Inhaltsverzeichnis der mikroskopischen Verfahren

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1 Inhaltsverzeichnis der mikroskopischen Verfahren 1. Warum benutzt man ein Mikroskop? (Version 10.15) 2. Optische Grundlagen 3. Mikroskopieren im Durchlicht 4. Mikroskopieren im Auflicht 5. Fluoreszenzmikroskopie 6. Mikroskopisches Messen 7. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie 8. Hochauflösungsmikroskopiemethoden 9. Elektronenoptik 10. Elektronenmikroskopie

2 Literatur: Mikroskopieren von Anfang an Carl Zeiss Jena GmbH (1) Bergmann Schaefer Lehrbuch der Experimentalphysik Band III, Optik Jörg Haus Optische Mikroskopie WILEY-VCH Verlag GmbH & KGaA Aktuelle Ausgabe T. Zimmermann Walter de Gruyter, Berlin, New York Laser-Ringe, Lichtblätter... Aktuelle Ausgabe Wohin geht die Entwicklung in der modernen Lichtmikroskopie? GIT Labor-Fachzeitschrift 05 / 2014 Maria Mulisch, Ulrich Welsch Romeis Mikroskopische Technik Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin Aktuelle Auflage

3 1. Warum benutzt man ein Mikroskop? Um diese Frage zu beantworten, müssen wir zunächst unser Auge betrachten. Die gekrümmte Oberfläche der Hornhaut entwirft zusammen mit der durch Muskeln verstellbaren Augenlinse ein Bild von einem Gegenstand (Objekt). Für eine scharfe Abbildung sorgt die flexible Linse, deren Brennweite durch Muskeln so angepasst wird, dass jedes Objekt, das sich zwischen ca. 20 cm und unendlicher Entfernung vor dem Auge befindet, scharf auf die Netzhaut abgebildet (fokussiert) werden kann. in elektrische Sig- Das Bild wird auf der Netzhaut von ca Lichtrezeptoren nale umgewandelt und über den Sehnerv zum Gehirn geleitet. Die brechenden Teile des Auges entwerfen auf der Netzhaut ein umgekehrtes reelles Bild eines Gegenstandes. Die Größe des Netzhautbildes ist direkt proportional zum Sehwinkel, unter dem das Objekt erscheint. Will man von einem Gegenstand mehr Details erkennen, muss er näher an das Auge gebracht werden. Näher als 20 cm können wir das Objekt aber nicht vor das Auge bringen, weil bei noch kleineren Gegenstandsweiten das Auge nicht mehr in der Lage ist, das Objekt scharf auf der Netzhaut abzubilden. Zwei Objektpunkte können nur dann getrennt wahrgenommen werden, wenn ihre beiden Bildpunkte auf zwei verschiedene Rezeptoren ( Zäpfchen / Stäbchen) fallen. Dies entspricht einem Sehwinkel von mindestens 1'. Unter Berücksichtigung der kleinsten Sehweite (Gegenstandsweite) von 20 cm bedeutet dies eine Gegenstandsgröße von 60 µm bzw. 0,06 mm.

4 Sehr kleine Gegenstände, z. B. die feinen Kapillaren eines Pflanzenstiels, haben Ausdehnungen von nur 0,01 mm bis herunter zu 0,001 mm. Mit dem "unbewaffneten" Auge können wir hier keine Details mehr erkennen, der Sehwinkel von diesen kleinen Objekten ist viel zu gering. Das Mikroskop hat also die Aufgabe, den Sehwinkel so zu vergrößern, damit die kleinen Objekte von unserem Auge gut wahrgenommen werden können. Im Prinzip besteht ein klassisches Mikroskop aus zwei Sammellinsen, dem Objektiv und dem Okular (lateinisch: oculus - Auge), deren Abstand voneinander wesentlich größer ist als die Summe der beiden Linsenbrennweiten. Zur Reduktion des Farbfehlers verwendet man heute keine Einzellinsen mehr, sondern Linsenkombinationen. Zwischenbild Auge Objekt Objektiv Okular Bild Bild 1: Optische Elemente beim klassisches Mikroskop

5 Das Objektiv entwirft ein vergrößertes Bild des Objekts in der sogenannten Zwischenbildebene und das Okular vergrößert anschließend das Zwischenbild wie eine Lupe. Zum fokussieren (Bild scharfstellen) wird der Abstand des Objekts zur Mikroskopoptik variiert, man ändert also die Gegenstandsweite und nicht (wie bei einem Fernrohr) den Abstand von Objektiv und Okular. Moderne Mikroskope haben eine "Unendlichoptik" nach dem sogenannten ICS-Prinzip (Infinity Colorcorrected System). Zur Unterstützung des Objektivs kommt hier eine Tubuslinse hinzu. Das Objektiv entwirft eine Abbildung in "unendlicher" Entfernung (paralleler Strahlengang), die Tubuslinse mit einer Brennweite von ca. 160 mm formt aus diesen parallelen Strahlen dann das Zwischenbild. Ein großer Vorteil der "Unendlichoptik" zeigt sich, wenn zusätzliche optische Komponenten in den Strahlengang zwischen Objektiv und Okular gebracht werden müssen. Insbesondere jede Form von Planoptik wie z. B. die Phasenringe beim Phasenkontrastverfahren führen hier zu keiner Änderung der Bildposition. Das Okular dient wiederum als Betrachtungslupe, um das kleine Zwischenbild dem Auge noch stärker vergrößert zu präsentieren. Auf diese Weise multipliziert sich der Vergrößerungseffekt, es werden bis zu ca fache Vergrößerungen (bei Verwendung von Immersionsöl) erreicht. Es gilt: Die Gesamtvergrößerung ist die Maßstabszahl M des Objektivs multipliziert mit der Okularvergrößerung

6 Ver- "Viel hilft viel" - dieser Satz gilt nicht für die Wahl der nützlichen größerung. oder förderlichen Gemeint ist damit, dass man die Gesamtvergrößerung eines Mikroskops nicht dadurch zu steigern versuchen sollte, in dem man stark nachvergrößernde Okulare oder andere "optische Nachbrenner" einsetzt, wenn das Objektiv bei kleiner numerischer Apertur (Öffnung) nicht genügend Bildpunkte liefert. Wie bei allen optischen Geräten gilt auch für das Mikroskop: das Auflösungsvermögen (begrenzt durch die Beugung des Lichts) bestimmt die Qualität der Abbildung. Objektiv Okular Auge Objekt Tubuslinse Zwischenbild Bild Bild 2: Optische Auslegung beim modernen Mikroskop, Abbildung nach dem ICS-Prinzip mit "oo-korrektur"

7 2. Optische Grundlagen Beobachtet man im Mikroskop kleine Objekte, so wird das (in der Regel von unten) einfallende Licht von den kleinen Objekten aus der ursprünglichen Richtung durch Beugung abgelenkt. Diese Ablenkung wird um so stärker, je kleiner die Objekte werden. Um von kleinen Strukturen scharfe Bilder zu bekommen, muss das Mikroskopobjektiv möglichst viel von dem gebeugten Licht erfassen. Dies setzt voraus, dass das Objektiv einen großen Raumwinkel aufweist. Die Objektivöffnung eines Mikroskops muss grundsätzlich die ersten Nebenmaxima des am Beobachtungsobjekt gebeugten Lichts registrieren können. Nur dann enthält das Mikroskopbild eine Mindestinformation über das Objekt (je kleiner das Objekt ist, umso größer ist der Beugungswinkel!). Statt Winkelgrößen gibt man die Apertur (Öffnung) an, genau genommen die numerische Apertur, die ein Maß für den Raumwinkel ist, den ein Objektiv "überblickt". Die numerische Apertur (NA) ist definiert als: NA = n. sin Ein Objektiv mit einer hohen numerische Apertur hat eine gute "Lichtaufnahmekapazität". : ist der halbe Öffnungswinkel des Objektivs, n: ist der Brechungsindex des zwischen Objektiv und Objekt verwendeten Immersionsmediums (Immersion: Einbetten oder Eintauchen). (n = 1 für Luft, n = 1,51 für Immersionsöl)

