Biochemisches Praktikum 1 Protein-Analytik Praktischer Teil

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1 Biochemisches Praktikum 1 Protein-Analytik Praktischer Teil

2 Inhaltsverzeichnis Sicherheitshinweise Protein-Analytik 1 Arbeitshinweise Protein-Analytik 2 Ionenaustauschchromatographie 3 GFP-Reinigung Materialien 5 GFP-Reinigung Umpuffern und Verdünnen 6 GFP-Reinigung Säulenchromatographie 7 GFP-Reinigung Aufgabenstellung 1 9 Beispiel Arbeitsblätter Testläufe 10 Arbeitsblätter Testläufe 12 GFP-Reinigung GFP Detektion, Bradford-Assay 16 GFP-Reinigung Bradford Assay 17 GFP-Reinigung Aufgabenstellung 2 19 Arbeitsblätter quantitative Reinigung 20 Auswertung GFP-Reinigung 23 Taq-Polymerase Reinigung 24 Taq-Reinigung Zellaufschluss, AS-Fällung 25 Taq-Reinigung AS-Fällung, Affinitätsreinigung 27 Taq-Reinigung Dialyse 29 SDS-Gelelektrophorese 30 Taq-Reinigung SDS-Gel 31 Induzierte Genexpression 34 Induzierte Genexpression Duchführung 36 Induzierte Genexpression SDS-Gelelektroporese 38 Proteingrößenstandard 42 Anzusetzende Puffer 43 Vorhandene Puffer 44 Protokoll zum Grundpraktikum 45

3 Sicherheitshinweise Protein-Analytik o o o o o o Sicherheitshinweise: - Taq-Reinigung β-mercaptoethanol ist gesundheitsschädlich und riecht schlecht ; Arbeiten mit β-mercaptoethanol immer im Abzug durchführen; Abfälle, die β-mercaptoethanol enthalten, in Sondermüllbehältern sammeln (wässrige Abfälle)! Spitzen/Plastikgefäße, die mit β-mercaptoethanol kontaminiert sind, im Abzug in Abfallbehältern sammeln und vor der Entsorgung mindestens 24 h abdampfen lassen! Für Arbeiten mit DTT gelten die gleichen Vorsichts- und Entsorgungsmaßnamen wie für β-mercaptoethanol Viele Puffer der Taq-Reinigung enthalten β-mercaptoethanol oder DDT! Bakterienabfall immer im Autoklavierabfall entsorgen; Nicht benötigte Bakterienkulturen in Autoklavierkiste stellen; Mit Bakterien verunreinigte Glasgefäße zum Autoklavieren stellen; Induzierte Genexpression o Der 1 x SDS Puffer enthält DTT - Sicherheitshinweise (siehe oben) beachten! o Bakterienabfall immer im Autoklavierabfall entsorgen; o Nicht benötigte Bakterienkulturen in Autoklavierkiste stellen o Mit Bakterien verunreinigte Glasgefäße zum Autoklavieren stellen SDS Gelelektrophorese: o Der 1 x SDS Puffer enthält DTT Sicherheitshinweise beachten! o Eluierte Proben können β-mercaptoethanol enthalten Sicherheitshinweise beachten! o Acrylamid ist toxisch (Nervengift) und möglicherweise kanzerogen; Hautkontakt vermeiden; beim Arbeiten mit Acrylamid-Lösungen IMMER Handschuhe tragen und im Abzug arbeiten, da Acrylamid auch in Lösung einen hohen Dampfdruck hat und in die Raumluft gelangt. o Acrylamidgele im Abzug gießen, Gellösung im Abzug pipettieren; Acrylamidgele im Abzug polymerisieren; die fertigen Gele werden am Platz gefahren; o vertropfte Acrylamid-Lösung sofort mit einem Papiertuch aufnehmen, NICHT eintrocknen lassen; Papiertuch in blauer Tonne für Feststoffabfall entsorgen; o Festes SDS ist - wenn es nicht zu Pellets gepresst ist - sehr feinpulverig; SDS Staub schädigt die Lunge; Staubbildung unbedingt vermeiden, unter dem Abzug abwiegen und in Lösung bringen; SDS-Kristalle sofort mit feuchtem Tuch aufnehmen; Bradford Assay o Bradford-Reagenz enthält Phosphorsäure, Hautkontakt vermeiden; bei Kontakt mit Haut oder Augen sofort abwaschen (Augendusche!) o Abfall gesondert sammeln, entsorgen im Sonderabfall (wässrige Abfälle) 1

4 Arbeitshinweise Protein-Analytik Allgemeine Arbeitshinweise: o während der Arbeit Handschuhe tragen o für jeden Pipettierschritt frische Spitze verwenden o Entsorgungsanweisungen für β-mercaptoethanol und DTT beachten o Eppis eindeutig beschriften (Edding) o Arbeitsanweisungen für Acrylamid beachten o Plastikröhrchen eindeutig beschriften (Edding) Gruppennummer, Bakterienstamm, induziert (+/-) 2

5 Ionenaustauschchromatographie Proteinreinigung durch Ionenaustauschchromatographie Abhängig von ihrer Aminosäurezusammensetzung weisen Proteine eine spezifische Eigenladung auf. Je nach Eigenladung kann ein Protein an negativ geladenen Materialen (wenn es selber positiv geladen ist) oder an positiv geladenen Materialien (wenn es selber negativ geladen ist) binden. Diese Eigenschaft kann man nutzen, um Proteine durch Ionenaustauschchromatographie zu reinigen. Für die Ionenaustauschchromatographie werden inerte, ungeladene Gelmatrices (Sepharose, Superose ) verwendet, an die geladene Gruppen kovalent gebunden sind. Kationenaustauscher haben negativ geladene Gruppen (z.b. Carboxylgruppen) an die Matrix gekoppelt und binden positiv geladene Teilchen. Anionenaustauscher haben positiv geladene Gruppen (z.b. Ammoniumgruppen) an die Matrix gekoppelt und binden negativ geladene Teilchen. Die Gelmatrix mit den geladenen Gruppen wird in einem Puffer mit geringer Ionenstärke resuspendiert und mit diesem Puffer equilibriert. Im Beispiel rechts ist ein Anionenaustauscher gezeigt. An die Matrix sind positiv geladene Gruppen gebunden, die Gegenionen stammen aus dem Laufpuffer. Der Laufpuffer enthält eine Pufferkomponente zur Einstellung des ph Werts und eine niedrige Konzentration an Salz, in der Regel NaCl oder KCl. Die Cl - Ionen aus dem Laufpuffer binden als Gegenionen an die positiv geladenen Gruppen der Matrix. Das zu trennende Proteingemisch wird im Laufpuffer auf das Säulenmaterial aufgetragen. Die negativ geladenen Proteine verdrängen die Cl - Ionen von den positiven Gruppen an der Matrix, binden an diese und werden so auf dem Säulenmaterial festgehalten. Neutrale oder positiv geladene Proteine binden nicht an das Säulenmaterial und werden mit dem Puffer durch die Säule gespült. Nachdem alle nicht bindenden Proteine durch das Säulenmaterial gewaschen wurden, können die gebundenen Proteine durch Erhöhung der Ionenstärke im Puffer wieder vom Säulenmaterial gelöst werden. Die Erhöhung der Ionenstärke im Puffer erreicht man in der Regel durch Erhöhung der Salzkonzentration. Durch stufenweise Erhöhung der Salzkonzentration können erst schwach an die Säulen gebundene, mit steigender Salzkonzentration im Puffer, stark an die Säule gebundene Proteine, schrittweise von der Säule eluiert werden. Auf diese Weise werden Proteine nach ihrer Ladung voneinander getrennt. >>steigende Salzkonzentration>> 3

