Vorlesung Immunologie 7. Teil

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1 Vorlesung Immunologie 7. Teil Immunologische Methoden 25. Mai 2011, Ruhr-Universität Bochum Marcus Peters,

2 In vitro - Nachweis einer Immunreaktion Humorale Immunität: Analyse des Antiserums = serologische Tests: Nachweis von Antikörper, deren Charakterisierung und Menge (Titer) im flüssigen Überstand geronnenen Blutes eines durch Impfung immunisierten Individuums Grundlage der Nachweissysteme: Ag-Ak-Reaktion Y Zellvermittelte Immunität: Analyse der T-Zellspezifität, Menge und Funktion: Im Blut oder lymphatischen Organen im Tierexperiment oder humanen in vitro Zellkulturen

3 Affinität: Antikörper Spezifität: Eigenschaft von Antikörpern mit ihrem Paratop nur ein bestimmtes Epitop zu erkennen Avidität: Isotyp: Idiotyp: Bindungsstärke zwischen Antikörper und Antigen in Bezug auf eine Bindungsstelle (hoch = wenig Antikörper für Antigenbeseitigung nötig) Gesamte Bindungsstärke zwischen Antikörper und Antigenmolekül IgG, IgM, IgE, IgA wichtig für die Wahl des Detektionsantikörpers Antikörper einer bestimmten Spezifität

4 Herstellung von Antikörper I: Adjuvantien

5 Herstellung von Antikörper II: Hybridome

6 Nachweis von Antikörpern mittels Agglutination Antikörper-Messung an Festphasen (ELISA, Blot) und Fluoreszenzmikroskopie Fluoreszenz-vermittelte Zellanalyse und Zellsortierung Zelluläre Immunität, in-vivo Tests

7 Nachweis von Antikörpern mittels Agglutination Antikörper-Messung an Festphasen (ELISA, Blot) und Fluoreszenzmikroskopie Fluoreszenz-vermittelte Zellanalyse und Zellsortierung Zelluläre Immunität, in-vivo Tests

8 Immunpräzipitation Medizinische Bedeutung: Ag:Ak-Komplexe = Immunkomplexe (IK) Lösliche IK können sich an der Basalmembran von kleinen Blutgefäßen oder an Nierenpodozyten unterhalb der Membran anlagern und dort zu Schädigungen der Glomeruli (z.b. bei Lupus erythematodes) oder Entzündung kleiner Gefäße führen. Niere: Ausschnitt aus einem Glomerulus mit normaler (blauer Pfeil) und stark verdickter Basalmembran (roter Pfeil). Dunkle Komplexe werden von der Blutseite her (rechts) abgelagert.

9 Prinzip: Heidelberger`sche Präzipitationsreaktion Verschiedene Mengen an Antigen werden mit konstanten Ak-Mengen inkubiert. Die Menge der präzipitierten Ag-Ak- Komplexe wird über Trübung (Turbidimeter), oder nach Abzentrifugieren ihr Gewicht oder der Proteingehalt bestimmt

10 Hämagglutination Prinzip: Bildung von unlöslichen Antigen-Antikörper- Komplexen Anwendung: AB0-Blutgruppenbestimmung und geeignete Spender-Empfänger Zuordnung bei Bluttransfusionen (Kreuzprobe) Agglutinationsreaktion durch Quervernetzung mit Antikörpern gegen Blutgruppenantigene auf der Oberfläche von roten Blutkörperchen

11 Hämagglutination

12 Welche der folgenden Spender-Empfänger- Kombinationen bei der Transfusion eines gewaschenen Erythrozyten-Konzentrats führt mit großer Wahrscheinlichkeit zu einem Transfusionszwischenfall? Spender Empfänger 1) 0 A 2) 0 AB 3) AB AB 4) A AB 5) A 0

13 Welche der folgenden Spender-Empfänger- Kombinationen bei der Transfusion eines gewaschenen Erythrozyten-Konzentrats führt mit größer Wahrscheinlichkeit zu einem Transfusionszwischenfall? Spender Empfänger 1) 0 A 2) 0 AB 3) AB AB 4) A AB 5) A 0

14 Nachweis von Antikörpern mittels Agglutination Antikörper-Messung an Festphasen: ELISA, Western Blot und Fluoreszenzmikroskopie Fluoreszenz-vermittelte Zellanalyse und Zellsortierung Zelluläre Immunität, in-vivo Tests

15 ELISA: Prinzip und Durchführung ELISA = Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay

16 Indirekter ELISA 1) Beschichtung mit Probe 2) Zugabe des Erstantikörpers 3) Zugabe des Enzym markierten Zweitantikörpers Substrat Farbiges Endprodukt 4) Enzymreaktion 5) Absorptionsmessung