8 Objektiv Die numerische Apertur ist neben der Maßstabszahl M am Objektiv angegeben. Die numerische Apertur von Mikroskopobjektiven steigt mit der Maßstabszahl M bis etwa 40 x, z. B. 10 x / 0,30 und 40 x / 0,75 oder 40 x / 1,30 Oil. Bild 3: Zur Definition der numerischen Apertur NA Objekt Die theoretische Grenze in Luft liegt bei einer numerischen Apertur von 1,0. Dies entspricht einem Öffnungswinkel (2 ) des Objektivs von 180. In der Praxis kann eine NA von 0,95 realisiert werden, was immerhin einen Winkel (2 ) von über 140 entspricht. Beim Einsatz einer Ölimmersion ist eine NA von 1,51 möglich, in der Praxis beschränkt man sich auf Werte bis 1,42. Die NA des Objektivs bestimmt zusammen mit der Wellenlänge des Lichts ( = 550 nm für grünes Licht) das Auflösungsvermögen des Mikroskops und die förderliche Vergrößerung. Die Gesamtvergrößerung eines Mikroskops soll höher als das 500-fache aber kleiner als das 1000-fache der jeweiligen Objektivapertur sein.

9 2.1 Betrachtung des Auflösungsvermögen eines Mikroskops: Es soll die Beugung einer ebenen Welle untersucht werden, die senkrecht auf eine kreisförmige Öffnung (der Linsenfassung des Objektivs) mit dem Durchmesser D fallen soll. Nach dem Prinzip von Huygens (1629 bis 1695) muss man die Elementarwellen von allen Punkten innerhalb der Öffnung zur Gesamtamplitude aufaddieren. Der Beitrag jeder Elementarwelle beträgt cos (2. r( ) / ). df, wobei nach der Fraunhoferschen Näherung (paralleler Strahlengang) r der Abstand nach Bild 4 und df ein Flächenelement der kreisförmigen Öffnung ist. Parallel-Strahlen r D df gebeugte Wellenfront Blende mit kreisförmiger Öffnung Bild 4: Beugung an einer kreisförmigen Öffnung des Durchmessers D. ^ Jedes Flächenelement df trägt zur Gesamtamplitude y in Richtung bei.

10 ^ Die Amplitude y für einen bestimmten Winkel ist gleich dem Integral: ^ 2. r( ) () = co( )sy. df Gesamte Öffnung Das Integral führt zu einer Lösung, die die Besselfunktion 1. Ordnung [bezeichnet mit J1(x)] enthält. Durch Quadrieren erhält man für die Intensität als Funktion des Winkels : 2. J1(x) ² 2.. D/2 I( ) = I ( ) mit x. 0 = sin x Die Besselfunktion J1(x) hat Nullstellen (also Schnittpunkte mit der x-achse) bei x1 = 3,84, bei x2 = 6,80 und weitere, die wir aber nicht mehr benötigen. Für die erste Nullstelle gilt:. /Ḍsin 22 min1 = x1 = 3,84 und umgeformt erhält man (siehe auch Bild 5): 3, 84.. in in 1m =. 1=2,s 2 D/ 2 D

11 Anhand der auftretenden Minima bei der Beugung an einer kreisförmigen Öffnung sieht man, dass hier kein Lichtpunkt erscheinen wird, wie es die geometrische Optik fordern würde. Statt dessen erhält man eine helle Kreisfläche (das sogenannte Beugungsscheibchen), dann folgt der erste dunkle Ring und im Anschluss ein Nebenmaxima usw. 1,0 I( ) 0,8 rel. Einheiten 0,6 0,4 0, ,22 D 2,16 D sin ( ) Bild 5: Intensitätsverlauf bei der Beugung an einer kreisförmigen Öffnung

12 Der gesamte Intensitätsverlauf wird nach seinem Entdecker als Airy-Scheibchen bezeichnet und ist im Bild 5 dargestellt. Nach der Untersuchung der Beugungsverteilung an einer Linsenfassung betrachten wir nun das Mikroskop. Optische Mikroskope haben eine Objektivlinse mit kurzer Brennweite f, der zu vergrößernde Gegenstand befindet sich bei g (Gegenstandsweite), wobei gilt g ~ f. Die Zwischenbildebene liegt in viel größerer Entfernung b (Bildweite), siehe Bild 6. Lichtpunkte und B A Kreisförmige Lochblende (Linsenfassung) Objektivlinse Beugungsverteilung der Lichtpunkte A und B d0 A B D0 g b in der Zwischenbildebene Zwischenbildebene Bild 6: Beim Mikroskop erzeugt eine Linse kurzer Brennweite (das Objektiv) ein Beugungsbild in der Zwischenbildebene

13 ḋ0d01,22 Licht von der Punktquelle A gelangt nach der Abbildung durch das Objektiv auf die Zwischenbildebene und geht durch das erste Intensitätsminimum, wenn es die Kreisförmige Blende unter dem Winkel (bei kleinen Winkeln kann man den Sinus durch das Bogenmaß ersetzen) min1 ~ 1,22 / D verlässt. Der Radius des Beugunsscheibchens ergibt sich durch Multiplikation mit dem Abstand b zu: rbs = D0 ~ min1. b ~ 1,22. b D Um zu beurteilen, ob ein benachbarter Punkt B noch als räumlich getrennt von Punkt beobachtbar ist, hat man verschiedene Kriterien aufgestellt. Das bekannteste ist das Rayleigh-Kriterium, das in Bild 7 beschrieben wird. A Das erste Minimum vom Beugungsscheibchen A muss auf das Maximum des Beugungsscheibchens B treffen, damit ergibt sich in der Zwischenbildebene ein Abstand von D0. Das entspricht nach der Abbildungsgleichung einen Objektabstand von: = = b. gg D und mit g ~ f ergibt sich für den kleinsten noch auflösbaren Abstand zweier Objektpunkte:. d0 = 1,22 f D Der von der Objektivlinse (Linsenfassung) erfasste maximale Öffnungswinkel 2 berechnet sich mit (siehe Bild 3):

14 d0 1,0 0,8 rel. Intensität 0,6 0,4 0,2 0 0 Querschnitt der Intensitätsverteilung Bild 7: Das Rayleigh-Kriterium: Das Minimum des einen Beugunsscheibchens muss mit dem Maximum des anderen Scheibchens zusammenfallen. Damit ist ein Abfall im Zentrum des überlagerten Intensitätsverlaufs (blaue Kurve) von etwa 20 % verbunden, was das Auge gerade noch trennen kann. Der Abstand beider Scheibchen beträgt dann d0, dies multipliziert mit der Objektivvergrößerung ergibt D0.

15 . D 2 sin = f Bei Berücksichtigung eines Immersionsmediums mit dem Brechungsindex n zwischen Objekt und Objektiv lässt sich schreiben: n = 0 n Setzt man die letzten beiden Beziehungen ein, dann ergibt sich für den kleinsten noch auflösbaren Abstand zweier Objektpunkte: d0 = 1, n.. sin. Da n sin die numerische Apertur NA des Mikroskops (Objektivs) definiert, erhält man folgenden Ausdruck: 0 d0 = 1,22. 2 NA Abbe`sche Formel Der kleinste noch auflösbare Abstand d0 verhält sich also proportional zur Wellenlänge und umgekehrt proportional zur numerischen Apertur (siehe auch die Anmerkung im Abschnitt 2.2).