6 Ionenaustauschchromatographie Beeinflussbare Parameter bei der Ionenaustauschchromatographie Ob ein Protein an einen Ionenaustauscher bindet hängt hauptsächlich von zwei Faktoren ab: - der Eigenladung des Proteins - der Ionenstärke des Puffers, in dem das Protein gelöst ist Beide Faktoren können bis zu einem gewissen Grad beeinflusst werden. Die Eigenladung eines Proteins hängt neben seiner Aminosäurezusammensetzung vom ph-wert des Puffers ab. Ein Protein mit einem isoelektrischen Punkt von 7,0 ist bei ph 7,0 nach außen ungeladen. Senkt man den ph-wert, wird das Protein positiv geladen, erhöht man den ph-wert, wird das Protein negativ geladen. Mit Hilfe des ph-werts des Puffers, in dem ein Protein gelöst ist, kann deshalb zu einem gewissen Grad beeinflusst werden, ob und/oder wie gut ein Protein an einen Ionenaustauscher bindet. Allerdings sind die meisten Proteine bei einem zu niedrigen oder zu hohem ph-wert nicht stabil. In der Regel werden Puffer im ph-bereich von 5 8 verwendet. Die Ionenstärke des Puffers hängt von der Konzentration des vorhandenen Salzes ab. Diese Konzentration ist durch Verdünnen oder Zufügen von Salz leicht zu beeinflussen. Im Praktikum steht Ihnen NaCl als Salzkomponente in Ihren Reinigungspuffern zu Verfügung. 4

7 GFP-Reinigung Materialien Während der Praktikumswoche Protein-Analytik sollen Sie eine einfache Reinigungsstrategie für das Grün-fluoreszierende Protein, GFP, mit Hilfe von Ionenaustauschchromatographie entwickeln. GFP (238 aa, 26,9 kda) ist ein Protein aus der Qualle Aequorea victoria, das bei Anregung mit blauem oder ultraviolettem Licht grün fluoresziert. Die kodierende Sequenz für das GFP Protein wurde von uns in einen bakteriellen Expressionsvektor unter Kontrolle des T7 Promotors kloniert und dabei mit einem His 6 Tag versehen. Das GFP Expressionsplasmid wurde dann in BL21 Bakterien transformiert und die GFP Expression durch Induktion mit IPTG induziert. Die Bakterien wurden geerntet (abzentrifugiert), gewaschen und im Aufschlusspuffer in der Frenchpress aufgeschlossen. Zellmembrantrümmer wurden durch Zentrifugation abgetrennt und der resultierende Rohextrakt aliquotiert eingefroren. Für die Entwicklung der Reinigungsstrategie erhalten Sie von uns folgende Materialien: - 1 ml bakterieller GFP-Rohextrakt (Proteinextrakt) Chromatographiesäulen mit 600 µl Q-Sepharose Material und / oder Chromatographiesäulen mit 600 µl SP-Sepharose Material - 1 M Tris ph 7,0; 1M Tris ph 7,5 ; 1 M Tris ph 8,0; 1 M Tris ph 8,5; 1 M MES ph 6,5; 1 M MES ph 5,5; 5 M NaCl Informationen zu den Materialien Q-Sepharose: - starker Anionenaustauscher - Matrix Sepharose - funktionelle Gruppe: quartäres Ammonium, -O-CH 2 N + (CH 3 ) 3 SP-Sepharose: - starker Kationenaustauscher - Matrix Sepharose - funktionelle Gruppe: Sulfopropyl, -O-CH 2 CHOHCH 2 OCH 2 CH 2 CH 2 SO 3 - GFP-Rohextrakt: - Proteinextrakt aus GFP exprimierenden BL21 Bakterien - Proteine gelöst in 10 mm Tris, ph 7,5 / 150 mm NaCl Im GFP-Rohextrakt, der Ihnen zur Verfügung gestellt wird, sind die Proteine in 10 mm Tris ph 7,5, 150 mm NaCl gelöst. Unter diesen Bedingungen bindet das GFP Protein weder an die SP-Sepharose noch an die Q-Sepharose optimal. Um GFP an diese Säulenmaterialen zu binden müssen ph-wert und/oder Salzkonzentration geändert werden. 5

8 GFP-Reinigung Umpuffern und Verdünnen Umpuffern einer Proteinlösung und Verdünnen der Salzkonzentration: Den ph-wert einer Proteinlösung kann man am schnellsten ändern, indem man die Proteinlösung mit Puffer des gewünschten ph-werts mischt. Dabei sollte die Konzentration der Pufferkomponente im Puffer des Ziel ph-werts deutlich höher sein, als in der Ausgangslösung. Als Pufferkomponente stehen Ihnen jeweils 1 M Stocklösungen von MES ph 5,5, MES ph 6,5, Tris ph 7,5, Tris ph 8,0 und Tris ph 8,5 zur Verfügung. Stellen Sie Ihre Puffer jeweils auf 50 mm der Pufferkomponente ein. Bei dieser Konzentration können Sie sicher sein, dass die 10 mm Tris ph 7,5 im GFP-Rohextrakt austritiert werden auch wenn Sie den Rohextrakt nur 1 : 2 (= 1 + 1) mit dem gewünschten Puffer mischen. Die Konzentration der Pufferkomponente in Ihrem umgepufferten Rohextrakt wird niedriger sein als 50 mm (abhängig davon wie stark Sie verdünnen). Im Gegensatz zur Konzentration des Salzes (NaCl) beeinflusst aber die Konzentration der Pufferkomponente (Tris oder MES) die Bindung von GFP nicht (solange die Tris- oder MES-Konzentration 50 mm nicht übersteigt). Daher kann auf eine exakte Einstellung der Tris oder MES Konzentration im verdünnten Rohextrakt verzichtet werden. Beachten Sie aber, dass bei hohen Konzentrationen der Pufferkomponente (> 100 mm) die Bindung des GFP doch durch die Pufferkomponente beeinflusst wird. Die Salzkonzentration im GFP-Rohextrakt können Sie durch einfaches Verdünnen senken. Beachten Sie bitte, dass Sie niemals nur mit Wasser verdünnen, sondern immer mindestens mit 50 mm Ihrer gewählten Pufferkomponente. Beispiele für die Puffergestaltung Beispiel 1: Da Sie wissen, dass GFP bei ph 7,5 mit 150 mm Salz nicht an den Anionenaustauscher Q-Sepharose bindet, wollen Sie den ph auf 8,0 erhöhen und den Salzgehalt auf 50 mm NaCl senken. Um das zu erreichen, verdünnen Sie den GFP-Rohextrakt 1 : 3 (ein Teil Rohextrakt + 2 Teile Puffer) mit 50 mm Tris ph 8,0 (ohne Salz). Ihre Q-Sepharose equilibrieren Sie mit einem Puffer, der 50 mm Tris 8,0 und 50 mm NaCl enthält (gleiche Bedingungen, wie im verdünnten Rohextrakt) und als Waschpuffer verwenden Sie ebenfalls Puffer ph 8,0, 50 mm NaCl. Für die Elution würden Sie dann Puffer mit 50 mm Tris ph 8,0 und steigenden NaCl Konzentrationen verwenden. Beispiel 2: Sie wollen testen ob allein die Erhöhung des ph-wertes auf ph 8,0 ausreicht, um GFP effektiv an die Q-Sepharose zu binden. Sie wollen daher den ph-wert des Auftrages auf 8,0 einstellen, den Salzgehalt aber unverändert bei 150 mm NaCl belassen. Um das zu erreichen verdünnen Sie Ihren Rohextrakt 1 : 2 (ein Teil Rohextrakt und ein Teil Puffer) mit 50 mm Tris ph8,0 /150 mm NaCl. Da der Verdünnungspuffer den gleichen Salzgehalt wie der Rohextrakt hat, verändert sich der Salzgehalt nicht, während der ph-wert durch das 50 mm Tris ph 8,0 titriert wird. Ihre Q-Sepharose equilibrieren Sie in diesem Beispiel mit Puffer der 150 mm NaCl und 50 mm Tris ph 8,0 enthält (gleiche Bedingungen, wie im verdünnten Rohextrakt) und als Waschpuffer verwenden Sie ebenfalls Puffer mit 50 mm Tris ph 8,0, 150 mm NaCl. Für die Elution würden Sie dann Puffer mit 50 mm Tris ph 8,0 und steigenden NaCl Konzentrationen (> 150 mm NaCl) verwenden. (Achtung: Dies sind Beispiele, um die Vorgehensweise zu erklären. Keine Garantie, dass GFP unter diesen Bedingungen an eine der beiden Säulenmaterialien bindet!) 6

