Der Rezeptor ERBB2: ein unverzichtbares Onkogen The ERBB2 receptor: a necessary proto oncogene

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1 Der Rezeptor ERBB2: ein unverzichtbares Onkogen The ERBB2 receptor: a necessary proto oncogene Reischauer, Sven Max-Planck-Institut für Herz- und Lungenforschung, Bad Nauheim Korrespondierender Autor sven.reischauer@mpi-bn.mpg.de Zusammenfassung Der Zelloberflächenrezeptor ERBB2 spielt eine zentrale Rolle in der Organentwicklung. Als Onkogen ist ERBB2 im überaktivierten Zustand jedoch auch an der Entstehung von Krebs, besonders Brustkrebs, beteiligt. Daher wird bei einigen Brustkrebstherapien neben der klassischen Chemotherapie mit Doxorubicin ein Antikörper zur immunotherapeutischen Inaktivierung von ERBB2 eingesetzt. Dies führt jedoch in 10 bis 12 Prozent der Fälle zur Entwicklung einer dilatativen Kardiomyopathie. Eine Funktionsanalyse von ErbB2 in Herzmuskelzellen des Zebrabärblings gibt Einblick in mögliche Ursachen. Summary During development cardiac morphogenesis relies on the concerted activity of several growth factor receptors including the proto oncogene ERBB2. In adults, its cardiotoxicity causes severe side effects in anti-erbb2 cancer therapies. Therefore we developed a transgenic zebrafish line to elucidate the role of ErbB2 signaling in cardiomyocytes. Using this novel tool combined with state-of-the-art microscopy, we were able to identify ErbB2 as a mediator of remodeling of the contractile machinery, an unexpected mechanism with potentially important implications to human health. ERBB2: Ein unverzichtbares Onkogen Das Mammakarzinom (Brustkrebs) ist mit einer Zahl von etwa Neuerkrankungen pro Jahr [1] eine der häufigsten Krebserkrankungen bei Frauen in Deutschland. Bei etwa 25 Prozent der diagnostizierten Patientinnen zeigen die Zellen des Tumors eine Überexpression des Onkogens ERBB2, die als Ursache gesehen wird. Diese sogenannten ERBB2 + -Patientinnen haben eine negative Prognose für den weiteren Verlauf der Erkrankung [2]. In diesen Fällen wird eine Kombinationstherapie angewendet, die neben Zytostatika auch einen speziell gegen ERBB2 gerichteten Antikörper einsetzt. Dieser Antikörper bindet an den auf der Zelloberfläche befindlichen Rezeptor und blockiert die Signalweiterleitung. Jedoch lässt sich diese Behandlung unglücklicherweise nicht lokal auf das Gebiet des Tumors beschränken, was dazu führt, dass die ErbB2-vermittelte Signalkaskade in allen Körperzellen, einschließlich des Herzens, reduziert wird. Frühere Studien hatten bereits nahegelegt, dass ErbB2-vermittelte Signale wichtig für die frühe Entwicklung des 2014 Max-Planck-Gesellschaft 1/5

2 Herzens sind [3; 4]. Dennoch war es überraschend, dass bis zu 12 Prozent der Patientinnen, die einer solchen anti-erbb2-therapie unterzogen wurden, eine dilatative Kardiomyopathie, eine krankhafte Erweiterung des Herzmuskels, als Nebenwirkung entwickelten. Daraufhin unternommene Studien an Mäusen und in vitro kultivierten Herzmuskelzellen zeigten, dass ErbB2 als sogenannter survival factor eine schützende Wirkung auf Herzmuskelzellen besitzt, was die Nebenwirkung erklären könnte [5]. Andere Studien hingegen zeigten, dass bei vererbten Fällen der dilatativen Kardiomyopathie die Gene eine Rolle spielen, die an der Bildung der kontraktilen Einheiten einer Muskelzelle, den Sarkomeren, beteiligt sind (zusammengefasst in [6]). Dies legt wiederum nahe, dass ErbB2 nicht ausschließlich die Funktion als Zellschutzfaktor zugeschrieben werden kann, sondern dass ebenso eine Beteiligung von ErbB2 an der Regulation eben jener Sarkomere in Frage kommt. A bb. 1: Entwicklung einer Aktin abbildenden Zebrabärblingslinie. (A ) Schem atische Darstellung des Aktin bindenden fluoreszierenden Proteins EGFP und der entsprechenden Bindestellen auf Sarkom eren (thin filam ent). (B) Ventrale Ansicht einer transgenen Zebrafischlarve m it EGFP-Expression im Herz. (C) Konfokale Laserscanning- Aufnahm e des Ventrikels eines transgenen Fisches. Gut zu erkennen sind die Sarkom ere, die kleinsten funktionellen Einheiten einer Muskelzelle, hier in weiß dargestellt. Das Herz, ein schwieriger Forschungsgegenstand In den gängigen Tiermodellen wie beispielsweise der Maus lässt sich die Struktur von Sarkomeren allerdings nur bedingt unter realen Bedingungen untersuchen, da bildgebende Verfahren nicht an lebendem Gewebe anwendbar sind. Andererseits stellen kultivierte Herzmuskelzellen ein artifizielles System dar, in dem sich feine Unterschiede nicht unter realen Bedingungen beobachten lassen. Um eine eventuelle Funktion von ErbB2 im lebenden Tiermodell, also in vivo, direkt untersuchen zu können, wählten die Wissenschaftler um Sven Reischauer den Zebrabärbling als idealen Modellorganismus und entwickelten in ihrem Labor speziell dafür eine transgene Linie. Der Zebrabärbling als Versuchstier bietet einige entscheidende Vorteile für dieses Projekt. Die Entwicklung von der befruchteten Eizelle bis zur Ausbildung der inneren Organe einschließlich des Herzens verläuft enorm schnell und ist 48 Stunden nach Befruchtung abgeschlossen. Der Zebrabärbling ist als Larve vollkommen transparent, was die bildgebende Untersuchung der Entwicklung des Herzens und anderer innerer Organe stark vereinfacht. Desweiteren findet die Befruchtung und Entwicklung im Gegensatz zu Säugetieren 2014 Max-Planck-Gesellschaft 2/5

