Gebrauchsinformation BABESIA-ELISA DOG

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1 Gebrauchsinformation BABESIA-ELISA DOG Test zum Nachweis von Antikörpern gegen den Erreger der Babesiose beim Hund, Babesia canis In-vitro Diagnostikum für Hunde Bestandteile des Kits: 1 Mikrotiterplatte, 96 Kavitäten (mit Babesia-Antigen beschichtet) 50 ml Probenverdünnungspuffer 50 ml Waschpuffer (10-fach konzentriert) 12 ml Konjugatlösung 12 ml Substratlösung 12 ml Stopplösung 1,5 ml Positiv-Kontrollserum PK 1,5 ml Negativ-Kontrollserum NK AFOSA GmbH Ludwig-Erhard-Ring 3 D Dahlewitz b. Berlin Tel.: Fax: Zul.-Nr.: FLI-B 572 Amtlich zugelassen nach 17c TierSG Schnelle und einfache Testdurchführung Gebrauchsfertige Reagenzien Für Einzelserenuntersuchungen geeignet

2 PRODUKTBESCHREIBUNG Der BABESIA-ELISA DOG ist ein Enzymimmunoassay (ELISA) in Mikrotiterplattenformat zum Nachweis von IgG-Antikörpern gegen Babesia canis, dem Erreger der Babesiose, in Blutserum- oder Blutplasmaproben von Hunden. ALLGEMEINE INFORMATIONEN Das Vorkommen der Hunde-Babesiose (Erreger: Babesia canis) im gesamten Mittelmeerraum und weiter nördlicher bis Ungarn, Österreich, Südwestdeutschland und Südfrankreich ist an das Vorkommen der Vektorzeckenart (in Deutschland Dermacentor reticulatus) gebunden. Die beim Blutsaugen übertragenen Sporozoiten vermehren sich in Erythrozyten durch Zweiteilung zu Merozoiten, welche nach Platzen der Wirtszelle weitere Erythrozyten befallen. Der massenhafte Untergang roter Blutzellen führt nach einer Inkubationszeit von wenigen Tagen bis zwei, drei Wochen zu zahlreichen klinischen Symptomen wie Fieber, Apathie, regenerative Anämie, Hämoglobinurie, Ikterus, dunkelroter bis brauner Urin und Atemnot. Die Schwere der Erkrankung, insbesondere Todesfälle, sind neben der Virulenz des Erregers vor allem vom Immunstatus des Hundes abhängig. Eine Diagnose ist in den ersten 5-6 Tagen der Erkrankung mittels PCR möglich, im Blutausstrich schwierig. Erste Antikörper wurden mit vorliegendem ELISA ab Tag nach Infektion bzw. drei Tage nach Auftreten erster klinischer Symptome nachgewiesen. Die serologische Diagnostik eignet sich insbesondere zur Abklärung von Reisekrankheiten nach Aufenthalt von Hunden in Endemiegebieten sowie zum Aufdecken subklinisch-chronischer Infektionen. Die Sensitivität und Spezifität des Babesia canis-elisa lag in Bezug zum Goldstandard (671 mit 4 verschiedene IFATs untersuchte Seren) bei 91,6% bzw. 95,4%, in Bezug zu einem am einem Universitätsinstitut nach streng wissenschaftlichen Kriterien validierten IFAT als Goldstandard (287 Seren) aber bei 96,3% bzw. 100%. BESCHREIBUNG DES TESTPRINZIPS Das Testsystem dient zur Bestimmung von IgG-Antikörpern gegen Babesia canis in Blutserum- oder Blutplasmaproben von Hunden. Die Mikrotiterplatte wurde mit einer Babesia- Antigen-Präparation beschichtet. Antikörper gegen Babesia canis bilden während der Inkubation der Probe in der beschichteten Vertiefung einen Komplex mit dem Antigen. Nichtgebundenes Material wird durch Waschen entfernt. Das hinzugefügte Enzym- Konjugat bindet sich an die antigengebundenen IgG-Antikörper. Ungebundenes Enzym- Konjugat wird heraus gewaschen. Nach Hinzugabe der Substratlösung erfolgt eine Farbentwicklung durch antikörpergebundenes Enzym. Die Farbreaktion steht in Korrelation zur Menge von Anti-Babesia-Antikörpern in derprobe. Die diagnostische Bewertung erfolgt durch den Vergleich der Extinktionswerte von Proben und Kontrollen. Testplatte mit Babesia- Antigen Probe (Anti-Babesia- IgG- Antikörper) Enzym-Konjugat (enzymmarkierte Anti- Hund- IgG-Antikörper) Farbreaktion (enzymatischer Substratumsatz) - 2 -