9 GFP-Reinigung Säulenchromatographie Allgemeine Hinweise zum Umgang mit Chromatographiesäulen - Das Säulenmaterial wurde in 20 % Ethanol suspendiert in die Säulen gefüllt. VOR der ersten Benutzung muss das Material mit Auftragspuffer equilibriert werden. Dazu werden mindestens 5 Säulenvolumen des Puffers durch die Säule gespült! - Vor jedem neuen Lauf muss die Säule mit 5 Säulenvolumen des Auftragspuffers neu equilibriert werden. - Nach jedem Lauf muss die Säule mit mindestens 5 Säulenvolumen Puffer, der 1 M NaCl enthält gewaschen werden, um fest bindende Proteine zu entfernen. - Sie arbeiten im Praktikum mit sogenanntem Gravity flow, d.h. die Flüssigkeit fließt auf Grund der Schwerkraft durch das Säulenmaterial. Dies verhindert ein vollständiges Trockenlaufen des Säulenmaterials. Trotzdem muss die Säule bei längerer (> 1h) Nichtbenutzung verschlossen werden. - Zur Umpufferung der Säulen (wenn z.b. ein anderer ph Wert und/oder eine andere Salzkonzentration für die Bindung des GFPs an die Säule getestet werden soll) müssen vor der Benutzung mindestens 5 Säulenvolumen des neuen Auftragspuffers durch die Säule gespült werden. Allgemeiner Ablauf eines Säulenlaufs Der Ablauf einer säulenchromatographischen Trennung lässt sich in verschiedene Schritte aufteilen: Nachdem die Säule mit dem Laufpuffer equilibriert ist, wird die Proteinlösung aufgetragen. Der Durchlauf mit den nicht gebundenen Proteinen wird (falls nötig fraktioniert) aufgefangen. Anschließend wird die Säule mit mindestens 5 Säulenvolumen Laufpuffer gewaschen, um alle nicht bindenden Proteine auszuwaschen. Die Waschfraktionen werden fraktioniert aufgefangen. Jetzt können die gebundenen Proteine durch z.b. Erhöhung des Salzgehalts im Elutionspuffer schrittweise eluiert werden. Da im Praktikum kein linearer Gradient zur Elution verwendet werden kann, erfolgt die Elution durch einen Stufengradienten. Die Säule wird mit jeweils 2 Volumen Puffer mit höherem Salzgehalt gespült, die Elution fraktioniert aufgefangen. Dann wird die Säule erneut mit Puffer mit noch höherem Salzgehalt gespült, die Elution wieder fraktioniert aufgefangen usw. - Säule mit dem gewählten Auftragspuffer equilibrieren (5 Säulenvolumen) - Proteinextrakt auf den gewünschten ph-wert und Salzkonzentration einstellen (siehe oben) - Proteinextrakt auftragen und Durchlauf (D) in einem Eppi auffangen - Zum Waschen 1 Säulenvolumen Laufpuffer auftragen und Durchlauf auffangen (W1) - Waschschritt 4 mal wiederholen (W2 W5) - 1 Säulenvolumen der ersten Gradientenstufe auftragen und Eluat auffangen (E11) - Schritt wiederholen (E12) - 1 Säulenvolumen der zweiten Gradientenstufe auftragen und Eluat auffangen (E21) - Schritt wiederholen (E22) -. 7

10 GFP-Reinigung Säulenchromatographie - Gradienten mit NaCl werden in der Regel bis 1 M NaCl gefahren; da Sie die Elution des GFP optisch verfolgen können, wissen Sie bei welchem Salzgehalt das GFP vollständig von der Säule entfernt ist und können den Stufengradienten an dieser Stelle stoppen. - Um alle restlichen Proteine von der Säule zu entfernen, 5 Säulenvolumen Puffer mit 1 M NaCl auftragen. Wenn Sie sicher sind, dass das GFP komplett eluiert ist, müssen Sie diese Fraktionen nicht mehr sammeln. 8

11 Aufgabenstellung 1 Entwicklung einer Reinigungsstrategie für das GFP Protein durch Ionenaustauschchromatographie Ihre Aufgabe im Praktikum ist es Bedingungen zu finden, unter denen das GFP an die SP- Sepharose oder an die Q-Sepharose bindet und dann einen Teil Ihres GFP-Rohextrakts unter diesen Bedingungen über die Säule zu reinigen. Die Testbedingungen werden pro Saal festgelegt, die Ergebnisse der verschiedenen Testbedingungen werden zusammen getragen und dann festgelegt welche Bedingungen für die quantitative Reinigung von welcher Gruppe verwendet werden. Der Versuch umfasst folgende Teile: 1. Die Gruppen eines Saales entscheiden gemeinsam welches Säulenmaterial unter welchen Bedingungen getestet werden soll. Variiert werden der ph-wert der Puffer und / oder der NaCl-Gehalt des Säulenauftrags. Pro Saal können verschiedene Bedingungen für die Q- Sepharose, für die S-Sepharose oder aber für Q- und S-Sepharose getestet werden. In jedem Fall muss jede Gruppe zwei verschiedene Bedingungen testen! Die Aufteilung der verschiedenen Bedingungen pro Saal wird auf je einer (fahrbaren) Tafel tabellarisch dokumentiert. In diese Tabelle auf der Tafel werden im Laufe der Woche die Ergebnisse der qualitativen Testläufe und die Verteilung der Bedingungen der quantitativen Reinigung eingetragen. (Am Ende der Woche Foto machen (lassen); Dr. Feldmann stellt das Bild dann für jeden abrufbar online.) Anschließend legt jede Gruppe für sich fest mit welchen Puffern und mit welchen Volumina Sie den GFP-Rohextrakt umpuffern bzw. verdünnen wollen. Mit welchen Puffern wollen Sie die Säulen jeweils equilibrieren, womit waschen Sie nach dem Auftrag, mit welchen Puffern eluieren Sie. Wie viel der Puffer müssen Sie ansetzen, wie setzen Sie die Puffer an usw. (Abschließen an Tag 1) 2. Verwenden Sie zum Testen Ihrer Reinigungsbedingungen jeweils 100 µl des ausgegebenen Rohextrakts. Zur Auswertung der Tests bestimmen Sie die Fluoreszenz aller Fraktionen unter der UV-Lampe. Notieren Sie die Ergebnisse Ihrer Testläufe in der Tabelle an der Tafel. (Abschließen an Tag 2) Während der Testläufe notieren sie bitte folgende Informationen/Werte und tragen sie in die Arbeitsblätter ein (Betreuer zeichnen ab!): - Säulenmaterial - ph-wert des Testlaufs - Salzkonzentration des Auftrags/Waschpuffers - Verdünnung des Rohextrakts (Wie viel Rohextrakt mit wie viel von welchem Puffer) - Salzkonzentration und Volumen der Elutionen - Fluoreszenz (unter UV-Lampe) von + Durchlauf + Waschfraktion Elutionsfraktionen (Wertung mit keine, wenig, mittel,stark oder -, +, ++, +++) 9

12 Beispiel Arbeitsblätter Testläufe Schematische Darstellung 1. Festlegung der Versuchsbedingungen: Säule: SP-Sepharose Auftragsbedingungen: ph 7, 0; 100 mm NaCl 2. Herzustellende Puffer: Verdünnungspuffer (Einstellen von ph-wert und Salzgehalt im Rohextrakt) 50 mm Tris ph 7,0 / 50 mm NaCl / 1 ml Stock 1 M Tris ph 7,0 5 M NaCl eingesetzt 50 µl 10 µl 940 µl Laufpuffer (äquilibrieren der Säule, Waschen der Säule nach Auftrag Rohextrakt) 50 mm Tris ph 7,0 / 100 mm NaCl / 10 ml Stock 1 M Tris ph 7,0 5 M NaCl eingesetzt 500 µl 200 µl 9,3 ml Elutionspuffer 1 50 mm Tris ph 7,0 / 200 mm NaCl / 1,5 ml Stock 1 M Tris ph 7,0 5 M NaCl eingesetzt 75 µl 60 µl 1365 µl Elutionspuffer 2 50 mm Tris ph 7,0 / 300 mm NaCl / 1,5 ml Stock 1 M Tris ph 7,0 5 M NaCl eingesetzt 75 µl 90 µl 1335 µl Elutionspuffer 3 50 mm Tris ph 7,0 / 400 mm NaCl / 1,5 ml Stock 1 M Tris ph 7,0 5 M NaCl eingesetzt 75 µl 120 µl 1305 µl Elutionspuffer 4 50 mm Tris ph 7,0 / 500 mm NaCl / 1,5 ml Stock 1 M Tris ph 7,0 5 M NaCl eingesetzt 75 µl 150 µl 1275 µl Säulenreinigungspuffer 50 mm Tris ph 7,0 / 1000 mm NaCl / 5 ml Stock 1 M Tris ph 7,0 5 M NaCl eingesetzt 250 µl 1000 µl 3,75 ml 10

