Konfokale Laser-Scanning- Mikroskopie. Michael R. Koblischka FR Experimentalphysik, Universität des Saarlandes

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2 Konfokale Laser-Scanning- Mikroskopie Michael R. Koblischka FR Experimentalphysik, Universität des Saarlandes

3 Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie 3D-Darstellung Darstellung dicker Proben mit Submikrometer-Auflösung in Reflektion und Fluoreszenz Prinzip: Laser-Mikrostrahl Strahl wird beugungsbegrenzt fokussiert (Objektiv) Spotdurchmesser 200 nm 500 nm Scanning-Einheit Stage scan Beam scan Höchstgeschwindigkeit: : 3 Bilder/s z-verstellung in 40 nm-schritten möglich Konfokale Detektion Pinhole (Lochblende( Lochblende) out-of of-focus focus Signale werden nicht detektiert

4 Konfokales Scanning Mikroskop Marvin Minsky (MIT) Studium in Harvard und Princeton (Mathematik, Neurophysiologie, Embryologie, Neuroanatomie,Pyschologie Pyschologie, Mechanik) Post-Doc in Harvard: Studium der Hirnfunktion (im Lyman-Physiklabor Physiklabor) Problem Lösung Keine optische 3D-Darstellung Darstellung von gefärbten Neuronen möglich infolge Mehrfach-Streuung Konfokale Abbildung (Abrastern der Probe) Lichtquelle: Bogenlampe, Objektscanning: Roboterarm Brief vom mit Apparatur-Beschreibung an seinen Schwager (Patentanwalt) Patentanmeldung , Erteilung

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7 Konfokales Laser Scanning Mikroskop (CLSM, LSCM) 1. Laser (Punktquelle( Punktquelle) Gaslaser (He-Ne Ne, Ar+, Ar+/Kr+) Festkörperlaser (Nd:YAG) 2. x,y-scanning Scanning-Einheit Beam-Scanning khz-galvanospiegel Galvanospiegel, Rotationsspiegel Piezoablenker,, AO-Ablenker Ablenker Objekt-Scanning Tischverstellung (Schrittmotor) 3. Pinhole (Blende( Blende) kreisförmig, rechteckig > 50 µm, variabel, vor Detektor

8 Laser-Scanning Scanning-Mikroskop Grundgerät: Aufrechtes oder umgekehrtes Forschungsmikroskop Verfahren: - konventionell (mit Okularbeobachtung) Transmission Reflektion Fluoreszenz übliche Kontrastverfahren: Phako,, DIC - LSM-Modus Modus Transmission Reflektion/Fluoreszenz confocal (mit pinhole)

9 Kosten für ein solches System: ca

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14 3D- Mikroskopie mechanical sectioning Zerschneiden der Probe in Dünnschnitte Ultradünnschnitt: : 25 nm < d < 100 nm Semi-Dünnschnitt 0.1 µm < d < 1 µm Normalschnitt: : 1 µm < d < 100 µm Mikrotom: : 1 µm < d < 30 µm x n Vibratom: : 10 µm < d < 2 mm Kryostat: : 1 µm < d < 210 µm optical sectioning Abbilden von z-ebenen z der intakten Probe Schnittdicke: : 40 nm < d < Probendicke Begrenzung: Lichteindringtiefe Signalaustrittstiefe z-verstellung: Probentisch oder Objektiv

15 Neue Entwicklungen und Ausblick - SNOM (Scanning Near-field Optical Microscope Abstand d << Wellenlänge (nm-bereich Bereich) Glasfaser als Sonde, Analogie zu Raster-Tunnel Tunnel-Mikroskopie - Multiphotonenmikroskopie bes.. 2 -Photonenanregung im NIR Fluoreszenz im Sichtbaren - 4D-Mikroskopie zeitliche Auflösung im 3 D-D Raum

16 LSM Bilddarstellung Einzelbild einkanalig T, R, Fl mehrkanalig: Überlagerung T, R, Fl (bis( 5 Kanäle) Bildsequenzen (Schnittstapel)) und deren Darstellung als Gallery 3D-Bilder Farb-Höhenkarte (Falschfarbenzuordnung) Schnitte x-y y (z = const.) x-z z (y = const.) y-z z (x = const.) Zeitfunktionen Zeitserien Time scan (entlang( einer Linie -Fluoreszenzabklingzeit Time spot (z-richtung bei Punktanregung)

17 LSM Bildverarbeitung, Bildbearbeitung Messfunktionen Abstände, Flächen, Winkel Falschfarbendarstellung Histogrammauswertung Messungen in ROI Speichern und Laden von Bildern oder Serien (PC-Schnittstelle Schnittstelle) Bildbearbeitung ist äusserst wichtiges Hilfsmittel für die LSCM- Untersuchungen. Problem: Datensätze sind recht gross!

18 Was kann man mit konfokaler Mikroskopie messen? Beispiele: Identifizierung von Stoffwechselmetaboliten Nachweis von Protein-Protein Protein-Interaktionen (FRET) Visualisierung subzellulärer Proteinverteilung Beobachtung von Zellteilungszyklen oder cytoplasmotischer Ionenverteilungen (lifetime) Intrazelluläre Messung physiologischer Parameter (ph, pca,, po 2,etc.) Beispiele für Einsatzgebiete: Biopharmazie Bakterien in Gestein Qualitätssicherung von Druckpapier Halbleiterforschung

19 LSCM Menschliche Arterie Bilder bestehen aus 81 individuellen Schnitten, jeder Schnitt 1 MB Gesamter Datensatz: : 81 MB Probleme bei der Bildbearbeitungin Echtzeit

20 LSCM-Abbildung der Arterie einer Ratte in drei unterschiedlichen Abbildungsmoden a.) maximale Intensität b.) rendering, Aufsicht im hohen Winkel c.) nur Oberfläche betont d.) Blick innerhalb der Oberfläche in den Datensatz von c.)

21 Zeitaufgelöste Beobachtung einer Tetrahymena-Zelle Zeitabstand: 125 ms Laserlicht 488 nm grüne und rote Fluoreszenz in der Zelle kann beobachtet werden

22 Auge des Wasserflohs a.) ideale konfokale Konf. b/c/d.) Bildbearbeitung und Öffnen der Irisblende Saccharomyces cervisiae im Hopfen

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24 Z = 568 µm

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27 Netzartiges Implantat unbehandelt min3 modifiziert