3 außerhalb des Muttertieres statt. Um die Ausbildung der Sarkomere im Zebrafisch zu untersuchen, etablierten die Wissenschaftler in der Gruppe von Sven Reischauer eine transgene Linie des Zebrabärblings, die das grün fluoreszierende Protein EGFP unter der Kontrolle eines Myokard-spezifischen Promoters (myl7) exprimiert. Außerdem modifizierten die Max-Planck-Forscher EGFP dahingehend, dass es an eine zentrale Komponente von Sarkomeren, das Aktin, bindet. In derart modifizierten Zebrabärblingslarven auch als Sarkomer- Reporter-Fisch bezeichnet lassen sich nun erstmalig mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie individuelle Sarkomere im schlagenden Herzen des Bärblings in vivo untersuchen (siehe Abb. 1). Neuland: Abbildung von Sarkomeren von Herzmuskelzellen in ihrer natürlichen Umgebung Zunächst wurde von Reischauers Arbeitsgruppe am MPI für Herz- und Lungenforschung ein Referenzdatensatz erstellt, welcher für weitere Forschungsvorhaben von großem Wert sein wird. Es stellte sich heraus, dass die Architektur von Sarkomeren in Herzmuskelzellen sehr stark davon abhängig ist, zu welchem Zeitpunkt, in welchem Teil des Herzens und in welchem Teil einer Zelle die Struktur betrachtet wird. Da frühere Untersuchungen dieser Strukturen auf fixiertes, also totes Gewebe angewiesen waren, erreicht dieses neue System eine bisher unerreichte Qualität und Genauigkeit. Zellen des kardialen Vorhofs (Atrium) zeigen eine Vielzahl stereotyper, unverzweigter Sarkomere, die in einer Orientierung quer zum Blutfluss gebildet werden. Zellen der Kammer (Ventrikel) hingegen zeigen ringförmige sowie fein verästelte Sarkomere, die bälkchenförmigen Trabekel wiederum zeigen feine lineare Sarkomere (Abb. 2). Anhand dieser Architektur lassen sich auch gleich die zwei unterschiedlichen Betriebsmodi des Atrium und des Ventrikel ableiten. Während im Atrium linear organisierte Sarkomere einen Ring um das Organ bilden und ihm somit die Funktion einer peristaltischen Pumpe geben, führen die ringförmigen Sarkomere am Kortex, der lateral außenstehenden Membran, innerhalb einer Zelle des Ventrikels dazu, dass eine Kontraktion die Fläche der jeweiligen Zelle verringert. Somit verkleinert sich das Lumen der Kammer als solches und der Inhalt wird ausgeworfen. A bb. 2: Sarkom ere Architektur in verschiedenen m yokardialen Subtypen. (A ) Sarkom ere in den Myozyten des Herzvorhofs. (B) Sarkom ere in den Zellen der Herzkam m erwand. (C) Sarkom ere in den Trabekeln der Herzkam m er. Die Funktion von ErbB2 bei der Lokalisierung und Größe von Sarkomeren Um den Effekt einer Blockade der ErbB2-Signale im Bärbling zu untersuchen, wurde der Sarkomer-Reporter- Fisch mit einer ErbB2-Rezeptor-defizienten Linie gekreuzt, also einem Fisch, der keinen ErbB2-Rezeptor bildet. Die daraufhin untersuchten Herzen, die jeweils keine aktiven ErbB2-Signale empfangen können, zeigen eine deutliche Veränderung der sarkomeren Strukturen (Abb. 3). Die fein verästelten Sarkomere, die in den Zellen der Kammer zu sehen sind, sind im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert und im Gegenzug sind jene dünnen 2014 Max-Planck-Gesellschaft 3/5