13 Beispiel Arbeitsblätter Testläufe 3. Säulen-Äquilibrierung: Säule öffnen, Flüssigkeit (30 % Ethanol) austropfen lassen; 3 ml Laufpuffer auftragen (600 µl Säulenvolumen => 3 ml = 5 x 600 µl = 5 Säulenvolumen); durchtropfen lassen 4. GFP-Rohextrakt verdünnen GFP Rohextrakt ist: 10 mm Tris ph 7,5 / 150 mm NaCl GFP soll: 50 mm Tris ph 7,0 / 100 mm NaCl Verdünnung 1 : 2 (= 1 + 1): 100 µl GFP-Rohextrakt µl Verdünnungspuffer mischen 5. Verdünnten GFP-Rohextrakt auftragen (vorsichtig auf Säulenoberfläche pipettieren); Durchlauf auffangen in 1,5 ml Eppi = D (Durchlauf) Volumen D: 200 µl Fluoreszenz D: - 6. Säule Waschen mit 5 x 1 Volumen Laufpuffer 5 x 600 µl Laufpuffer vorsichtig auf Säulenoberfläche pipettieren, jeweils in 1,5 ml Eppis sammeln = W1, W2, W3, W4, W5 ( W = Waschen) Volumen W1: 600 µl Fluoreszenz W1: - Volumen W2: 600 µl Fluoreszenz W2: + Volumen W3: 600 µl Fluoreszenz W3: - Volumen W4: 600 µl Fluoreszenz W4: - Volumen W5: 600 µl Fluoreszenz W5: - 7. Elution 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 1 auftragen, sammeln = E11 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 1 auftragen, sammeln = E12 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 2 auftragen, sammeln = E21 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 2 auftragen, sammeln = E22 analog mit Elutionspuffer 3-5 Volumen E11: 600 µl Fluoreszenz E11: - Volumen E12: 600 µl Fluoreszenz E12: - Volumen E21: 600 µl Fluoreszenz E21: ++ Volumen E22: 600 µl Fluoreszenz E22: ++++ Volumen E31: 600 µl Fluoreszenz E31: ++ Volumen E32: 600 µl Fluoreszenz E32: + Volumen E41: 600 µl Fluoreszenz E41: - Volumen E42: 600 µl Fluoreszenz E42: - Volumen E51: 600 µl Fluoreszenz E51: - Volumen E52: 600 µl Fluoreszenz E52: - 8. Fluoreszenz an der UV-Lampe bestimmen, in Tabellen eintragen; 9. Säule waschen mit 3 ml Säulenreinigungspuffer 11

14 Arbeitsblätter Testläufe Arbeitsblatt Testlauf 1 Ausfüllen und von Betreuer abzeichnen lassen! 1. Festlegung der Versuchsbedingungen: Säule: Auftragsbedingungen: 2. Herzustellende Puffer: Verdünnungspuffer (Einstellen von ph-wert und Salzgehalt im Rohextrakt) Stock eingesetzt Laufpuffer (äquilibrieren der Säule, Waschen der Säule nach Auftrag Rohextrakt) Stock eingesetzt Elutionspuffer 1 Stock eingesetzt Elutionspuffer 2 Stock eingesetzt Elutionspuffer 3 Stock eingesetzt Elutionspuffer 4 Stock eingesetzt Säulenreinigungspuffer Stock eingesetzt 12

15 Arbeitsblätter Testläufe 3. Säulen-Äquilibrierung: Säule öffnen, Flüssigkeit (30 % Ethanol) austropfen lassen; 3 ml Laufpuffer auftragen (600 µl Säulenvolumen => 3 ml = 5 x 600 µl = 5 Säulenvolumen); durchtropfen lassen 4. GFP-Rohextrakt verdünnen GFP Rohextrakt ist: 10 mm Tris ph 7,5 / 150 mm NaCl GFP soll: Verdünnung: 5. Verdünnter GFP-Rohextrakt auftragen (vorsichtig auf Säulenoberfläche pipettieren); Durchlauf auffangen in 1,5 ml Eppi= D Volumen D: Fluoreszenz D: 6. Säule Waschen mit 5 x 1 Volumen Laufpuffer 5 x 600 µl Laufpuffer auf vorsichtig auf Säulenoberfläche pipettieren, jeweils in 1,5 ml Eppis sammeln = W1, W2, W3, W4, W5 Volumen W1: Fluoreszenz W1: Volumen W2: Fluoreszenz W2: Volumen W3: Fluoreszenz W3: Volumen W4: Fluoreszenz W4: Volumen W5: Fluoreszenz W5: 7. Elution 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 1 auftragen, sammeln = E11 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 1 auftragen, sammeln = E12 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 2 auftragen, sammeln = E21 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 2 auftragen, sammeln = E22 analog mit Elutionspuffer 3 4 Volumen E11: Fluoreszenz E11: Volumen E12: Fluoreszenz E12: Volumen E21: Fluoreszenz E21: Volumen E22: Fluoreszenz E22: Volumen E31: Fluoreszenz E31: Volumen E32: Fluoreszenz E32: Volumen E41: Fluoreszenz E41: Volumen E42: Fluoreszenz E42: Volumen E51: Fluoreszenz E51: Volumen E52: Fluoreszenz E52: 8. Fluoreszenz an der UV-Lampe bestimmen, in Tabellen eintragen; 9. Säule waschen mit 3 ml Säulenreinigungspuffer 13

16 Arbeitsblätter Testläufe Arbeitsblatt Testlauf 2 Ausfüllen und von Betreuer abzeichnen lassen! 1. Festlegung der Versuchsbedingungen: Säule: Auftragsbedingungen: 2. Herzustellende Puffer: Verdünnungspuffer (Einstellen von ph-wert und Salzgehalt im Rohextrakt) Stock eingesetzt Laufpuffer (äquilibrieren der Säule, Waschen der Säule nach Auftrag Rohextrakt) Stock eingesetzt Elutionspuffer 1 Stock eingesetzt Elutionspuffer 2 Stock eingesetzt Elutionspuffer 3 Stock eingesetzt Elutionspuffer 4 Stock eingesetzt Säulenreinigungspuffer Stock eingesetzt 14

17 Arbeitsblätter Testläufe 1. Säulen-Äquilibrierung: Säule öffnen, Flüssigkeit (30 % Ethanol) austropfen lassen; 3 ml Laufpuffer auftragen (600 µl Säulenvolumen => 3 ml = 5 x 600 µl = 5 Säulenvolumen); durchtropfen lassen 2. GFP-Rohextrakt verdünnen GFP Rohextrakt ist: 10 mm Tris ph 7,5 / 150 mm NaCl GFP soll: Verdünnung: 3. Verdünnter GFP-Rohextrakt auftragen (vorsichtig auf Säulenoberfläche pipettieren); Durchlauf auffangen in 1,5 ml Eppi= D Volumen D: Fluoreszenz D: 4. Säule Waschen mit 5 x 1 Volumen Laufpuffer 5 x 600 µl Laufpuffer auf vorsichtig auf Säulenoberfläche pipettieren, jeweils in 1,5 ml Eppis sammeln = W1, W2, W3, W4, W5 Volumen W1: Fluoreszenz W1: Volumen W2: Fluoreszenz W2: Volumen W3: Fluoreszenz W3: Volumen W4: Fluoreszenz W4: Volumen W5: Fluoreszenz W5: 5. Elution 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 1 auftragen, sammeln = E11 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 1 auftragen, sammeln = E12 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 2 auftragen, sammeln = E21 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 2 auftragen, sammeln = E22 analog mit Elutionspuffer 3 4 Volumen E11: Fluoreszenz E11: Volumen E12: Fluoreszenz E12: Volumen E21: Fluoreszenz E21: Volumen E22: Fluoreszenz E22: Volumen E31: Fluoreszenz E31: Volumen E32: Fluoreszenz E32: Volumen E41: Fluoreszenz E41: Volumen E42: Fluoreszenz E42: Volumen E51: Fluoreszenz E51: Volumen E52: Fluoreszenz E52: 6. Fluoreszenz an der UV-Lampe bestimmen, in Tabellen eintragen; 7. Säule waschen mit 3 ml Säulenreinigungspuffer 15