16 Bsp.: sin = 0,8 (d. h. der volle Öffnungswinkel 2 beträgt 106,3 ) n = 1,5 Daraus folgt NA = 1,2 und d0 ~ / 2 Strukturen, die kleiner sind als die halbe Wellenlänge des zur Beleuchtung dienenden Lichts können also nicht aufgelöst werden! Neben der hier untersuchten lateralen Auflösung ist auch das Vermögen des Mikroskops von Bedeutung, Objekte in ihrer Tiefe aufzulösen. Diese axiale Auflösung wird als Schärfentiefe bezeichnet. Der Schärfentiefe im Objektraum entspricht der Abbildungstiefe im Bildraum, innerhalb derer sich der Empfänger, also das Auge oder eine Kamera, befinden muss. Die Schärfentiefe wird bei größeren numerischen Aperturen und Vergrößerungen kleiner. zeigt, welche Werte sich für die laterale Auflösung verschie- Die nachstehende Tabelle 1 dener Objektive ergeben. Der Abstand d0 bezieht sich auf das Präparat, mit der Objektivvergrößerung M multipliziert ergibt sich der Punktabstand D0 im Zwischenbild, die Größe n ist die Anzahl der aufgelösten Bildpunkte, wenn man einen Zwischenbilddurchmesser (Sehfelddurchmesser) von 20 mm zugrunde legt, also: n= m2 d. m0 M 0

17 Maßstabszahl M / A d0 in µm D0in µm n N 5 x / 0,15 2,2 11, x / 0,30 1,1 11, x / 0,50 0,7 13, x / 0,75 0,45 17, x / 1,30 Oil 0,26 10, x / 1,40 Oil 0,24 15, x / 1,30 Oil 0,26 25,8 775 (Die Berechnungen erfolgten für = 550 nm) Tabelle 1: Laterales Auflösungskenngrößen verschiedener Objektive Aus der Tabelle 1 entnimmt man, dass durch das Einbringen von Immersionsöl zwischen der Frontlinse des Objektivs und dem Deckglas des Präparates die numerische Apertur und damit das Auflösungsvermögen steigt.

18 Das Öl hat mit n = 1,51 den selben Brechungsindex wie ein Deckglas. Auf diese Weise werden alle Reflexe auf dem Weg vom Objekt zum Objektiv beseitigt. Ohne Immersionsöl verläuft der vom Kondensor kommende Lichtstrahl durch den Objektträger und trifft dann auf eine Luftschicht, die sich zwischen Objektträger und Objektiv befindet. Da aber das Glas des Objektträgers einen größeren Brechungsindex als die Luft hat, findet an seiner Oberfläche ein Lichtstrahlübergang vom optisch dichteren Medium (Glas) in ein optisch dünneres Medium (Luft) statt. Hier darf die Apertur nur einen bestimmten Grenzwert erreichen. Wird dieser von den äußeren Anteilen des Lichtstrahls überschritten, findet eine Totalreflexion statt, was bedeutet, dass diese Anteile des Strahls nicht aus dem Objektträger austreten können. Lot g Objektiv g n1 n2 Objektträger (mit Deckglas) : Einfallswinkel (auf das Lot bezogen) : Grenzwinkel für Totalreflexion g Bild 8: Schematische Darstellung der Totalreflexion am oberen Rand des Objektträgers

19 Der maximale Einfallswinkel (vom Lot aus gemessen!) wird durch den Grenzwinkel g für die Totalreflexion bestimmt und hängt von den beiden Brechungsindizes (n1 = 1 für Luft und n2 = 1,51 für Glas) ab. Aus dem Brechungsgesetz der Optik kann man den Grenzwinkel bestimmen. Er lautet: n1 g = arc sin = 41,5 n2 Bsp.: Ein Objektiv mit der numerischen Apertur von 0,75 (siehe Tabelle 1) hat einen halben Öffnungswinkel von etwa 48, d.h. die gewünschte Anpassung von der NA zwischen Objektiv und Kondensor (siehe nächster Abschnitt) kann hier nur näherungsweise erfüllt werden. 2.2 Die Beleuchtungseinrichtung: Bevor wir zur richtigen Einstellung des Mikroskops kommen, müssen wir uns noch mit der Beleuchtung des Mikroskops beschäftigen. Bei der (in der Biologie) angewandten Durchlichtbeobachtung besteht die Beleuchtungsvorrichtung aus folgenden Bauteilen: Lichtquelle (mit Kollimator), Leuchtfeldblende, Aperturblende und Kondensor. Der Kondensor (Linsensystem) ist für die richtige Ausleuchtung des Präparates (Objekt) verantwortlich. Unterstützt wird er von der Apertur- und der Leuchtfeldblende.

20 Objekt Obe j ktträger Kondensor Kollimator Lichtquelle Stativfuß Aperturblende Bild 9: Beleuchtungskomponenten beim Mikroskop Leuchtfeldblende Die Aperturblende, die direkt unter dem Kondensor angeordnet ist, dient zur Einstellung des Öffnungswinkels des Lichtkegels. Der Öffnungswinkel des Lichtkegels soll so eingestellt werden, dass die numerische Apertur von Kondensor und Objektiv gleich groß sind. Nur so erreicht das Auflösungsvermögen seine volle Leistung. Ist die NA des Kondensors größer als die des Objektives, kann das Objektiv nur einen Teil des Lichts erfassen, ist sie kleiner, wird die NA des Objektives nicht voll ausgenutzt. Mit dieser Erkenntnis wird der minimale, noch auflösbare Abstand zweier Objektpunkte im Mikroskop (Abbe`sche Formel):

21 d = 0 1,22. NA Obj +. NA Kond. Die Leuchtfeldblende (Irisblende) befindet sich im Stativfuß. Sie wird mit Hilfe des Kondensors in das Präparat abgebildet. Die Leuchtfeldblende bestimmt, welcher Teil des Präparates beleuchtet wird (wie groß der "Lichtfleck" am Ort des Präparates wird). 3. Mikroskopieren im Durchlicht 3.1 Das richtige Einstellen des Weitfeldmikroskops: Hier geht es um die Einstellung des Mikroskops für die Durchlichtbeobachtung im Hellfeld nach den Regeln von Köhler (1866 bis 1948). Dazu benötigt man ein vollständig zusammengebautes Mikroskop mit einem Objektiv 10 x (notfalls 20 x), ein Präparat (angefärbte Schnitte, Stück vom Kleinbilddia) und ein weißes Blatt Papier. Das Objektiv soll sich ca. 10 mm oberhalb des Mikroskoptisches befinden. Das Vorgehen wird in 10 Schritten erläutert:

22 1) Schalten Sie die Lichtquelle ein und prüfen sie, ob Licht emittiert wird, indem Sie das Papierblatt über die Leuchtfeldblende im Stativfuß halten. 2) Öffnen Sie die Leuchtfeldblende bis zum Anschlag. Der "Lichtfleck" auf dem Papier hat nun den größtmöglichen Durchmesser. 3) Halten Sie das Papier zwischen Präparat und Objektiv. Öffnen Sie die Aperturblende des Kondensors vollständig. Der kleine "Lichtfleck" auf dem Papier wird dabei heller. 4) Stellen Sie mit dem Kondensortriebknopf die Höhe des Kondensors so ein, dass seine Frontlinse von unten etwa 1 mm bis 3 mm vom Präparat entfernt ist. Vermeiden Sie eine Berührung des Präparates. 5) In den Okularen sollten Sie jetzt Licht wahrnehmen. Ist die Lichtintensität zu stark, reduzieren Sie die Helligkeit, bis Sie diese als angenehm empfinden. 6) Blicken Sie in das Mikroskop und bewegen Sie mit dem Fokussiertrieb den Mikroskoptisch samt Präparat vorsichtig auf und ab, bis Sie Details scharf erkennen. Sie werden wahrscheinlich noch kein gutes Bild sehen, weil die Ausleuchtung noch nicht stimmt. 7) Verkleinern Sie die Leuchtfeldblende und bewegen Sie mit dem Kondensortrieb den Kondensor vorsichtig auf und ab, bis Sie ein scharfes Bild der Leuchtfeldblende oder wenigstens ein Stück davon am Rand sehen. Diese Suche dauert meistens etwas. 8) Das mikroskopische Bild nimmt langsam Gestalt an. Sie sehen nun das Bild der Leuchtfeldblende scharf abgebildet, aber es ist noch nicht zentriert. Mit Hilfe der Zentrierschrauben am Kondensor lässt sich auch dies einrichten. Ist das Bild zentriert, öffnen Sie die Leuchtfeldblende, bis ihr Rand das Sehfeld nach außen verlässt.

23 9) Nun muss die Aperturblende noch eingestellt werden, die ja noch voll geöffnet ist. Die Aperturblende kann man sehen, wenn man ein Okular aus dem Stutzen herauszieht und direkt in den Tubus blickt (besser geht dies mit einer Lupe). Das Auge ist dabei 10 cm bis 20 cm vom Stutzen entfernt. Nun öffnen und schließen Sie die Aperturblende am Kondensor, bis Sie ihr Bild in der Pupille (Sehloch) des Objektivs klar erkennen. Stellen Sie den Durchmesser der Aperturblende so ein, dass Sie etwa 2/3 bis 4/5 des Pupillendurchmessers ausleuchtet. Bei dieser Einstellung haben Sie fast die volle Auflösung und den besten Kontrast. 10) Setzen Sie jetzt das Okular wieder ein und das Mikroskop ist "geköhlert". Wenn Sie ein anderes Objektiv wählen, sollten Sie stets die Apertur- und Leuchtfeldblende anpassen. Für die Einstellung der Aperturblende muss aber nicht jedesmal das Okular herausgezogen werden. Es genügt, die Aperturblende "nach Gefühl" für andere Objektive anzupassen. Dazu öffnet man die Aperturblende erst ganz und schließt sie dann langsam, bis das Bild etwas dunkler und gleichzeitig kontrastreicher wird. 3.2 Kontrastierungsmethoden im Durchlicht: In der angewandten Mikroskopie hat man selten schön angefärbte Präparate, die sich leicht im Hellfeld betrachten lassen. Präparate wie Bakterien oder lebende Zellkulturen absorbieren kaum Licht und sind auch im gut justierten Mikroskop im Hellfeld nur schlecht oder gar nicht zu sehen. Die Folge der geringen Lichtabsorption sind sehr kleine Unterschiede in der Intensitätsverteilung (die Intensität ist proportional zum Quadrat der Amplitude) des Lichts im Bild.

24 Die nachfolgend dargestellten Kontrastierungsmethoden haben das Ziel, optische Effekte im Präparat in für das Auge gut wahrnehmbare Intensitätsveränderungen umzusetzen. a) Dunkelfeld im Durchlicht (DF): Feine Strukturen (z. B. Spinnennetze) können vor einem hellen Hintergrund nur schlecht gesehen werden. Das ändert sich, wenn man diese Strukturen von der Seite beleuchtet und sie vor einem möglichst dunklen Hintergrund betrachtet. Sie scheinen dann regelrecht aufzuleuchten. Im Mikroskop wird ein künstlich dunkler Hintergrund durch eine Umlenkoptik geschaffen. Mit Hilfe der Umlenkoptik wird zwar das Präparat beleuchtet, aber die Lichtstrahlen bilden einen Hohlkegel, sodass das Licht von der Mikroskopbeleuchtung nicht auf das Objektiv treffen kann. Alternativ zur Umlenkoptik kann man eine Ringblende vor dem Kondensor anbringen. Objektiv Objekt Bild 10: Beleuchtung und Abbildung bei der Umlenkoptik Dunkelfeldbetrachtung Lichtquelle

25 Ohne ein Präparat bliebe es in den Okularen dunkel. Nur das vom Präparat gebeugte (seitlich abgelenkte) Licht wird vom Objektiv eingefangen und zu einem Bild vereint. Das Präparat (Objekt) wird hell leuchtend vor dunklem Hintergrund sichtbar. Es gibt spezielle Objektive mit einer eingebauten verstellbaren Irisblende, die das direkte Licht auch dann ausblenden können, wenn es in den Aperturkegel des Objektivs fällt. So kann man auch für die Dunkelfeldbeobachtung sehr hohe Objektivaperturen nutzen. b) Phasenkontrast im Durchlicht: (Frederik Zernicke, 1953 Nobelpreis) Der Phasenkontrast ist für dünne ungefärbte Objekte (z. B. Kulturzellen) ideal. Das Auge kann diese Objekte im Hell- und Dunkelfeld fast nicht sehen. Es gibt aber kleine Unterschiede in den Brechungsindizes zwischen den Zellen und der umgebenden wässrigen Lösung. Diese Unterschiede macht der Phasenkontrast sichtbar, d. h. er wandelt sie in wahrnehmbare Intensitäts- bzw. Amplitudenunterschiede um. Im Gegensatz zu Amplitudenobjekten absorbieren sogenannte Phasenobjekte das Licht kaum, sie wechselwirken mit dem einfallenden Licht lediglich über ihren Brechungsindex, der zu einer Verringerung der Lichtgeschwindigkeit im Medium (n > 1) führt. Die Lichtwelle wird also nicht absorbiert, sondern erfährt relativ zum Hintergrund eine Verzögerung. Der Unterschied in der mikroskopischen Abbildung von Amplituden- und Phasenobjekten besteht darin, dass bei den Phasenobjekten eine Phasenverschiebung von /2 auftritt. Durch Kompensation dieser Phasenverschiebung im Lichtweg hinter dem Objekt sollte es also möglich sein, aus einem Phasenobjekt ein Bild zu erzeugen, das dem eines Amplitudenobjektes entspricht.

26 Hierzu wird die aus der Abbe`schen Abbildungstheorie bekannte Erkenntnis ausgenutzt, dass sich diejenigen Lichtanteile, die eine Wechselwirkung mit den Phasenobjekten erfahren haben, in den höheren Beugungsordnungen befinden, während die nullte Beugungsordnung das unbeeinflusste Hintergrundlicht enthält. Es muss also eine Anordnung gefunden werden, mit dem gebeugtes und ungebeugtes Licht eindeutig lokalisiert werden können, damit die zusätzliche Phasenverschiebung gezielt eingebracht werden kann. Für den Phasenkontrast werden spezielle Objektive benötigt, die mit einem Phasenring (dünner Metallring) in Pupillennähe (hintere Brennebene des Objektivs) versehen sind. Zusätzlich wird eine Ringblende unterhalb des Kondensors angebracht, die über die Kondensoroptik das Präparat so ringförmig ausleuchtet, dass der gesamte "Lichtring" in das Objektiv eintritt. Die Ringblende muss relativ zum Phasenring sehr genau zentriert werden. Der Phasenring (im Objektiv) hat zwei Aufgaben: Erstens dämpft er (wie ein Graufilter) das starke direkte Licht und zweitens fügt er diesem Licht eine konstante Phasenverschiebung von /2 zu. Die Lichtwellen sind vor dem Eintritt in ein Präparat noch in Phase, nach dem Passieren der verschiedenen optischen Medien aber nicht mehr. Der Betrag der Phasenverschiebung hinter dem Präparat hängt davon ab, welche Medien (Unterscheidungskriterium ist der Brechungsindex) die Wellen auf ihren Wegen zu durchqueren hatten und wie lang die Wegstrecken in diesen Medien waren (siehe Bild 11). Die Zellen (Objekte) beugen das Licht aus dem direkten Strahl in andere Richtungen. Daher läuft das Licht aus diesem primären Beugungsbild am Phasenring vorbei, wird