4 ringförmigen Sarkomere erheblich vergrößert. Trabekel-Strukturen werden in diesem ErbB2-negativen Hintergrund erst gar nicht ausgebildet. Allerdings ist in diesem Versuchsansatz, im Unterschied zu Patienten unter Antikörpertherapie, die ErbB2-Aktivität zu keinem Zeitpunkt vorhanden. Um die Situation im Patienten möglichst genau widerspiegeln zu können, wählten die Wissenschaftler ein System, das es ihnen erlaubt, die Aktivität nur vorübergehend zu reduzieren. Dazu benutzen sie einen chemischen Inhibitor, welcher die vorhandenen ErbB2-Rezeptoren bindet und mittels Alkylierung chemisch inaktiviert. Larven, die diesem Inhibitor zwischen 4,5 Tagen nach Befruchtung (dpf) und 6,5 dpf ausgesetzt waren, zeigen ebenfalls eine starke Veränderung der sarkomeren Strukturen. A bb. 3: Veränderung der sarkom eren Strukturen in den Zellen der ventrikulären Wand. Der Verlust von ErbB2-verm ittelten Signalen führt zu einer Reduktion feiner sarkom erer Strukturen und zu einer m assiven Überrepräsentation von Sarkom eren m it großem Durchm esser. Um den kausalen Mechanismus dieser Veränderung speziell im Herzen aufzuklären, wurde eine weitere Genveränderung in den Zebrabärblingen eingeführt. Zu diesem Zweck wurde ein sogenanntes dominant 2014 Max-Planck-Gesellschaft 4/5

5 negatives ErbB2-Protein (dn-erbb2) herzspezifisch exprimiert, welches die Funktion des normalen ErbB2- Rezeptors unterbindet. Dieser von Reischauer generierte transgene Fisch ermöglicht es erstmals, die Funktion von ErbB2 ausschließlich in den Muskelzellen des Herzens auszuschalten, während der Rest des Organismus davon nicht betroffen ist. Fische dieser Linie zeigten die Entwicklung einer dilatativen Kardiomyopathie und somit einer Herzinsuffizienz, während ansonsten keine weiteren Entwicklungsschäden auftraten. Für die Forscher das ideale Modell, um die Expression jener Gene zu untersuchen, die beim Menschen mit der erblich bedingten Form der Herzmuskelverdickung in Verbindung gebracht wurden. Es zeigt sich, dass der Verlust von ErbB2 in den Herzen der Versuchstiere eine Fehlregulation eben dieser Gene verursacht. Die Analyse all jener Gene, die die Wissenschaftler in ihrem Versuchsansatz identifizieren konnten, wird helfen den Mechanismus der dilatativen Kardiomyopathie in Brustkrebspatientinnen zu verstehen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass im Zuge dieses Projektes einige forschungstechnische Innovationen und Erkenntnisse gewonnen werden konnten, die ganz unabhängig von der ursprünglichen Fragestellung dem gesamten Feld der Erforschung von Kardiomyopathien dienen werden. Zum einen wurde ein transgenes Modell im Zebrabärbling entwickelt, das es erstmalig erlaubt, die Architektur und Funktion von Sarkomeren in vivo bildgebend zu beobachten. Zum anderen wurde erstmalig ein detailliertes Bild der Architektur von Sarkomeren in verschiedenen myokardialen Subtypen gewonnen. Die Erkenntnisse über die Funktion von ErbB2 in der Regulation der Sarkomer-Strukturen und somit das Wissen über die möglichen Ursachen der Entwicklung einer dilatativen Kardiomyopathie in Folge einer Kombinationstherapie bei ErbB2 + - Brustkrebspatientinnen wird in die Medikamentenentwicklung einfließen um eben jene Nebenwirkung in Zukunft zu vermeiden. [1] World Cancer Research Fund 2008 Cancer statistics World Cancer Research Fund International [2] Tsutsui, S.; Ohno, S.; Murakami, S.; Hachitanda, Y.; Oda, S.. Prognostic value of c-erbb2 expression in breast cancer. Journal of Surgical Oncology 79 (4), (2002) [3] Liu, J.; Bressan, M.; Hassel, D.; Huisken, J.; Staudt, D.; Kikuchi, K.; Poss, K. D.; Mikawa, T.; Stainier, D.Y. A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation. Development 137 (22), (2010) [4] Lee, K. F.; Simon, H.; Chen, H.; Bates, B.; Hung, M. C.; Hauser, C. Requirement for neuregulin receptor erbb2 in neural and cardiac development. Nature 378 (6555), (1995) [5] Fukazawa, R.; Miller, T. A.; Kuramochi, Y.; Frantz, S.; Kim, Y. D.; Marchionni, M. A.; Kelly, R. A.; Sawyer, D. B. Neuregulin-1 protects ventricular myocytes from anthracycline-induced apoptosis via erbb4-dependent activation of PI3-kinase/Akt. Journal of Molecular and Cellular Cardiology 35 (12), (2003) 2014 Max-Planck-Gesellschaft 5/5