18 GFP-Reinigung GFP Detektion, Bradford-Assay Detektion des GFP in den Säulenfraktionen: Die Detektion des GFP ist einfach. Unter optimalen Bedingungen (Bindung an die Säule, scharfe Elution) sehen Sie die grün-gelbe Fluoreszenz des Proteins auch bei Tageslicht. Schwächer konzentrierte GFP-Lösungen können Sie durch Messung am Photometer bei 395 nm detektieren. Noch einfacher ist es, die Eppendorftubes mit den verschiedenen Fraktionen auf dem UV-Schirm bzw unter der UV-Lampe ( nm) zu betrachten (Achtung! Schutz von Haut und Augen). Unter diesen Bedingungen leuchtet GFP sehr stark. Die Detektion per Auge bei Tageslicht oder auf dem UV-Schirm erlaubt nur eine qualitative, keine quantitative Aussage über die GFP Konzentration in den Fraktionen. Quantitativ kann die Reinigung nur über Photometermessungen ausgewertet werden. Quantitative Bestimmung von Proteinkonzentrationen: Zur quantitativen Proteinbestimmung wird unter anderen der sogenannte Bradford-Assay verwendet. Die Methode nutzt die Verschiebung des Absorptionsmaximums von Coomassie Brilliant-Blau in Gegenwart von Proteinen im sauren Milieu von 465 nm zu 595 nm. Daher beobachtet man beim Mischen einer Coomassie-Lösung in Ethanol und Phosphorsäure mit einer Proteinlösung eine Farbverschiebung von rot-braun nach blau. Die Intensität der Blaufärbung kann photometrisch bestimmt werden und korreliert in einem bestimmten Konzentrationsbereich mit der Gesamtproteinkonzentration. Um die Konzentration einer unbekannten Lösung bestimmen zu können, muss zunächst eine Eichgerade erstellt werden. Dazu werden steigende Mengen einer Proteinlösung mit bekannter Konzentration mit dem Bradford Reagenz gemischt und nach einer definierten Zeit im Photometer gemessen. Trägt man die Absorption gegen die Proteinkonzentration auf, ergibt sich ein linearer Anstieg der Absorption mit zunehmender Konzentration. Diese Eichgerade kann genutzt werden, um die Konzentration einer unbekannten Probe zu bestimmen. 16

19 GFP-Reinigung Bradford Assay Materialien: - BSA-Stocklösung 1 mg/ml - H 2 O bidest - Bradford-Reagenz (5x) - Küvetten - Photometer - Pipetten - Pipettenspitzen (weiß, gelb, blau) - sterile Eppendorf Cups 1,5 ml Versuchsdurchführung: - H 2 O in beschrifteten Küvetten vorlegen - BSA zugeben, Küvette mit Parafilm verschließen, mischen - wenn alle Küvetten fertig und das Photometer frei ist: Bradford-Reagenz zugeben, mischen, 5 min. inkubieren, mischen - messen am Photometer bei 595 nm Referenz = Spalte 1 in Tabelle Nullwert einstellen (Messwert Spalte 2 vermutlich < 0,1 und Messwert Spalte 10 vermutlich > 1,0 eventuell nicht mehr im linearen Messbereich des Photometers; beim Erstellen der Eichgerade beachten) H 2 O (µl) BSA-Lsg. (1mg/ml) (µl) xBradford-Lsg. (µl) Messwert: 0 Proben der Reinigung messen: - Verwenden Sie 1 5 µl des Auftrags (= ph/salz eingestellter Rohextrakt) für die Proteinbestimmung (Ansatz analog Erstellung der Eichgerade). - Verwenden Sie 1 10 µl des Durchlaufs für die Proteinbestimmung; - Verwenden Sie 5 50 µl der Waschfraktionen für die Proteinbestimmung (die erste Waschfraktion sollte ähnlich viel Protein enthalten wie der Durchlauf, die letzte Waschfraktion sollte (fast) kein Protein enthalten). - Verwenden Sie 5 50 µl der Elutionsfraktionen, die GFP enthalten für die Proteinbestimmung; der gemessene Wert sollte größer 0,1 und kleiner 0,9 sein (Linearität des Photometers); Vergessen Sie nicht bei der Berechnung der Proteinkonzentration das gemessene Probenvolumen mit einzurechnen! 17

20 GFP-Reinigung Bradford Assay - Achtung: Verwenden Sie keine 1 x Bradford-Lösung Setzen Sie Ihre Proteinbestimmung wie folgt an: x µl Proteinlösung 800 x µl H 2 O 200 µl Bradford-Lösung 5 x Vorgehen wie bei der Erstellung der Eichgerade: H 2 O vorlegen, Proteinlösung zugeben, mischen, 5 x Bradford-Lösung zugeben, mischen, 5 min. inkubieren, messen; 18

21 Aufgabenstellung 2 Fortsetzung von Seite 9 3. Entscheiden Sie auf Grund der Testreinigungen des Saales welches die besten Reinigungsbedingungen sind. Verteilen Sie optimale und nicht-optimale Bedingungen unter den Gruppen eines Saales (mindestens vier verschiedene Bedingungen pro Säulen- Material). Jede Gruppe reinigt 700 µl Rohextrakt unter den zugeteilten Bedingungen. Sammeln Sie alle Fraktionen der quantitativen Reinigung. Heben Sie den übrigen Rohextrakt auf! (Abschließen an Tag 3) 4. Messen Sie für ALLE Fraktionen die Absorption bei 395 nm und bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen für ALLE Fraktionen. Bestimmen Sie die spezifische und Gesamtmenge an GFP in Ihrem Auftrags und Ihren Elutionsfraktionen und vergleichen Sie diese. Analysieren Sie Ihre GFP-Reinigung auf einem SDS-Gel. Tragen Sie folgende Proben auf ein 12 % Gel mit 15er Kamm auf: 1: Marker 10 µl 6. Waschen 3 10 µl 11. Elution 22 5 µl 2: Auftrag 3 µl 7. Waschen 4 10 µl 12. Elution 31 5 µl 3. Durchlauf 3 µl 8. Waschen 5 10µl 13. Elution 32 5 µl 4: Waschen 1 10 µl 9. Elution 12 5 µl 14. Elution 41 5 µl 5. Waschen 2 10 µl, 10. Elution 21 5 µl 15. Elution 42 5 µl Proben vor dem Auftrag aufs Gel mit entsprechender Menge 5 x SDS-Auftragspuffer versetzen und aufkochen. Nach dem Entfärben das Gel am Eagle Eye im 4. Stock (Raum 4.15) fotografieren und das Bild mit der Gruppennummer speichern. Tragen Sie Ihre Auftragsreihenfolge inklusive Reinigungsbedingungen und Salzkonzentration in den Elutionsfraktionen in Moodle ein. Fotos und Auftragsschemata werden für die Auswertung im Protokoll online gestellt. (Abschließen an Tag 4) Für die quantitative Reinigung notieren Sie bitte folgende Informationen/Werte: - Säulenmaterial - ph-wert - Salzkonzentration des Auftrags/Waschpuffers - Verdünnung des Rohextrakts (Wie viel Rohextrakt mit wie viel von welchem Puffer) - Auftragsvolumen - Volumen der Waschfraktionen - Salzkonzentration der Elutionen - Volumen der Elutionen - Absorption bei 395 nm für alle Fraktionen - Proteinkonzentration für alle Fraktionen Siehe Arbeitsblätter Quantitative Reinigung Achtung: - Bitte denken Sie daran von ALLEN Fraktionen einer Reinigung genug Probe für die Bestimmung der Absorption und der Proteinkonzentration auf zu bewahren!! - Das GFP Protein ist relativ unempfindlich und kann längere Zeit bei Raumtemperatur bearbeitet werden. Es ist aber sinnvoll, die Proben tagsüber auf Eis zu lagern und nachts bei -20 C einzufrieren 19