27 A: wässrige Lösung, B: Zytoplasma und C: Zellkern 1 und 2 markieren die Phasenverschiebungen der Lichtwelle in den verschiedenen Medien gegenüber der wässrigen Lösung Bild 11: Phasenkontrast: Unterschiede in den Brechungsindizes zwischen einer Zelle und der umgebenden wässrigen Lösung (Abbildung aus (1))

28 also nicht geschwächt und nicht verzögert. Im Zwischenbild werden alle Lichtstrahlen zur Interferenz (Überlagerung) gebracht. Da der direkte Strahl durch den Phasenring stark geschwächt wurde, kann das intensitätsschwache gebeugte Licht mit dem direkten Strahl interferieren. Ergebnisse dieser Interferenzvorgänge sind helle und dunkle Stellen im Zwischenbild, die oft erst die zu untersuchenden Zellen für unser Auge wahrnehmbar machen. Die Anwendung des Phasenkontrasts ist nur für sehr dünne Präparate zu empfehlen, bei denen nicht mehrere Strukturen räumlich übereinander liegen. Sonst kommt es zur Bildung von Halos (Lichthöfen), die sich überlagern und das Bild "verwischen". Wiederholung aus der Optik: Interferenz (Überlagerung) von Wellen: Lichtwellen können interferieren, wenn sie kohärent sind, d. h. die Wellen müssen die gleiche Frequenz und eine feste Phasenbeziehung zueinander besitzen. Außerdem darf der optische Wegunterschied der interferierenden Wellen nicht größer sein als die endliche Länge des Wellenzuges. Wirkung der Interferenz: beträgt beim Zusammentreffen von Wellenzügen der Gangunterschied ein geradzahliges Vielfaches von /2, so tritt Verstärkung auf, bei einem ungeradzahligen Vielfachen von /2 tritt Auslöschung bzw. Schwächung ein. Man erhält bei einer Interferenzerscheinung besonders große Helligkeitsunterschiede und somit kontrastreiche Bilder, wenn (neben der richtigen Phasenbeziehung) die miteinander interferierenden Lichtbündel gleiche Amplituden haben.

29 9 Bild 12: Die optischen Komponenten beim Phasenkontrast im Durchlicht (Abbildung aus (1)) 1: Ringblende 2: Kondensoroptik Objektträger mit Präparat 4: Objektiv 5: Phasenring 6: gedämpfte Direktbestrahlung 7: vom Präparat abgelenkte Strahlung 8: Tubuslinse 9: Zwischenbildebene

30 Hellfeld: Phasenkontrast: Bild 13: Die Zelle ist im Hellfeld nahezu unsichtbar, im Phasenkontrast ist sie gut zu sehen (Fotos aus (1))

31 Da der Brechungsindex des Phasenrings wellenabhängig ist, wird streng genommen lediglich die Phase von Licht einer ganz bestimmten Wellenlänge um exakt /2 (90 ) verschoben. Die Bedingung für Phasenkontrast ist exakt nur für monochromatisches Licht mit Wellenlängen zwischen 530 nm und 550 nm erfüllt (max. Empfindlichkeit des Auges). c) Polarisationskontrast im Durchlicht (POL): Bei dieser Methode kommen Lichtwellen zum Einsatz, die alle die gleiche Schwingungsrichtung haben, also linear polarisiert sind. Erzeugt wird dieses "ausgerichtete Licht" durch Polarisatoren, die aus der statistischen Verteilung der Schwingungsrichtungen im natürlichen Licht eine Vorzugsebene herausfiltern. Werden zwei Filter (Polarisator und Analysator) um 90 gegeneinander verdreht hintereinander angeordnet, so kann keine Strahlung diese Filterkombination durchdringen. Im Mikroskop wird der Polarisator vor dem Kondensor angebracht, sodass das Präparat mit linear polarisiertem Licht beleuchtet wird. Hinter dem Objektiv befindet sich der (um 90 gegenüber dem Polarisator verdrehte) Analysator. Liegt kein Präparat auf dem Mikroskoptisch, so bleibt das Bild völlig dunkel. Doch einige Präparate sind in der Lage, die Schwingungsrichtung des polarisierten Lichts aus der vom Polarisator erzeugten Ebene herauszudrehen, wenn sie durchleuchtet werden. Zu diesen Proben gehören z. B. Stärke, Mineralien, Polymere (Makromoleküle z. B. Polyethylen) usw.. Beobachtet man solche Stoffe im Polarisationsmikroskop, so werden Aufhellungen im

32 Bild gesehen, weil das "gedrehte" Licht vom Analysator teilweise durchgelassen wird. Oft dient noch eine "Lambdaplatte" als Kontrastverstärker des polarisierten Lichts. Diese Platten führen zur Auslöschung bestimmter Wellenlängen. So bleiben aus dem weißen Licht nur bestimmte Farben übrig, die zu bunten Bildern führen. Mechanische Spannungen im Glas beeinflussen die Bildentstehung im Polarisationsmikroskop. Aus diesem Grund müssen alle optischen Komponenten frei von inneren Spannungen sein. Die so konstruierten Objektive sind mit der Aufschrift Pol bezeichnet. 4. Mikroskopieren im Auflicht 4.1 Das Auflichtmikroskop: Wer das Gefüge von Metallproben, die Oberfläche von Keramiken oder bedruckte Papierdokumente untersucht, kann mit einem Durchlichtmikroskop nicht viel anfangen. Für diese Untersuchungen wurde das Auflichtmikroskop entwickelt. Auch alle neuen Fluoreszenzmikroskope (Kap. 5) nutzen dieses Beleuchtungsverfahren. Die Beleuchtung der Probe erfolgt direkt durch das Objektiv, d. h. das Objektiv erfüllt auch die Aufgabe des Kondensors. Das Auflichtmikroskop benötigt einen (neutralen) Strahlteiler, der das Licht bei allen Wellenlängen gleich gut reflektiert bzw. passieren lässt.

33 Objektiv Strahlteiler Zwischenbild Okular Objekt Tubuslinse Aperturblende Leuchtdeldblende Lichtquelle Es ist nur die Beleuchtung der Probe dargestellt, der weitere Lichtweg durch den Strahlteiler zur Tubuslinse und Okular ist nicht eingezeichnet. Bild 14: Schematischer Aufbau eines Auflichtilluminators

34 Das Beleuchtungslicht trifft auf die Probenoberfläche und wird reflektiert und gestreut. Das Objektiv sammelt diese Strahlen und die Tubuslinse projiziert das Zwischenbild. Für das Auflösungsvermögen beim Auflicht gilt die gleiche Abhängigkeit von Lichtwellenlänge und numerischer Apertur wie beim Durchlicht. Da die optischen Komponenten innerhalb des Auflichtilluminators in der Regel nicht mehr in Richtung der optischen Achse verstellt werden können, muss für eine korrekte Ausleuchtung lediglich das Lampenhaus (Lichtquelle und Kollimator) justiert werden. Das Licht durchläuft im Illuminator die Apertur- und die Leuchtfeldblende, das stellt wie bei der Durchlichtbeleuchtung die Einhaltung der Köhler`schen Beleuchtungsbedingung sicher. Die Leuchtfeldblende kann zu diesem Zweck zentriert werden. Bei Auflichtmikroskopen können im Prinzip auch Objektive für die Beobachtung im Durchlicht eingesetzt werden, doch es ist besser, auf die für diese Beobachtungsart konstruierten Objektive zurück zu greifen. Mikroskopobjektive für Auflicht weisen zwei besondere Eigenschaften auf: 1) Ihre Linsenoberflächen sind besonders gut entspiegelt, damit das von der Lichtquelle kommende Licht nicht in Richtung Okular reflektiert wird. Solche Reflexe würden sich dem Bild überlagern und störend wirken. 2) Diese Objektive sind für "unbedeckte Objekte" ausgelegt, man setzt also keine Deckgläser ein. Besonders bei höheren Aperturen ist für diese Objektive eine andere optische Rechnung nötig als für Durchlichtobjektive.

