Klinischer und diagnostischer Einsatz der Infrarot-(IR)-Spektroskopie

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1 Probevorlesung - Dr. Jürgen Schiller Klinischer und diagnostischer Einsatz der Infrarot-(IR)-Spektroskopie J. Schiller - Folie 1

2 Was erwartet Sie jetzt im einzelnen? 1) Theoretische & experimentelle Grundlagen Was sind "spektroskopische" Verfahren? Das elektromagnetische Spektrum Einige historische Notizen Was mißt die IR-Spektroskopie? Vor- und Nachteile der Methode 2) Potentielle klinische Anwendungen a) Blut/Serum Welche Metabolite werden erfaßt? Wie ist die Korrelation mit anderen Methoden? b) Foetales Lungensurfactant c) Urin d) Speichel e) Synovialflüssigkeiten Blutzuckerbestimmung IR-Bildgebung Zusammenfassung & Ausblick J. Schiller - Folie 2

3 Was ich an Literatur empfehlen würde... Hans-Joachim Galla, "Spektroskopische Methoden in der Biochemie, Georg-Thieme Verlag, Stuttgart, 1988, ISBN Manfred Hesse, Herbert Meier, Bernd Zeeh, "Spektroskopische Methoden in der organischen Chemie", Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1995, ISBN Helmut Günzler, Harald Böck, "IR-Spektroskopie", Verlag Chemie GmbH, Weinheim, 1983, ISBN X. Robert A. Meyers (Hrsg.) "Encyclopedia of Analytical Chemistry" Band 1 - Applications of Instrumental Methods, John Wiley & sons, Chichester, 2000, ISBN Foliensatz J. Schiller - Folie 3

4 Was sind "spektroskopische Verfahren"? Impuls bzw. "Energie-Quantelung": In atomaren Dimensionen können Systeme nicht mehr beliebige Werte von Impuls- bzw. Energie annehmen, sondern nur noch diskrete Werte (vgl. z.b. Emissionslinien des Wasserstoff-Atoms oder charakteristisches Röntgenspektrum) Quantenmechanik! Die Energiedifferenz ( E) zwischen zwei Energiezuständen kann durch Strahlung geeigneter Frequenz aufgebracht werden, entsprechend der BOHR schen Beziehung: E -E = 1 2 E=h -34 Planck sches Wirkungsquantum: h = Js Absorption: Aufnahme von elektromagnetischer Strahlung Emission: Abgabe von elektromagnetischer Strahlung J. Schiller - Folie 4

5 Wichtige Größen: Die Grundlage aller spektroskopischen Verfahren: Elektromagnetische Wellen Wellenlänge, [m] (meist nm) Wellenzahl = 1/, ~ [m ] Frequenz, [s bzw. Hz] Energie, E [J] Umrechnungen: c= E=h =h c =hc ~ h, Plank sches Wirkungsquantum: Js c, Lichtgeschwindigkeit im Vakuum: m/s ~ Wellenzahl [cm ] = 4 10 Wellenlänge [µm] = 7 10 Wellenlänge [nm] J. Schiller - Folie 5

6 Der IR-Bereich etwas näher betrachtet... IR reicht von "Rot" im sichtbaren Bereich des Spektrums (ca. 780 nm bzw cm bis in den Mikrowellenbereich (ca. 1 mm bzw. 10 cm ). Wichtig: Je höher die Frequenz (also je niedriger die Wellenlänge), desto höher ist die Energie der Strahlung! Einteilung Wellenzahl [cm ] Nahes IR (NIR) Mittleres IR (MIR) Fernes IR (FIR) Wellenlänge 780nm -2500nm 2.5µm-25µm 25µm000µm J. Schiller - Folie 6

7 1800: HERSCHEL entdeckt im Sonnenlicht eine nicht sichtbare Strahlung ("Ultrarot"). TALBOT formuliert 1826 die Idee der Spektralanalyse: Aus den Linien im Spektrum sollte es möglich sein, Substanzen zu identifizieren... MITSCHERLICH nimmt 1862 Spektren chemischer Verbindungen auf. COBLENTZ Stoffe. Ein kurzer historischer Abriß... veröffentlicht 1905 (1910?) "Infrarot-Spiegelspektrograph" der Firma Steinheil 1938 Bau eines der ersten IR-Geräte durch LEHRER und LUFT bei der BASF. Name des Gerätes: URAS (=Ultrarotabsorbtionsschreiber) 1939 erfolgte Bau des ersten vollautomatischen "Ultrarotspektrometers" durch LEHRER (Wellenlängenbereich bis ca. 15 µm) Beginn der systematischen, spektroskopischen Strukturanalyse. Kommerzielle Verfügbarkeit von Geräten: Elmer). 1983: Vorstellung des ersten FTIR-Gerätes die ultraroten (IR)-Absorptionspektren zahlreicher 1942 (Beckmann) und 1944 (Perkin- Ende der 70er Jahre: Breitere Anwendung der Technik zur Analytik von Körperflüssigkeiten, Zellkulturen, Gewebeproben, usw. J. Schiller - Folie 7