22 Arbeitblätter quantitative Reinigung Arbeitsblatt Quantitative Reinigung Ausfüllen und von Betreuer abzeichnen lassen! 1. Festlegung der Versuchsbedingungen: Säule: Auftragsbedingungen: 2. Herzustellende Puffer: Verdünnungspuffer (Einstellen von ph-wert und Salzgehalt im Rohextrakt) Stock eingesetzt Laufpuffer (äquilibrieren der Säule, Waschen der Säule nach Auftrag Rohextrakt) Stock eingesetzt Elutionspuffer 1 Stock eingesetzt Elutionspuffer 2 Stock eingesetzt Elutionspuffer 3 Stock eingesetzt Elutionspuffer 4 Stock eingesetzt Säulenreinigungspuffer Stock eingesetzt 20

23 Arbeitblätter quantitative Reinigung 3. Säulen-Äquilibrierung: Säule öffnen, Flüssigkeit (30 % Ethanol) austropfen lassen; 3 ml Laufpuffer auftragen (600 µl Säulenvolumen => 3 ml = 5 x 600 µl = 5 Säulenvolumen); durchtropfen lassen 4. GFP-Rohextrakt verdünnen GFP Rohextrakt ist: 10 mm Tris ph 7,5 / 150 mm NaCl GFP soll: Verdünnung: 5. Verdünnter GFP-Rohextrakt auftragen (vorsichtig auf Säulenoberfläche pipettieren); Durchlauf auffangen in 1,5 ml Eppi= D Volumen D: 6. Säule Waschen mit 5 x 1 Volumen Laufpuffer 5 x 600 µl Laufpuffer auf vorsichtig auf Säulenoberfläche pipettieren, jeweils in 1,5 ml Eppis sammeln = W1, W2, W3, W4, W5 Volumen W1: Volumen W2: Volumen W3: Volumen W4: Volumen W5: 7. Elution 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 1 auftragen, sammeln = E11 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 1 auftragen, sammeln = E12 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 2 auftragen, sammeln = E21 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 2 auftragen, sammeln = E21 analog mit Elutionspuffer 3-4 Volumen E11: Volumen E31: Volumen E12: Volumen E32: Volumen E21: Volumen E41: Volumen E22: Volumen E42: 8. Absorbtion aller Proben messen bei 396 nm, in Tabellen eintragen; Sie benötigen vermutlich unterschiedliche Volumina, um vernünftige Werte für ΔE zu bestimmen. Notieren Sie daher bei den einzelnen Fraktionen auch die für die ΔE Bestimmung verwendeten Volumina. Als Referenz zum Nullen des Photometers verwenden Sie die jeweiligen Puffer. Achtung: Mindestens 800 µl Volumen für die Messung in die Küvette geben, da sonst die Flüssigkeit nicht im Strahlengang des Photometers ist. Volumen verwend. OD ΔE (395) D (Durchlauf) ΔE (395) E12 (Elution 12) ΔE (395) W1 (Waschen 1) ΔE (395) E21 ΔE (395) W2 ΔE (395) E22 ΔE (395) W3 ΔE (395) E31 ΔE (395) W4 ΔE (395) E32 ΔE (395) W5 ΔE (395) E41 ΔE (395) E42 Volumen verwend. OD 21

24 Arbeitblätter quantitative Reinigung 9. Proteinkonzentration bestimmen für alle Fraktionen: Sie benötigen unterschiedliche Volumina, um vernünftige Werte für die Proteinkonzentrationen zu bestimmen. Beachten Sie, dass die Absorption im Bereich zwischen 0,1 und 0,8 liegen muss, da das Photometer im Bereich < 0,1 und > 0,8 nicht linear misst. Vorschläge, wie viel µl Sie bei der Proteinbestimmung für die einzelnen Fraktionen testen könnten, finden Sie auf Seite 17. Abhängig von Ihrem Versuchsverlauf müssen Sie aber eventuell andere Werte einsetzen. Notieren Sie daher bei den einzelnen Fraktionen auch die für die für die Proteinkonzentrations-Bestimmung verwendeten Volumina. Volumen verwend. OD ΔE (595) D (Durchlauf) ΔE (595) E12 (Elution 12) ΔE (595) W1 (Waschen 1) ΔE (595) E21 ΔE (595) W2 ΔE (595) E22 ΔE (595) W3 ΔE (595) E31 ΔE (595) W4 ΔE (595) E32 ΔE (595) W5 ΔE (595) E41 ΔE (595) E Säule waschen mit 3 ml Säulenreinigungspuffer Volumen verwend. OD 22

25 Auswertung Auswertung der Reinigung: Ziel einer Proteinreinigung ist es das Protein möglichst rein, in großen Mengen und in hoher Konzentration zu erhalten. Die spezifische Menge des Zielproteins (mg GFP pro mg Gesamtprotein) und die Gesamtmenge des Zielproteins (GFP) sind zwei Parameter mit denen eine Reinigung beurteilt werden kann. Die spezifische Menge gibt Auskunft darüber wie homogen (rein) das Protein ist. Die spezifische Menge M S(GFP) = Menge GFP M (GFP) pro mg Gesamtprotein P (gesamt) [mg/mg]. Die spezifische Menge ist eine reine Zahl ohne Einheit. Sie gibt das Verhältnis von GFP zu noch vorhandenen Verunreinigungen an. Zu Beginn der Reinigung ist M S(GFP) deutlich kleiner 1. Im Verlauf der Reinigung wird M S(GFP) größer bis im Idealfall bei einer homogenen (= reinen) GFP Fraktion die Zahl 1 erreicht wird. (M S(GFP) kann niemals größer 1 sein! Warum?) Zur Berechnung von M S(GFP) benötigen Sie die Menge GFP M (GFP) pro Volumeneinheit und die Gesamtmenge Protein pro Volumeneinheit. M (GFP) wird photometrisch durch Messung der Absorption bei 395 nm bestimmt. Mit dem spezifischen Extinktionskoefizienten von GFP ε 397nm = cm -1 M -1 kann mit Hilfe des Lambert- Beerschen Gesetzes die molare Konzentration und daraus die Menge an GFP (MW = 28500g/mol) berechnet werden. Das Gesamtprotein Ihrer Fraktionen erhalten Sie aus der quantitativen Proteinbestimmung mit dem Bradford-Assay. Die Gesamtmenge (GFP) gibt Auskunft darüber, wie viel des Zielproteins man gereinigt hat. Die Konzentration und damit die Menge an GFP ergibt sich aus den photometrischen Messungen und Berechnung nach dem Lambert-Beerschen Gesetz (siehe oben). Wichtig bei der Berechnung der Gesamtmenge an Zielprotein (GFP) ist es, die unterschiedlichen Volumina der verschiedenen Reinigungsstufen mit ein zu beziehen. Die Gesamtmenge an Zielprotein wird während einer Reinigung kleiner, da bei jedem Reinigungsschritt auch Zielprotein verloren geht. Bei der Entwicklung einer Reinigungsstrategie ist es immer von Bedeutung beide Faktoren, spezifische Menge und Gesamtmenge des Zielproteins, zu berücksichtigen. Wenn viel Protein benötigt wird, macht es eventuell keinen Sinn eine Säule zu verwenden, die zu einer hohen spezifischen Menge führt, aber auf der sehr viel Gesamtmenge verloren geht. Wird hochreines Protein benötigt, kann es sinnvoll sein eine Säule zu verwenden, auf der 50 oder mehr Prozent der Gesamtaktivität verloren gehen, wenn mit diesem Reinigungsschritt hohe spezifische Mengen erreicht werden können. 23