35 4.2 Kontrastierungsmethoden im Auflicht: a) Dunkelfeld (DF): Diese Methode eignet sich besonders zur Inspektion von Oberflächen. Sie gleicht in ihrer Funktion der Dunkelfeldbeobachtung im Durchlicht, nur die Beleuchtung ist anders. Das vom Auflichtilluminator kommende Licht wird über eine Spiegeltreppe (2) und mit Hilfe von Umlenkspiegeln (3) außen um das Objektiv herumgeleitet. (Numerierung bezieht sich auf Bild 15). Es trifft nach Passieren der Außenhülse des Objektivs auf einen ringförmigen Hohlspiegel (4), der die Lichtstrahlen auf die Probenoberfläche (5) lenkt. Wäre das Objekt ein perfekter Spiegel, so käme kein Licht in das Objektiv zurück, das Bild bliebe dunkel. Nur vorhandene Strukturen lenken Licht in Richtung Objektiv und werden hell auf schwarzem Hintergrund sichtbar. b) Polarisationskontrast (POL): Geeignet für Oberflächen mit Strukturen, die den Polarisationszustand des Lichts bei der Reflexion ändern, z. B. bei Gefügekörner in Erzproben. Der Polarisator befindet sich hier im Beleuchtungsweg vor dem Strahlteiler. Sonst entspricht die Funktionsweise diejenige beim Polarisationskontrast im Durchlicht.

36 : Auflichtilluminator 2: Spiegeltreppe 3: Umlenkspiegel 4: Objektiv 5: Probenoberfläche Bild 15: Dunkelfeld (DF) im Auflicht (Abbildung aus (1))

37 Das Bild zeigt die (vom Laser abgetastete) Unterseite einer CD. Die Codierung der Information erfolgt in Form kleiner Vertiefungen (Pits), die in unterschiedlichen Abständen entlang einer Spiralspur angeordnet sind. Der Abstand zwischen zwei Spiralspuren beträgt 1,6 µm. Bild 16: Aufnahme mit der Technik des Dunkelfelds im Auflicht (Foto: Physiklabor der FH Bingen)

38 c) Differentialinterferenzkontrast (DIC): Diese Methode, eine Erweiterung des Polarisationskontrastes, eignet sich für die Darstellung kleinster Höhenunterschiede von Oberflächen. Es wird ein doppelbrechendes Prisma (4) eingesetzt, das den polarisierten Lichtstrahl auf dem "Hinweg" in zwei Teilstrahlen aufspaltet, in einen sogenannten ordentlichen Strahl und in einen außerordentlichen Strahl, der seitlich abgelenkt wird. Beide Strahlen treffen also seitlich gegeneinander versetzt auf die Probe (Numerierung bezieht sich auf Bild 17). Befindet sich am Auftreffort der Probe (6) ein kleiner Höhenversatz h, so muss der eine der beiden Teilstrahlen einen um 2 h längeren Weg durchlaufen und es entsteht ein Gangunterschied zwischen den beiden Strahlen. Auf dem "Rückweg" hebt das Prisma (4) die Aufspaltung wieder auf, der Analysator (7) selektiert aus den nun phasenverschobenen Wellenzügen die Komponenten, die in seiner Schwingungsrichtung liegen. Nun erst - mit einer gemeinsamen Schwingungsebene versehen - können die beiden Teilstrahlen miteinander interferieren. Dann setzt sich der an der Oberfläche erfahrene Gangunterschied in Grauwerte um, die das Auge sehen kann. Die Höhenunterschiede auf der Probe werden als Reliefs sichtbar. Eine Lambdaplatte (7a) setzt schließlich wieder die Grauwerte in Farben um.

39 7 7a 3 4 P h 6 1: Auflichtilluminator 2: Polarisator 3: Strahlteiler 4: doppelbrechendes Prisma 5: Objektiv 6: Probe mit Höhenversatz 7: Analysator (7a: Lambdaplatte) Bild 17: Differentialinterferenzkontrast (DIC) (Abbildung aus (1))

40 Bild 18: Wie ein dreidimensionales Reliefbild erscheint das Gefüge einer Messingprobe im Differentialinterferenzkontrast (DIC) (Abbildung aus (1))

41 5. Fluoreszenzmikroskopie In der Fluoreszenzmikroskopie werden die Präparate mit speziellen Farbstoffreagenzien behandelt, den sogenannten Fluorophoren oder Fluorochromen, z. B. Rhodamin 6G. Dieses Farbstoffmolekül besteht aus mehr als 50 Atomen, hat ein Molekulargewicht von 479 und ist in der Lage, Licht für sehr kurze Zeitspannen - im Nanosekundenbereich - aufzunehmen und dann wieder abzustrahlen (Fluoreszenz: selektive Streuung). Das abgestrahlte Fluoreszenzlicht hat in der Regel eine größere Wellenlänge (d. h. es ist in Richtung "rot" verschoben) als das Anregungslicht. Wird z. B. blaues Licht absorbiert (also mit blauer Strahlung angeregt), so kommt es gleich darauf zur Emission von grünem Licht (Farbe des Fluoreszenzlichts). Diese Wellenlängenverschiebung Fluor. - Anreg. = wird als Stokes-Verschiebung bezeichnet. liegt im Bereich zwischen 20 nm und 100 nm und ist damit ausreichend groß, um das Anregungslicht vom Fluoreszenzlicht mit optischen Filtern wirkungsvoll trennen zu können. Die Verschiebung wird durch verschiedene Schwingungzustände der Moleküle verursacht (siehe auch Abschnitt 8.2). Die Fluorophore können nur Licht ganz bestimmter Wellenlängen absorbieren, sie zeigen also - für jede Reagenz spezifisch - ganz bestimmte Absorptionsspektren. Auch wird nicht jedes Photon absorbiert, sondern nur ein Teil des Anregungslichts, d. h. das Fluoreszenzlicht ist gegenüber dem Anregungslicht stark abgeschwächt. Dies macht deutlich, dass für die Fluoreszenzmikroskopie eine leistungsstarke Lichtquelle benötigt wird. Gute Fluoreszenzmarker haben eine hohe "Quantenausbeute", womit man das Verhältnis der abgestrahlten zu den absorbierten (anregenden) Photonen beschreibt.

