigsäure mit Aq. Dest. auf 1000 ml auffüllen Für den Proteintransfer werden 14 Filterpapierbögen und 1 Nitrocellulose-Streifen auf die Maße des SDS-Geles (8 x 6 cm) zugeschnitten (Handschuhe!!). Auf die mit H 2 O benetzte Anode der Blotting-Aparatur werden nacheinander folgende Lagen gestapelt: 1) sieben in Blotting-Puffer getränkte Whatmanpapiere 2) die Nitrocellulose-Membran, die zunächst in H 2 O, kurz vorher aber in Blotting-Puffer getunkt wurde; 3) das SDS-Gel, bei dem das Sammelgel abgetrennt wurde; 4) sieben weitere, in Blotting-Puffer getränkte Whatmanpapiere. 7x Filterpapier 7x Filterpapier Abb. 1: Schematischer Aufbau des Semi-Dry-Blot. 7

9 Dann wird die Kathode aufgelegt und der Proteintransfer bei einer konstanten Stromstärke von 1,3 A bei 25 V für 12 min durchgeführt. Zur Kontrolle des Proteintransfers wird die geblottete Nitrocellulosemembran für 2 min in ca. 100 ml der bereitgestellten Ponceau S- Lösung getaucht und anschließend zur Entfärbung der proteinfreien Bereiche für etwa 10 min mit demineralisiertem Wasser gewaschen. Anschließend wird mit der Geldoc-Anlage ein Bild der gefärbten Membran aufgenommen. Ponceau-Lösung 99,5% (v/v) einer 0,1%igen (w/v) Ponceau S-Lösung 0,5% (v/v) Eisessig 5. Nachweis von His-Tag markiertem Protein Der sog. His-Tag ist ein Peptid aus 6 oder mehr Histidinresten. Die kodierende DNA-Sequenz für einen His-Tag kann man an die Gensequenz des zu untersuchenden Proteins anhängen. Man erhält so ein rekombinantes Protein mit einem N- oder C-terminalen His-Tag. Ein His- Tag wird in den meisten Fällen für eine Proteinreinigung verwendet, er kann aber auch als Nachweis für ein Protein dienen, für das kein passender Antikörper vorhanden ist. Wir detektieren den His-Tag mit einem primären Antikörper der Firma AbD serotechund einem sekundären Antikörper der Firma Sigma. Der primäre Antikörper, der Anti-His-Antikörper, wurde aus der Maus isoliert und erkennt den His-Tag. Der sekundäre Antikörper, der Anti- Maus-Antikörper, wurde aus der Ziege isoliert und bindet an den primären Antikörper. Der Anti-Maus-Antikörper trägt eine Alkalische Phosphatase. Das Enzym Alkalische Phosphatase hydrolysiert 5-Brom-4-chlor-3-Indoxylphosphat (BCIP) zu 5-Brom-4-chlor-Indoxyl und Phosphat. Das 5-Brom-4-chlor-Indoxyl wird durch Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT) zum tiefblauen Farbstoff 5,5'-Dibrom-4,4'-dichlor-Indigo oxidiert. 8

10 Abb. 2: NBT und BCIP vermittelte Farbreaktion. Blockieren: Die Nitrocellulose Membran wird 2x für 10 min mit TBS-Puffer gewaschen und anschließend über Nacht in Blocking-Puffer bei 4 C inkubiert, um unspezifische Bindestellen abzusättigen. TBS-Puffer Tris 1,21 g NaCl 8,77 g ph auf 7,5 mit HCl einstellen, ad 1000 ml mit A. dest. auffüllen Blocking-Puffer TBS-Puffer + 3% (w/v) BSA 9

11 TAG 3 6. Detektion Die Membran wird für 10 min mit TBS-Puffer bei Raumtemperatur gewaschen. Daraufhin wird die Membran mit 20 ml Anti-His-Antikörper in Blocking-Puffer (1:1000) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird die Antikörperlösung in ein 50 ml Falcontube überführt und bei -20 C gelagert. Die Membran wird danach 2x Mal für 10 min in TBS-Tween/Triton-Puffer bei Raumtemperatur gewaschen. Der Anti-Maus-Antikörper wird mit 3% (w/v) Magermilchpulver in 15 ml TBS 1:7500 verdünnt. Die Membran wird für eine Stunde mit dem sekundären Antikörper inkubiert. Anschließend wird die Membran 4x mit TBS/Tween-Puffer für 5 min gewaschen. Die Membran wird nun 5x für 2 min mit bidestilliertem Wasser gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wird die Membran auf eine saubere Plastikoberfläche gelegt ohne die Membran austrocknen zu lassen. 4 ml BCIP/NBT Lösung werden zur Membran gegeben (ausreichend für 10x10cm Membran) und es wird für 1-10 min bei Raumtemperatur inkubiert. In diesem Zeitraum sollten die gewünschten Proteinbanden erkennbar werden. Sind diese in ausreichendem Maße sichtbar, wird die Entwicklungsreaktion mit bidestilliertem Wasser gestoppt. Anschließend wird die Membran für 5 min in bidestilliertem Wasser gewaschen. Von der entwickelten Membran wird mithilfe der Geldoc-Apparatur ein Bild aufgenommen. 10

12 TBS Tween Triton (ph 7,5) Tris 2,42 g NaCl 29,2 g Tween µl Triton X100 2 ml ad. 1 l mit A. dest. TBS Tween (ph 7,5) Tris 2,42 g NaCl 29,2 g Tween µl ad 1 l mit A. dest. 11