17 Zum Beispiel: Nachweis von Allergen-spezifischem IgE Alkalische Phosphatase Substrat: BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) + NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) Antigen (spezifisches Allergen) + Serum-IgE + Nachweis-AK (IgG-Anti-IgE) + Substrat

18 Sandwich ELISA zum Nachweis der IgE-Konzentration Alkalische Phosphatase Substrat: BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) + NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) Capture-AK (IgG-Anti-IgE) + Serum-IgE + Nachweis-AK (IgG-Anti-IgE) + Substrat

19 Immunoassay Sonderformen RIA: Radioimmunassay (radioaktive Markierung der Nachweissysteme). Sehr sensitiv, z.b. zur Bestimmung von Hormonspiegeln im Blut Inhibition: Indirekter ELISA um Aussagen über die im ELISA Affinität der Antigen-Antikörper-Reaktion zu treffen

20 Zweck: Western Blot (Immunblot) Auftrennung von Proteinen z.b. aus einem Zelllysat, Untersuchung von Bindungsmustern Prinzip am Beispiel: Nachweis von Ak gegen verschiedene Bestandteile von HIV im humanen Serum

21 Nachweis einer Infektion mit HIV im Western Blot H.R. Gelderblom Robert-Koch-Institut, Berlin

22 Detektion von Antikörperreaktion mittels Lumineszenz Zytokin-Array Western-Blot

23 Was ist Fluoreszenz? l=488 nm Laser (Anregung) Fluorochrom l=530 nm Antikörper Photodetektor + angeschlossenes Emission Analysesystem (PC) Häufig verwendete Fluorochrome Anregung (nm) Abstrahlung (nm)

24 Detektion und Analyse der Fluoreszenz Fluoreszenzmikroskopische Analyse Lichtquelle: Laser, Quecksilberdampflampe

25 Immunfluoreszenz I Prinzip: Direkte Darstellung von Antigenen in Zellen und Geweben mittels spezifischer Antikörper, an die Fluoreszenzfarbstoffe (Fluorochrome) gekoppelt sind. Makrophagen (grün) in der Roten Pulpa der Milz

26 Nachweis von: Immunfluoreszenz II Aktivierungs-assoziierten Ag (HLA-DR, CD80, CD86) Differenzierungs-assoziierten Ag (CD45RA, CD45RO) Lymphozyten-Typisierung (CD4/CD8 Verhältnis bei HIV- Diagnostik) Intrazelluläre Parasiten, Viren und Bakterien Krankheits-assoziierten Antigenen (z.b. Tumormarker) Intrazellulärer Nachweis von Zytokinen, Enzymen

27 Klinische Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie Borrelia sp.

28 Nachweis von Antikörpern mittels Agglutination Antikörper-Messung an Festphasen (ELISA, Blot) und Fluoreszenzmikroskopie Fluoreszenz-vermittelte Zellanalyse und Zellsortierung Zelluläre Immunität, in-vivo Tests

29 Isolierung von mononukleären Zellen (Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation) verdünntes Blut Ficoll (Dichte = 1,078) Zentrifugation Thrombozyten Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) Erythrozyten Granulozyten Zellkultur in vitro

30 Zellanalysen: Durchflußzytometrie Zellgemisch mit fluoreszierenden Ak 1) Probe wird mit Überdruck in die Messküvette eingeführt Flüssigkeitsstrom mit Ak-markierten Zellen Photodetektoren grün 2) Beim Eintreten in die Messkammer werden die Zellen stark beschleunigt Aggregate lösen sich auf Perlenkette durch hydrodynamische Fokussierung Laser rot FSC SSC 3) Am Analysepunkt findet Anregung mit Laserstrahl statt Messung von Streulicht und Fluoreszenz

31 Zellanalysen: Durchflußzytometrie [Prinzip] Laser (488 nm) Vorwärtsstreuung (FSC) Zellgröße Seitwärtsstreuung (SSC) Granularität

32 Detektion des Streulichtes Erkenntnisse über: 1) Größe (kleine Zellen erzeugen ein kleines Vorwärtsstreulicht-Signal (FSC) 2) Granularität (intrazelluläre Bestandteile), Zellen ohne Granula erzeugen ein kleines Seitwärtsstreulicht-Signal (SSC)

33 Auswertung des Streulichtes Vorwärts- und Seitwärtstreulicht werden für jede Zelle gegeneinander aufgetragen (Dot-Plot) 1) Granulozyten 2) Monozyten 3) Lymphozyten 2-Parameter-Darstellung ( Dot Plot) Je nach Gerät können neben FSC und SSC noch zahlreiche Fluoreszenzen gemessen werden.