42 Ein großer Vorteil dieses Linienstrahlers liegt im Wechsel von sehr intensiven Linien und schwacher kontinuierlicher Hintergrundstrahlung. Das ist sehr hilfreich bei der Fluores- Für die Mikroskopie ist der Effekt der Wellenlängenverschiebung um sehr willkommen. Man beleuchtet eine mit Fluorophore markierte Probe z. B. mit blauem Anregungslicht und beobachtet sie mit Hilfe eines Sperrfilters, das für blaues Licht undurchlässig ist, aber das grüne Fluoreszenzlicht durchlässt. Dann leuchtet das markierte Präparat - z. B. ein Zellskelett - grün vor dunklem Hintergrund. Einige Objekte, wie z. B. die Blattgrünkörper (Chlorophyll) zeigen eine Selbstfluoreszenz. Nicht fluoreszierende Gewebeteile kann man durch selektives Anfärben mit Fluorophoren zum Fluoreszieren bringen. Das Anfärben geschieht durch das Ankoppeln der Fluorophore an biologische Substanzen wie z. B. Antikörper. Dann bestimmt nicht der Farbstoff die Markierungsstellen, sondern das biologisch aktive Molekül. Mit Hilfe dieser Methode lassen sich Krankheiten diagnostizieren. Durchlichtfluoreszenz-Mikroskopie wird heute zugunsten von Auflichtfluoreszenz-Mikroskopie kaum mehr angewendet. Fluoreszenzausrüstungen enthalten eine starke Lichtquelle, die intensives, kurzwelliges Licht liefern muss. Eine bewährte Lichtquelle für die Fluoreszenz ist die Quecksilberhochdrucklampe (HBO). Seit kurzer Zeit werden aber auch LED`s (Licht emittierende Dioden) eingesetzt, z. B. blaue und grüne LED`s mit jeweils 3 W Leistung (LACERTA GmbH). Im Gegensatz zu einer normalen Glühlampe (Wärmestrahler mit einem kontinuierlichen Spektrum) ist die Quecksilberhochdrucklampe eine Gasentladungslampe (das Quecksilber wird durch die entstehende Wärme verdampft), die ein Linienspektrum emittiert.

43 Bild 19: Diese Aufnahme einer Mehrfachfluoreszenz mit verschiedenen Fluorophoren zeigt genau definierte Strukturen im Zytosklett von einzelnen Zellen (Abbildung aus (1))

44 404,7 nm 407,8 nm 433,9nm 434,8 nm 435,8 nm 491,6 nm 496,0 nm 502,6 nm 504,6 nm 512,1 nm 531,7 nm 535,4 nm 536,5 nm 546,1 nm 567,6 nm 577,0 nm 579,1 nm 580,4 nm 585,9 nm 587,9 nm 589,0 nm 607,3 nm 612,3 nm 623,4 nm 671,6 nm 690,7 nm Bild 20: Spektrum einer Quecksilberdampflampe im sichtbaren Spektralbereich Bei der Quecksilberhochdrucklampe (HBO) kommt es wegen des hohen Drucks im Inneren der Gasentladungslampe zu einer Verbreiterung der Spektrallinien. 708,2 nm 709,2 nm

45 zenz. Es wird mit einer "Linie" angeregt und - wegen der Stokesverschiebung - die Fluoreszenz bei einer Wellenlänge beobachtet, bei der die Lampe keine "Linien" aufweist, also dort nur wenig stört. In der Fluoreszenzmikroskopie kommen verschiedene Filter zum Einsatz. Das Anregungsfilter (5) filtert aus der Anregungslampe (HBO) nahezu monochromatisches Licht heraus. Der Strahlteiler (6), ein sogenannter dichroischer Strahlteiler, reflektiert das kurzwellige Anregungslicht fast verlustfrei über das Objektiv (7) in das Präparat (8). Das aus dem Präparat über das Objektiv zurückgestrahlte, langwelligere Fluoreszenzlicht lässt er hingegen fast vollständig passieren (Numerierung bezieht sich auf Bild 21 und 22). Oberhalb des Strahlteilers treffen das Fluoreszenzlicht und die Reste des Anregungslichts auf ein Sperrfilter (9). Dort werden die Reste des Anregungslichts ausgefiltert. Tubuslinse (10) und Okular (11) formen das jetzt nur noch aus Fluoreszenzlicht bestehende mikroskopische Bild. 9 Bild 21: Funktion der Filterkombinationen (Kennzeichnungen siehe Text) Lichtweg 6 Anregung 5 HBO Fluor. Präparat (8)

46 Bild 22: Strahlengang im Fluoreszenzmikroskop (Abbildung aus (1)) 1: Quecksilberhochdrucklampe 2: Wärmeschutzfilter 3: Dämpfungsfilter / Absperrschieber 4: Leuchtfeldblende 5: Anregungsfilter 6: Strahlteiler 7: Objektiv 8: Präparat 9: Sperrfilter 10: Tubuslinse 11: Okular

47 6. Mikroskopisches Messen Mit einem Mikroskop können messtechnisch folgende Größen erfasst werden: Längen, Höhen (bzw. Dicken), Flächen, Winkeln, Formen und die Anzahl der in einem bekannten Volumen enthaltenen Teilchen. Einige Messmethoden sollen kurz beschrieben werden. - Längenmessungen: Am unteren Ende des Okulars, in der Zwischenbildebene, lassen sich Okularstrichplatten anbringen, die dann zusammen mit dem mikroskopischen Bild sichtbar werden. Auf der Strichplatte ist eine Längenskala angebracht. Will man die Ausdehnung eines Objekts im Präparat bestimmen, so benutzt man die Okularstrichplatte als Vergleichsmaßstab. Die Teilstrichskala hat eine hohe Genauigkeit, der Teilstrichabstand beträgt üblicherweise 1/ 10 mm. Um die Größe eines Objekts zu bestimmen, muss man die scheinbare Größe D im Zwischenbild durch die Maßstabszahl M des Objektivs dividieren. Beispiel: Sie messen auf der Okularstrichplatte den Durchmesser einer Pflanzenstengelkapillare mit D = 7/ 10 mm und Sie verwenden ein Objektiv mit der Maßstabszahl 50. Dann hat die Kapillare einen Durchmesser von: 0,7 mm : 50 = 0,014 mm = 14 µm Die Vergrößerung des Okulars spielt hier keine Rolle, da ja sowohl das Objekt als auch die Strichplatte durch das Okular "nachvergrößert" werden.

48 - Winkelmessungen: In den Okularen von Winkelmessmikroskopen befindet sich eine drehbar gelagerte Strichkreuzplatte mit einer Winkelteilung (z. B. 0,5 ). Die Strichplatte kann mit einer zusätzlichen Längenteilung versehen werden. Da Mikroskopobjektive kleine Abweichungen von ihrer "Sollvergrößerung" zeigen, muss bei hohen Genauigkeitsansprüchen ein Korrekturfaktor mit Hilfe eines Objektmikrometers ermittelt werden. - Höhenmessungen bzw. Dickenmessungen: Die dritte Dimension eines mikroskopischen Objektes lässt sich gerade im Auflicht sehr leicht bestimmen. Dazu schließt man die Leuchtfeldblende bis auf einen kleinen Kreis und fokussiert auf die erste Ebene (z. B. der Mittelteil einer Münze). Eine mit dem Mikroskoptisch (Objekttisch) verbundene Messvorrichtung (Mikrometerschraube, evtl. mit Noniuseinteilung) wird jetzt abgelesen. Dann wird auf eine zweite Ebene fokussiert und wieder der zugehörige Messwert (Höhe des Mikroskoptisches) abgelesen. Die Differenz beider Werte ergibt den Höhenunterschied, der meist im Bereich weniger µm liegt. Sollen Dickenmessungen an einem Präparat im Durchlicht vorgenommen werden, muss der Brechungsindex des Einbettungsmediums und des Mediums zwischen Frontlinse und Deckglas berücksichtigt werden. Solche Messungen kann man nur mit Objektiven hoher Apertur und damit ohne große Schärfentiefe durchführen. - Flächenmessungen: sind möglich mit einem Okularnetzmikrometer, wobei man den Flächeninhalt aus der Anzahl der Quadrate bekannter Seitenlängen errechnen kann. Genauere Werte erhält man durch Planimetrie einer vergrößerten mikrofotografischen Aufnahme oder eines projizierten Bildes eines mikroskopischen Präparates.