8 Was mißt man eigentlich bei der IR-Spektroskopie? IR-Spektroskopie = Schwingungs-Spektroskopie Mechanisches Analogon "Harmonischer Oszillator" m 1,m 2: Masse k, Kraftkonstante r 0, "Ruheabstand" µ, reduziert Masse: µ= m1 m2 m + m 1 2 =c ~ vib = 1 2 ~ = 1 2 c k µ k µ ABER: Nicht alle Energien! ( Quantenmechanik!) "Quantelung" E = (v + 1 (v) ) h 2 (v = 1,2,3...) vibr J. Schiller - Folie 8

9 Was mißt man eigentlich bei der IR-Spektroskopie? Schwingungen H O H Nichtlineares Molekül: 3N-6 Vibrationen Lineares Molekül: 3N-5 Vibrationen Beispiel 1: Wasser Nicht linear N = 3 3 Schwingungen H O 3657 cm 1595 cm 3756 cm H H O H Symmetrische Streckschwingung Asymmetrische Biegeschwingung Asymmetrische Streckschwingung Beispiel 2: Kohlendioxid Linear 4 Schwingungen O C O O C O O C O O C O Symmetrische Streckschwingung Asymmetrische Streckschwingung Beugeschwingung in der Ebene Beugeschwingung senkrecht zur Papierebene J. Schiller - Folie 9

10 IR-Spektren werden sehr schnell sehr kompliziert Makromoleküle liefern meist sehr komplexe Spektren! J. Schiller - Folie 10

11 Welche Vorteile bietet die IR-Spektroskopie eigentlich? Keine spezifische Nachweismethode Auch unbekannte, d.h. unerwartete Metabolite können erfaßt werden. Keine Anwendung irgendwelcher Reagenzien zur Derivatisierung der Probe notwendig Probe kann beliebig oft gemessen und dann wiedergewonnen werden. Billig in der Durchführung. Sehr schnelle und einfache Durchführung einer Messung. Durch Entwicklung neuer Auswerte-Routinen (erst in jüngster Zeit) quantitative Auswertung von IR-Spektren routinemäßig möglich. Ein IR-Spektrum enthält - wenigstens im Prinzip - Informationen zu allen darin enthaltenen Verbindungen. J. Schiller - Folie 11

12 Quantitative Auswertung von IR-Spektren Beer s Gesetz: A = ε cl Σ Allgemeinere Form: A = c L Meistens bei der Auswertung verwendet: ε i i A, Absorption e, Substanzspezifischer Koeffizient c, Konzentration L, Länge der Küvette (Schichtdicke) c i = K 0i + K1i A( λ1) + K2iA( λ2) KNi A( λn) 230mM Harnstoff 30mM Urin Wellenlänge [nm] Beispiel: Bestimmung von in Urin: =0+68 c (Harnstoff) = A (2152 nm) A (1194 nm) A (1724 nm) Harnstoff J. Schiller - Folie 12

13 Welche Nachteile hat die IR-Spektroskopie? In biologischen Proben ist immer Wasser das Lösungsmittel und Wasser ergibt ein wunderbares IR-Spektrum!! Welche Methoden zur Abhilfe gibt es? a) Subtraktion der Einzelspektren (simple Technik!) Absorption Serum (1) Wasser (2) (1) - (2) Wellenzahl [cm ] Eliminierung der H2O-Banden durch Differenzbildung! Aber: Dadurch wird das Rauschen intensiver! J. Schiller - Folie 13

14 Welche Nachteile hat die IR-Spektroskopie? Wasser ergibt sehr intensive IR-Banden (bei ca und 1600 cm )! Welche Methoden zur Abhilfe gibt es? b) Trocknen der Probe c) Abgeschwächte Totalreflektion Spektrum einer getrockneten Serum-Probe (ca. 50 µl) a) Totalreflektion b) Abgeschwächte Totalreflektion (ATR) 0.8 Absorption Wellenzahl [cm ] Flüchtige Substanzen kann man so nicht mehr nachweisen! Brechzahll der Platte n1 groß gegen Brechzahl n der Probe! 2 J. Schiller - Folie 14