34 Detektion der Fluoreszenz Beispiel: Analyse von Lymphozyten- Populationen Problem: Im Streulicht unterscheiden sich B-Zellen und T-Zellen nicht Lösung: Ausnutzung der Fluoreszenz-Detektion. T-Zellen werden mit einem grün-fluoreszierenden Antikörper markiert (z.b. FITC anti-cd3; assoziiert mit TCR). B-Zellen werden mit einem rot-fluoreszierenden Antikörper markiert (z.b. PE-anti-CD19, Corezeptor, spezifisch für B-Zellen)

35 Auswertung der Fluoreszenz Für jede einzelne Zelle wird jeder Parameter FSC SSC 1. Fluoreszenz (grün = T-Zellen) 2. Fluoreszenz (rot = B-Zellen)... gemessen und gespeichert B-Lymphozyten T-Lymphozyten Auswahl bestimmter FSC und SSC Werte Selektion von Lymphozyten = gaten

36 Beispiel 1: Leukämie Fluoreszenz-Parameter CD19 = spezifisch für B-Lymphozyten CD3 = spezifisch für T-Zellen Erhöhter Anteil B-Lymphozyten, nur sehr wenige T-Lymphozyten Wahrscheinlich eine Form der Leukämie

37 Beispiel 2: HIV-Infektion CD4 = Co-Rezeptor für MHC II, auf T-Helfer-Zellen, Monozyten und Makrophagen CD8 = Co-Rezeptor für MHC I, spezifisch für zytotoxische T-Zellen Patient hat im Vergleich zur Kontrolle zu wenig CD4+ Th-Zellen

38 Beispiel 3: Intrazelluläre Zytokin-Färbung T-Helfer-Zellen wurden in IL-12 und anti-il-4 kultiviert (oben) T-Helfer-Zellen wurden in IL-4 und anti-ifn-g kultiviert (unten) hinzufügen von Brefeldin A fixieren in Formaldehyd permeabilisieren in Saponin hinzufügen von anti-ifng-fluorescein und anti-il-4-phycoerythrin

39 Präparative Anwendung Die Durchflußzytometrie wird nicht nur für analytische Zwecke genutzt, sondern auch zum Sortieren von Zellen Zellsortierung (FACS = Fluorescence Assisted Cell Sorting) Die Zellen werden unterschiedlich ionisiert und durch die Ablenkung zwischen 2 Kondensatorplatten sortiert Ablenkplatten Sortierte Zellen Matthias Stiehm, Bis zu Zellen/s können isoliert/sortiert werden

40 Magnetische Zellsortierung (MACS) Zweck: Prinzip: Isolierung magnetisch markierter Zellpopulationen aus einem Zellgemisch zur funktionellen oder phänotypischen Analyse Anlegen eines Magnetfeldes Entfernen des Magneten Zellgemisch mit Ak, an die paramagnetische Partikel gekoppelt sind Magnetisch markierte Zellen werden zurückgehalten gebundene Zellen werden freigesetzt

41 Nachweis von Antikörpern mittels Agglutination Antikörper-Messung an Festphasen (ELISA, Blot) und Fluoreszenzmikroskopie Fluoreszenz-vermittelte Zellanalyse und Zellsortierung Zelluläre Immunität, in vivo und in vitro Tests

42 Prinzip: Nachweis von Immunreaktionen in vivo (Tuberkulintests) Nachweis der zellvermittelten Immunität auf Tuberkuloseerreger durch Injektion eines Extrakts aus Mycobacterium tuberculosis Tine-Test (Mendel-) Mantoux-Test

43 Tuberkulin Antigengemisch von Tuberkuloproteinen, die aus Überständen von TB-Kulturen durch fraktionierte Fällung gewonnen werden.

44 Typ-IV Hypersensitivität (Spätreaktion) IFN-g, Chemokine, TNF-a Zytokine TNF-Rezeptor CD40 Antigenspezifische Th1-Zellen Lokale Entzündungsreaktion

45 QuantiFERON-TB Gold In-Tube Jeweils 1 ml heparinisiertes Vollblut in ein Röhrchen mit und eins ohne Tb7.7 (Tuberkulinextrakt) Std. Inkubation bei 37 C. Bestimmung des Interferon-g im Überstand. Erhöhung des IFN-g spricht für Infektion (Nachweis aktivierbarer T-Zellen) Sensitivität des IFN-g Test höher als TST (tuberculin skin test)

46 Elispot-Assay zum Nachweis von Zellen, die bestimmte Zytokine herstellen und freisetzen.

47 Untersuchung der Interaktion von Lymphozyten mittels Multiphotonen-Mikroskopie

48 PNAS 2003;100(5):2604-9

49 Wanderung der B-Lymphozyten im 3D-Raum des Lymphknotens (FDCs in rot)

50 Wanderung von B-Lymphozyten zwischen light/dark zone