49 Eine spezielle Konstruktion ist das Stereomikroskop, das neben den beiden Okularen auch mit zwei Objektiven ausgestattet ist (es gibt auch spezielle Ausführungen mit nur einem [großen] Objektiv). Mit Hilfe des Stereomikroskops kann man mikroskopische Objekte (z. B. feine Schweißnähte) entweder direkt räumlich sehen oder man kann mit ihnen fotografische Raumbildpaare herstellen. Unter dem räumlichen oder stereoskopischen Sehen ist die Erzeugung eines räumlichen Seheindrucks an Hand zweier Halbbilder gemeint, von denen das eine dem linken und das andere dem rechten Auge getrennt dargeboten wird. Es werden zwei getrennte, unter einem Winkel von 12 bis 14 gegeneinander geneigte Mikroskope verwendet. Dieser Winkelbereich entspricht etwa dem Konvergenzwinkel der Augenachse beim Betrachten eines nicht zu weit entfernten Gegenstandes. Da die Objektive sehr dicht nebeneinander liegen, sind keine hohen Aperturen möglich. Die erreichbaren Aperturen liegen bei etwa 0,12, sodass eine förderliche Vergrößerung den Wert 100 nicht wesentlich übersteigen sollte. Eine weitere Steigerung der Vergrößerung ist auch nicht sinnvoll, da die Schärfentiefe mit der Vergrößerung und dem Quadrat der Apertur abnimmt und somit keine reale Beurteilung der Tiefenverhältnisse des Objektes mehr möglich ist. Die fotografisch erstellten Raumbildpaare können mit fotogrammetrischen Auswertegeräten vermessen werden.

50 7. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie 7.1 Der Weg in die dritte Dimension: Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie hat die Lichtmikroskopie durch die dreidimensionale Erfassung von Objektinformationen wesentlich erweitert. Der Vorteil der Konfokalmikroskopie im Vergleich zu der konventionellen Lichtmikroskopie ist die direkte quantitative Auflösung entlang der Hochachse (z-achse). Dadurch wird es möglich, Mikrostrukturen in allen drei Richtungen des Raumes abzubilden und zu vermessen. Das grundsätzliche Prinzip der konfokalen Mikroskopie beruht darauf, dass nur das im Fokus der Linse reflektierte Licht zur Abbildung genutzt wird. Alle diffusen, d. h. unter einem Winkel zum einfallenden Strahl reflektierten Lichtanteile werden durch eine sehr feine Lochblende (Pinhole) herausgefiltert. Es werden nur die Strukturen eines Objekts abgebildet, die sich in der Fokusebene des Mikroskopobjektivs befinden. Man erhält somit ein scharfes, zweidimensionales Bild von all den Punkten des Objekts, die sich in der Fokusebene befinden (ähnlich den Höhenlinien in einer geographischen Karte). Dadurch erhält man die Möglichkeit, optische Schnitte durch ein Präparat zu legen. Durch die Aufnahme vieler einzelner Schnitte auf unterschiedlichen Positionen entlang der z-achse des Präparates kann man mit Hilfe der Bildverarbeitung dreidimensionale Bilder berechnen, die dann die Ausgangsbasis für die quantitative Auswertung sind.

51 Mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie ist es gelungen, die Dreidimensionalität eines Objektes auf die Abbildung zu übertragen. 7.2 Das konfokale Prinzip: Das konfokale Prinzip basiert auf einen Laserstrahl (Argonionen-Laser), der quasi punktförmig verkleinert in der Fokalebene des Objektivs auf das Präparat trifft. Der punktförmige Laserstrahl wird mit Hilfe eines beweglichen Spiegels über das Objekt geführt (Beleuchtungsscan-Verfahren) oder das ganze Objekt wird bei einem festen Laserstrahl schrittweise verschoben (Objektscan-Verfahren). Das von der Probe reflektierte oder emittierte Licht (bei Fluoreszenzanwendungen) wird bei seinem rückwärtigen Weg durch das Mikroskopobjektiv auf das Pinhole fokussiert, welches sich vor einem Detektor (Fotodiode) befindet. Die Öffnung der Lochblende ist so bemessen, dass nur Informationen aus der Fokalebene zum Detektor gelangen. Damit ist eine verbesserte Tiefenauflösung und eine Reduktion des Streulichts gegenüber dem konventionellen Mikroskop gegeben. Der die Lochblende passierende Strahlanteil wird vom Detektor registriert, gespeichert und mittels Datenverarbeitung zur Bildherstellung (das Bild wird aus den einzelnen "Helligkeitspunkten" der abgescannten Fläche aufgebaut) verwendet. So lassen sich sogar Filme durch Aneinanderreihung von Einzelbildern zur dreidimensionalen Objektdarstellung herstellen, besonders anschaulich für den biologisch-medizinischen Bereich. Natürlich hat auch dieses Mikroskop seine Einsatzgrenzen. Das Auflösungsvermögen hängt ab von der Wellenlänge der Laserstrahlung (der Fokusdurchmesser des Laser-

52 Laser Strahlteiler Linse Lochblende (Pinhole) Detektor Objektiv Objekt Lochblende Das Objekt befindet sich: in Fokalebene nicht in Fokalebene Bild 23: Das Laser-Scanning-Mikroskop rastert die einzelnen "Höhenschichten" des Objekts ab

53 strahls unterliegt der Abbe-Grenze), von der Apertur des Objektives und dem Durchmesser der Lochblende. Die Form der Bildpunkte wird in der konfokalen Mikroskopie durch beide Airy-Scheibchen bestimmt. Dadurch werden die Nebenmaxima unterdrückt, sodass eine Trennung der Bildpunkte noch bis d0 ~ 0,90. / 2 NA möglich ist. Vergrößerungen bis etwa dem Faktor sind noch bei ausreichender Schärfe erzielbar, da zusätzlich ein elektronischer Zoom eingesetzt werden kann. Wie bei einem normalen Lichtmikroskop kann beim konfokalen Mikroskop in natürlicher Umgebung gearbeitet werden, man benötigt kein Vakuum wie beim Elektronenmikroskop. Ebenso vorteilhaft und nutzerfreundlich ist der Wegfall vorbereitender Präparationsverfahren des Untersuchungsobjektes, die oft lästig und zeitraubend sind. Die zu untersuchenden Proben bleiben praktisch im ursprünglichen Zustand erhalten, sodass wiederholende Untersuchungen möglich sind. Dies ist ein großer Vorteil, besonders beim biologischen Probenmaterial. Bisher musste man Proben, um Beobachtungen mit dem herkömmlichen Lichtmikroskop durchführen zu können, mit einem Mikrotom in sehr dünne Schichten zerschneiden. Dieser mechanische Schnitt ist in der Regel mit einer Beeinflussung bzw. Störung des ursprünglichen Probenzustandes verbunden. Aufgrund dieser Vorzüge wird die konfokale Mikroskopie bevorzugt in der Biologie, Biomedizin und Medizin eingesetzt. Als Beispiele sind die dreidimensionale Abbildung und Untersuchung der Funktionalität von Zellen, Geweben sowie ganzer Organe und der zeitliche Ablauf biochemischer Vorgänge genannt. Die konfokale Mikroskopie ermöglicht hochwertige Aufnahmen von fluoreszenzmarkierten Proben, weil sich durch die Beleuchtung von sehr kleinen Probensektionen die Fluorophore sehr exakt anregen lassen.