15 Welchen diagnostischen Nutzen hat die IR-Spektroskopie an Blut und was mißt man? Meßgröße Referenz-Interval Höher/Niedriger bei g/l Hypovolämie, Mangelernährung, Leber,-Nierenerkrankung, Fieber, (Adult) Entzündung Gesamtprotein Albumin Harnstoff Glucose Cholesterol Triglyzeride g/l (Adult) 78 mg/dl (Adult) ( mm) 6505 mg/dl (Adult) ( mm) mg/dl (Mann) ( mm) mg/dl (Frau) ( mm) 4889 mg/dl (Mann) ( mm) 4017 mg/dl (Frau) ( mm) Wassermangel Schwangerschaft Nierenstörung, Infarkt,Leberschaden, Aufnahme von wenig Protei, Nephrotisches Syndrom Diabetes mellitus, Akute Pankreatitis, Streß/Schock, Leberund Pankreas-Erkrankungen Idiobatische Hypercholesterinämie, Gallensteine, Schwerer Leberschaden, Fehlernährung, Hyperthyreose Lebererkrankungen, Hyperlipidämie, Alkoholismus, Gicht, Fehlernährung J. Schiller - Folie 15

16 Welche Metabolite sind im Blut mittels IR detektierbar? Die Mehrzahl der diagnostisch bedeutsamsten Verbindungen besitzt ein sehr charakteristisches IR-Spektrum Analytik im Gemisch ist möglich! Tripalmitin C H O C O O CH 2 Albumin C H C H C O C O O CH CH 2 Glucose Cholesterol H HO CH OH 2 OH H O H OH H OH HN 2 C CH 3 CH 3 O NH 2 Harnstoff CH 3 CH Wellenzahl [cm ] HO HC 3 J. Schiller - Folie 16

17 "Spektren-Nachbearbeitung" und Anpassung an ein mathematisches Modell a) z.b. Bilden der Ableitung b) Mathematische Anpassung C Prot ein = A (2064 nm) A (1440 nm) Wellenlänge [nm] Protein Harnstoff Die erste Ableitung gibt die Steigung einer Funktion an, die zweite Ableitung hingegen die Krümmung! Aufnahme von "Gemischspektren" ist erforderlich Komplizierte Gleichungen Aber: Darum kümmert sich in der Regel der Gerätehersteller! J. Schiller - Folie 17

18 Sehr oft erhält man eine sehr gute Übereinstimmung mit den Meßwerten etablierterer Methoden Offene Symbole: Proben bekannter Konzentration; Geschlossene Symbole: Unbekannte Proben IR-Triacylglycerol Triacylglycerol 350 Cholesterol Lactat 40 IR-Cholesterol IR-Lactat Referenz [mg dl ] Referenz [mg dl ] Referenz [mg dl ] ("Referenz": Konzentrationen wurden nach Standard-Verfahren bestimmt!) Übereinstimmung der Ergebnisse ist je nach Metabolit unterschiedlich! Aber: Auch klinische Tests gehen unterschiedlich gut! J. Schiller - Folie 18

19 Zweites Beispiel: Fötales Lungensurfactant Die Zusammensetzung des Lungensurfactants des Fötus kann aus dem Fruchtwasser der Schwangeren abgeschätzt werden: Absorption 0.20 Protein Lipid 0.05 Verhältnis über IR bestimmt Surfactant Probe Artifizielles Gemisch Hauptbestandteile: Wellenzahl [cm ] Referenz Dünnschicht [mg surfactant / g Protein] Protein & Phospholipid Gute Übereinstimmung! 0 J. Schiller - Folie 19

20 Drittes Beispiel: Urin Wesentlichster Bestandteil: Harnstoff! Harnstoff Urin Wiederum sehr gute Übereinstimmung zwischen den IR-Spektren der reinen Lösung und der eigentlichen Körperflüssigkeit! Wellenlänge [nm] Urin wird sehr oft für derartige Untersuchungen verwendet, da er besonders leicht und in großen Mengen verfügbar ist. Aber: Urin ist im Vergleich zu z.b. Blut sehr dünn (d.h. enthält besonders viel Wasser!). J. Schiller - Folie 20

21 Drittes Beispiel: Speichel Sehr ungewöhnlicher Bestandteil: Thiocyanat (SCN - ) SCN Die Thiocyanat-Konzentration im Speichel kann sehr leicht über die Auswertung der IR-Bande bei 2058 cm bestimmt werden! Wellenzahl [cm ] Physiologische Bedeutung: [Enzym] H2O 2 + SCN HOSCN + HO Hochreaktiv! Hypothiocyansäure J. Schiller - Folie 21