26 Taq-Polymerase Reinigung Die Konzentration vieler Proteine in Ihren natürlichen Quellen ist sehr gering. Dies macht Ihre Reinigung direkt aus der natürlichen Quelle arbeits- und zeitaufwendig und kostenintensiv. Viele Proteine lassen sich aber durch Verwendung geeigneter Expressionssysteme (siehe auch induzierte Genexpression) in (relativ) großen Mengen in Bakterien, Hefen oder speziellen Zellkulturen herstellen. Man verwendet sogenannte Expressionsplasmide, die neben dem origin of replication für den Zielorganismus und einem Markergen auch alle DNA-Sequenzen enthalten, die für die Transkription des Gens im jeweiligen Wirtsorganismus notwendig sind. Im wesentlichen sind das ein Wirts spezifischer Promotor, an den die RNA-Polymerase bindet und mit der Trankription startet und einen Terminator, der der RNA-Polymerase signalisiert, dass das Gen fertig transkribiert ist und sie die Arbeit einstellen kann. Durch die Auswahl geeigneter Promotoren kann man erreichen, dass z.b. in Bakterien das heterolog exprimierte Fremdprotein bis zu 1 % der Zellmasse ausmacht. Die Taq-Polymerase, die Sie reinigen werden, wurde im Bakterium BL21 unter Kontrolle des T7 Promotors nach Induktion mit IPTG expremiert. Am Ende der kodierenden Sequenz der Taq- Polymerase wurde vor das Stop Kodon die Sequenz für sechs Histidine eingefügt. Dies macht eine Affinitätsreinigung durch Bindung an Ni 2+ -Agarose möglich. Sie erhalten ein Zellpellet von Bakterien, in denen die Taq-Polymerase überexpremiert wurde. Der erste Schritt der Reinigung ist der Aufschluss der Bakterienzellen. Da die Taq ein sehr hitzestabiles Protein ist (stammt aus einem thermophilen Bakterium), können die Zellen durch eine Kombination aus enzymatischer Behandlung mit Lysozym und Inkubation bei 75 C lysiert werden. Lysozym ist ein Enzym, das Bakterienzellwände abbaut. Die anschließende Inkubation bei 75 C denaturiert die meisten E.coli Proteine. Dadurch wird die Zellmembran vollständig zerstört und der Zellinhalt im Puffer frei gesetzt. Nicht nur die Zellmembranproteine werden durch die Hitze denaturiert (entfaltet), auch die meisten cytosolischen E. coli Proteine. Solange kein Detergenz die denaturierten Proteine in Lösung hält, werden entfaltete Proteine sehr schnell unlöslich und fallen aus. Daher können die meisten nicht gewünschten Proteine (E. coli Proteine, Lysozym) nach dem Hitzeschritt zusammen mit den Zelltrümmern abzentrifugiert werden. Nach der Zentrifugation befindet sich die Taq-Polymerase im wässrigen Überstand. Ammoniumsulfat ist ein antichaotropes Salz, mit dem native Proteine besonders gut gefällt werden können. Mit einer gesättigten Ammoniumsulftatlösung wird der Überstand nach der Hitze- Denaturierung auf 45% AS eingestellt. Der Ansatz wird über Nacht im Kühlschrank gelagert. Die Proteine fallen bei der niedrigen Temperatur aus und können durch Zentrifugation abgetrennt werden. Das Protein-AS Pellet wird anschließend im Bindungspuffer für die Affinitäts-Reinigung gelöst. Dieser Schritt dient vor allem der Konzentrierung der Taq, verunreinigende Proteine werden kaum abgetrennt. Bei der Affinitätschromatographie wird die starke und spezifische Bindung eines Proteins an einen Liganden für die Reinigung genutzt. Der Ligand wird an eine Säulenmatrix immobilisiert. Das Protein bindet den Liganden während Verunreinigungen in der wässrigen Lösung bleiben und mit dem Überstand entfernt werden können (batch-verfahren) oder durch die Säule gespült werden. Im Praktikum wird die Nickel-Affinitätschromatographie verwendet. Die Aminosäure Histidin kann Ni 2+ -Ionen binden. Durch Anfügen von sechs zusätzlichen Histidinresten an die Aminosäuresequenz wird eine spezifische Bindung der Taq an Ni 2+ -NTA-Agarose erreicht. Verunreinigungen werden durch Waschen der Agarosebeads entfernt. Die Elution der Taq von der Ni 2+ -NTA-Agarose erfolgt durch Zugabe von Imidazol. Wie Histidin kann Imidazol Ni 2+ binden. Durch die hohe Imidazolkonzentration im Elutions-Puffer wird die Taq von den Ni 2+ -NTA-Agarose-Beads verdrängt und befindet sich dann im Überstand. Durch Dialyse gegen Lagerungspuffer wird das Imidazol und andere Salze auf der Tag-Lösung entfernt und die Lösung auf ph, Salz und Glycerin-Konzentrationen eingestellt, die optimal für die längerfristige Lagerung sind. 24

27 Taq-Reinigung Zellaufschluss, AS-Fällung, Tag 1 Materialien: - Bakterienpellet (induziert) - Lysozym-Lösung 20 mg/ml - Lysozym-Aufschlusspuffer - β-mercaptoethanol - 10% SDS-Stock-Lösung - 5 x SDS-Probenpuffer - Pipetten - Pipettenspitzen (gelb, blau) - gesättigte Ammoniumsulfatlösung - H 2 O bidest - Eppendorf-Kühlzentrifugen - sterile Eppendorf Tubes 2,0 ml - Eisbad - Thermomixer 75 C Versuchsdurchführung: Thermomixer vorheizen auf 75 C Während der Reinigung entnehmen Sie auf verschiedenen Stufen Proben, die zur späteren Auswertung der Reinigung verwendet werden. Diese Proben werden mit P1, P2, P3,... benannt und beschriftet. Sie werden wie angegeben behandelt und dann bis zur Analyse eingefroren. Die Reinigungsschritte selbst erfolgen mit der Hauptmenge des Aufschlusses. Bakterienpellet in 1,5 ml Lysozym-Aufschlusspuffer resuspendieren und in 2,0 ml Eppi überführen (1000 µl Pipette, blaue Spitzen), auf Eis stellen; 20 µl Probe abnehmen und auf Eis stellen = P1 100 µl Lysozym-Lösung zur ca. 1,5 ml Bakteriensuspension zugeben, schnell mischen, für 30 min auf Eis inkubieren, hin und wieder mischen; (100 µl Pipette, gelbe Spitzen) Aufschluss im Thermomixer bei 75 C für 30 min inkubieren, hin und wieder mischen (Beobachtung?) Zentrifugieren: 30 min/ maximale rpm/ 4 C, Eppendorf-Kühlzentrifuge Überstand abnehmen und in frisches Eppendorfgefäß überführen; 16 µl Probe nehmen und auf Eis stellen = P2 Volumen der Hauptmenge des Überstands aus der Hitzedenaturierung bestimmen, gleichmäßig auf zwei Eppis 1,5 ml verteilen (1000 µl Pipette, blaue Spitzen) 25

28 Taq-Reinigung Zellaufschluss, AS-Fällung, Tag 1 Lösung mit gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung auf 45 % Sättigung einstellen Berechnung: (45 % x Volumen) geteilt durch (100 % - 45 %) Bei 1,2 ml: 45 x 1,2 = / 55 = 0, µl gesättigte AS-Lösung auf Gesamt-Überstand bzw. 491 µl pro Eppi mischen und über Nacht im Kühlschrank inkubieren Behandlung der Proben P1, P2: P1 zu 20 µl Probe 60 µl H 2 O geben, 20 µl 5 x SDS-Probenpuffer zugeben, einfrieren auf 20 C P2 4 µl 5 x SDS-Probenpuffer zugeben, einfrieren auf 20 C 26

29 Taq-Reinigung AS-Fällung, Affinitätsreinigung, Tag 2 Materialien: - Ammoniumsulfatfällung - Ni 2+ -NTA-Agarose, equilibriert in Bindungspuffer Ni 2+ -NTA - Bindungspuffer Ni 2+ -NTA - Pipetten - Pipettenspitzen (gelb, blau) - Eppendorf-Kühlzentrifugen - Überkopf-Mischer - sterile Eppendorf Tubes 1,5 ml Versuchsdurchführung: Ammoniumsulfatfällung zentrifugieren 30 min/ rpm/ 4 C, Eppendorf-Kühlzentrifuge Überstand abnehmen und verwerfen Protein-Pellets in je 100 µl Bindungspuffer Ni 2+ -NTA lösen, Schaumbildung vermeiden!, vereinigen (in ein 1,5 ml Eppi überführen), 100 µl Ni 2+ -NTA-Agarosebead-Suspension zugeben; Vor dem Pipettieren der Ni 2+ -NTA-Agarose: - von einer gelben Spitze ca. 3 mm abschneiden und diese Spitze zum Pipettieren der Suspension verwenden (die beads können sonst die kleine Öffnung der Spitze verstopfen) - vor dem Pipettieren die Suspension gut mischen (vortexen), da sich die Agarose-beads schnell absetzen (Ni 2+ -NTA-Agarose ist resuspendiert in 1 Volumen Bindungspuffer 100 µl Ni 2+ - NTA-Agarose-Suspension entsprechen = 50 µl Beads-Volumen) Am Überkopf-Mischer über Nacht bei RT inkubieren 27