22 Viertes Beispiel: Synovialflüssigkeit Rheumatische Erkrankungen sind besonders häufig und besitzen deshalb besonders hohe Relevanz (Kosten!). Oberschenkel Synovial membran Synovial flüssigkeit Knorpel Unterschenkel Thiocyanat dient als Standard! Wellenzahl [cm ] Durch "spectral pattern analysis" erreicht man hier eine hervorragende Korrelation mit der klinischen Diagnose! Klinische Diagnose SA RA OA "IR-Diagnose" SA RA OA J. Schiller - Folie 22

23 Eine weitere sehr wichtige Anwendung von IR wäre die nicht-invasive Blutzuckerbestimmung Nahrung (Kohlenhydrate) Kontrolliert die Glucosekonzentration im Blut! Darm Stärke Insulin Leber Glucose Körper Pankreas Diabetes: Unfähigkeit des Körpers die Glucosekonzentration im Blut richtig zu regulieren! Abhilfe: Insulin wird je nach Blutzuckergehalt gespritzt Notwendig ist eine häufige Blutzuckerbestimmung! J. Schiller - Folie 23

24 Die richtige Einstellung der Glucosekonzentration im Blut ist nicht ganz trivial! Zu viel Glucose (Hyperglykämie): Glucose reagiert mit Proteinen Erblindung, Nerven,- und Nierenschädigungen Zu wenig Glucose (Hypoglykämie): Akute Gefahr Hirn braucht unbedingt Glucose Patient kann in Koma fallen Was ist zu tun: 4-6 mal täglich Glucose bestimmen Insulin nach Bedarf spritzen Probleme: Schmerzhaft Risiko von Entzündungen Teuer: Teststreifen, Entnahmeinstrumente Unmöglich in der Nacht J. Schiller - Folie 24

25 In vitro geht die IR-spektroskopische Bestimmung von Glucose sehr gut Aufnahme des Spektrums Konzentrationsabhängigkeit Eichgerade Absorption (µau) µm CH OH 2 H O H OH H HO OH H OH 2.27 µm 2.32 µm 5 mm Glucose 1 mm Schichtdicke Ermittelte Konzentration [mm] Standardabweichung: 0.39 mm Wellenlänge [µm] Tatsächliche Konzentration [mm] Nornales Glucose-Level im Blut ~ 5.5 mm (100 mg/dl) J. Schiller - Folie 25

26 Aber in vivo ist die Genauigkeit des Assays wegen weiterer, überlappender Banden doch stark reduziert Gemessene Glucose-Konzentration [mm] E D Kalibrierung Vorhersage C C Tatsächliche Glucose-Konzentration [mm] B D E A B A Kalibrierung wurde mit einem Probanden über 29 Tage durchgeführt Messung dann über die folgenden 10 Tage Messung an der Zunge "Clarke-Error-Gitter": A: gute Genauigkeit, E: extrem schlechte Übereinstimmung Abweichung ~ 3.4 mm; vor allem bei kleineren Konzentrationen! Die IR-Spektroskopie erfüllt die "Clarke-Kriterien", aber nicht die sogen. "Barnett-Kriterien" (maximale Abweichung für Glucose darf 0.28 mm betragen). Dennoch ein hoffnungsvoller Ansatz für die Zukunft! J. Schiller - Folie 26

27 Es gibt auch IR-Bildgebung... Histologisches Schnittpäparat als Referenz Protein (1656 cm) J. Schiller - Folie 27 Lipide (1740 cm) Collagen (1204 cm) DNA (1718 cm)

28 Zusammenfassung & Ausblick Die Schwingungs-(IR)-Spektroskopie ergibt bei einer Vielzahl von Körperflüssigkeiten (insbesondere bei der Serumdiagnostik) analoge Ergebnisse wie die etablierten Techniken. IR ist hinsichtlich der Schnelligkeit der Durchführung anderen Techniken überlegen, da ein IR-Spektrum - im Prinzip - quantitative Informationen zu allen enthaltenen Verbindungen liefert. Aufgrund der starken Überlappung sind mathematische Modelle zur Auswertung der Spektren notwendig; unbekannte (unerwartete) Metabolite stören die Auswertung beträchtlich. Da IR zumindest wenige Zentimeter in Gewebe eindringen kann, sind bildgebende Verfahren möglich und werden bereits angewendet Die Methodik hat großes Potential! Ob und wieweit dieses Potential ausgeschöpft werden wird, das muß die Zukunft weisen. J. Schiller - Folie 28