30 Taq-Reinigung Affinitätsreinigung, Tag 3 Materialien: - Bindungsreaktion Ni 2+ -NTA-Agarose mit gelöster AS-Fällung - Waschpuffer Ni 2+ -NTA - Bindungspuffer Ni 2+ -NTA - Elutionspuffer Ni 2+ -NTA - Pipetten - Pipettenspitzen (gelb, blau) - Eisbad - Eppendorf-Kühlzentrifugen - sterile Eppendorf Tubes 1,5 ml Versuchsdurchführung: Bindungsreaktion Ni 2+ -NTA-Agarose mit gelöster AS-Fällung zentrifugieren 2 min, 2000 rpm vor Start der Zentrifuge Orientierung des Eppis merken Eppiwand, an die Ni 2+ -NTA- Agarosebeads zentrifugiert werden Überstand abnehmen mit 100 µl Pipette, gelbe Spitze Überstand langsam abpipettieren, Spitze von oben mit dem sinkenden Flüssigkeitsspiegel mitführen; Spitze NICHT bis zum Eppi-Boden eintauchen um ein Aufwirbeln bzw. Mitpipettieren der beads zu vermeiden Agarosebead-Pellet ist sehr schlecht zu sehen eventuell ca. 20 µl Überstand stehen lassen ; Agarose-beads waschen: 2 x mit je 1 ml Bindungspuffer Ni 2+ -NTA 2 x mit je 1 ml Waschpuffer Ni 2+ -NTA 1 x mit je 1 ml Bindungspuffer Ni 2+ -NTA (Welche unspezifischen Bindungen werden durch Waschen mit Hochsalz einerseits und mit Detergenz andererseits zerstört?) nach jedem Waschschritt zentrifugieren 2 min, 2000 rpm wieder gilt: Überstand sehr vorsichtig abnehmen, jeweils Orientierung des Eppis in der Zentrifuge merken (siehe oben); NICHT sofort 1000 µl mit blauer Spitze abpipettieren, sondern zunächst ca. 600 µl mit blauer Spitze von oben nach unten vorsichtig abnehmen, dann mit gelber Spitze den Rest in 100 µl Schritten abpipettieren, eventuell µl stehen lassen um Verlust von Ni 2+ -NTA-Agarose zu vermeiden; nach dem letzen Waschschritt Puffer sehr vorsichtig möglichst quantitativ entfernen; Eluieren der Taq-Polymerase von der Ni 2+ -NTA-Agarose 100 µl Elutionspuffer Ni 2+ -NTA zu den Agarose-beads geben, mischen, für 2 min. auf Eis inkubieren; zentrifugieren und pipettieren wie oben Überstand in frisches Eppi, keine beads mitschleppen! = Eluat 1 (E1) Elution 2 x wiederholen (E2 E3) Je 5 µl von jeder Elutionsfraktion abnehmen, mit E1-S - E3-S beschriften und für spätere SDS- Gelelektrophorese bei 20 C einfrieren 28

31 Taq-Reinigung Dialyse, Tag 3 Materialien: - Elutionsfraktionen E1-E3 - Lagerungspuffer - Pipetten - Pipettenspitzen (gelb, blau) - Dialysemembran mit Gummiringen - Eisbad - Eppendorf-Kühlzentrifugen - sterile Eppendorf Tubes 1,5 ml Versuchsdurchführung: Lagerungspuffer ansetzen (2 x 1 L für alle Gruppen) und in 1 L Flaschen auf Eis vorkühlen; vor Dialyse in 1 L Becherglas überführen und Rührfisch reingeben; Becherglas in runde Eisbox (ohne Eis) stellen, Becherglas mit Alufolie oder Parafilm verschließen, Eis um das Becherglas herum auffüllen Hauptmenge der Eluate E1 E3 in einem Eppi ohne Deckel vereinigen, Schaumbildung vermeiden! Dialyse-Membran über Eppis mit Gummiring fixieren und durch Ziehen an Enden glätten; Oberfläche muss wie bei einer Trommel gespannt und völlig faltenfrei sein! mit Dialyse-Membran verschlossene Eppis in Schwimmer bis auf Anschlag einsetzen und mit der Membran nach unten in Lagerungspuffer platzieren (schräg einsetzen um Fangen von Luftblasen unter Dialysemembran zu verhindern); sicherstellen, dass Proteinlösung quantitativ aus der Eppi-Spitze nach unten auf die Dialysemembran gelaufen ist! Deckel auf Eisbox, über Nacht unter Rühren dialysieren; Dialysierte Taq-Polymerase-Lösung in frisches Eppi (1,5 ml) überführen und für die 3. Woche (DNA-Analytik) bei -20 C einfrieren. 29

32 SDS-Gelelektrophorese Native Protein können in einer Gelmatrix, in der Regel Polyacrilamid (PAA), nicht der Größe nach getrennt werden. Die Ladung eines Proteins hängt von seiner Aminosäuresequenz ab. Diese bestimmt auch die Faltung und damit die räumliche Struktur eines Proteins. Proteine mit der gleichen Anzahl an Aminosäuren können völlig unterschiedliche Ladungen aufweisen und von kompakter bis zu linearer Struktur unterschiedlich viel Raum einnehmen. Um Proteine der Größe nach aufzutrennen müssen sie zunächst denaturiert werden. Erhitzen auf 100 C und Zugabe eines Detergenz (Natrium-Dodecylsulfat, SDS) führt dazu, dass Proteine vollständig entfaltet werden und alle in einer linearen Aminosäurekette vorliegen. Durch Zugabe eines Reduktionsmittels werden die S-S-Brücken innerhalb bzw. zwischen Aminosäureketten aufgebrochen. Dodecylsulfat lagert sich gleichmäßig an diese Aminosäureketten an. Die resultierenden Dodecylsulfat-Polypeptid-Komplexe weisen eine konstante Ladungsdichte auf (Verhältnis Ladung pro Masseeinheit ist konstant) und haben eine annähernd lineare Form. Auf diese Weise können Proteine in einer Matrix im elektrischen Feld nach ihrer Größe aufgetrennt werden. Die Porengröße eines PAA-Gels und damit die Auftrennung der Proteine wird hauptsächlich durch die Konzentration an Acrylamid (8 20 %) und den Grad der Vernetzung bestimmt. Im Praktikum verwenden wir die diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese. Dazu wird ein niedrigprozentiges Sammelgel über ein hochprozentiges Trenngel gegossen. ph 6,8 im Sammelgel führt zu einer Sortierung der Proteine nach Ihrer elektrophoretischen Mobilität und einer Fokusierung der Proteinbanden. Im Trenngel werden die Proteine dann bei ph 8,8 der Größe nach aufgerennt. (Bitte Theorieteil zur diskontinuierlichen Gelelktrophorese lesen!). Der blaue Farbstoff im Auftragspuffer (Bromphenolblau) zeigt die Lauffront während der Elektophorese und dient NICHT zur Färbung der Proteine! Die Färbung der Proteine erfolgt im Gel mit Coomassie-Brilliant-Blau. Dieser Triphenylmethanfarbstoff bildet im sauren Milieu eine unprotonierte, anionische Sulfonatform aus, die mit Proteinen unspezifische Komplexe bildet. Der Farbstoff interagiert dabei mit kationischen und nichtpolaren, hydrophoben Seitenketten. Je nach Aminosäurezusammensetzung können damit 100 ng 1 µg Protein noch deutlich nachgewiesen werden. Für die Färbung wird das PAA- Gel in einer Coomassie-Lösung in Essigsäure geschwenkt und nach ca. einer Stunde das überschüssige Coomassie mit reiner 10 % Essigsäure wieder ausgewaschen. Die PAA-Matrix wird klar und nur die Proteinbanden bleiben gefärbt. 30

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