3 INHALT DES TESTKITS Mikrotiterplatte (eine Platte): mit Babesia - Antigen (inaktiviert) beschichtet, 12 Streifen mit je 8 Vertiefungen = 96 Vertiefungen pro Platte, einzeln abbrechbar Probenverdünnungspuffer (eine Flasche, 50 ml): Puffer mit Proteinzusatz, konserviert mit Natriumazid Waschpufferkonzentrat (eine Flasche, 50 ml): Puffer, 10-fach konzentriert, konserviert mit ProClin 300 Positiv-Kontrollserum PK, (eine Flasche, 1,5 ml): von mit Babesia-Erregern infizierten Hunden gewonnener Serumpool, konserviert mit Natriumazid, gebrauchsfertig Negativ-Kontrollserum NK, (eine Flasche, 1,5 ml): von Babesia-Erregern frei aufgezogenen Hunden gewonnenes Serum, konserviert mit Natriumazid, gebrauchsfertig Konjugatlösung (eine Flasche, 12 ml): Anti-Hund-IgG-Antikörper, mit Meerrettichperoxidase konjugiert, konserviert mit Pro- Clin 300, gebrauchsfertig Substratlösung (eine Flasche, 12 ml): Tetramethylbenzidin (TMB)-Lösung, konserviert mit Kathon, gebrauchsfertig Stopplösung (eine Flasche, 12 ml): 1 N Schwefelsäure, gebrauchsfertig, Vorsicht ätzend ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE GERÄTE UND MATERIALIEN (nicht im Lieferumfang enthalten) Behälter für Waschpuffer, destilliertes Wasser, Präzisionspipetten, Einwegpipettenspitzen, Gefäße für Verdünnung der Proben, Gefäß für benötigte Teilmenge der Konjugatlösung, Photometer für Mikrotiterplatten Filter 450 nm ART DER ANWENDUNG 1. Verwendung der Mikrotiterplatten Die Mikrotiterplatte wird im Folienbeutel mit Wiederverschluss geliefert. In der Verpackung befindet sich außerdem ein Trockenbeutel mit Indikator. Die Mikrotiterplatte besteht aus 12 Streifen mit je 8 Reaktionsvertiefungen. Es sollten nur so viele Vertiefungen entnommen und auf Raumtemperatur (18 bis 25 C) gebracht werden, wie für die Untersuchung der entsprechenden Anzahl der Proben notwendig sind (2 Vertiefungen für Kontrollen + Probenanzahl). Es ist unbedingt darauf zu achten, dass der Folienbeutel nach jedem Öffnen wieder ordnungsgemäß verschlossen wird. Ein Farbumschlag des Trockenbeutel-Inhalts von blau nach rot deutet auf eine zu hohe relative Luftfeuchte im Folienbeutel hin. Dadurch kann die Qualität der mit Antigen beschichteten Mikrotiterplatte beeinträchtigt werden. Die Funktionalität des Verschlusses sollte überprüft und der Trockenbeutel erneuert werden

4 2. Vorbereitung der Testreagenzien Die benötigten Testreagenzien sind vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur (18 bis 25 C) zu bringen. Aus dem Behältnis mit der Konjugatlösung entnehmen Sie die benötigte Menge (100 µl pro Vertiefung + Reserve) und bringen diese auf Raumtemperatur. Nicht benötigte Konjugatlösung soll ständig bei 4 bis 7 C lagern und darf keinen Temperaturschwankungen ausgesetzt werden. Stellen Sie die benötigte Menge an Waschpuffer her, indem Sie die entsprechende Menge des 10-fach Konzentrats 1:10 mit destilliertem Wasser verdünnen (1 Teil Konzentrat + 9 Teile Wasser). Der so verdünnte Waschpuffer ist nun gebrauchsfertig. Die nicht benötigte Menge der gebrauchsfertigen Lösung kann bei 4 7 C bis zu einer Woche; bei 20 C bis zu drei Monate gelagert werden. 3. Probenvorbereitung Es kann frisches, kühl aufbewahrtes oder gefroren gelagertes und aufgetautes Blutserum oder Blutplasma verwendet werden. Aufgetautes Blutserum/ Blutplasma muss vor der Verwendung gründlich durchmischt werden. Stellen Sie eine 1:100-Verdünnung her (5 µl Probe in 495 µl Probenverdünnungspuffer). Mischen Sie die Verdünnung gründlich. 4. Durchführung des Tests Sämtliche Reagenzien sollen bei Anwendung auf Raumtemperatur (18 bis 25 C) gebracht sein. Geben Sie je 100 µl des Positiv-Kontrollserums PK und des Negativ-Kontrollserums NK in die dafür vorgesehenen Vertiefungen (jeweils Einzelbestimmungen). Geben Sie 100 µl der 1:100 vorverdünnten Proben in die dafür vorgesehenen Vertiefungen (Einzelbestimmungen). Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie anschließend 60 min bei Raumtemperatur (18 bis 25 C). Entleeren Sie danach die Vertiefungen und spülen Sie diese 4-mal mit jeweils 300 µl vorverdünntem Waschpuffer. Entfernen Sie die Restflüssigkeit nach jedem Waschschritt gründlich (ausschlagen). Geben Sie in jede Vertiefung 100 µl Konjugatlösung. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie anschließend 60 min bei Raumtemperatur (18 bis 25 C). Entleeren Sie danach die Vertiefungen und spülen Sie diese 4 Mal mit jeweils 300 µl vorverdünntem Waschpuffer. Entfernen Sie die Restflüssigkeit nach jedem Waschschritt gründlich (Ausschlagen). Geben Sie in jede Vertiefung 100 µl Substratlösung. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie anschließend 15 min bei Raumtemperatur (18 bis 25 C). Beginnen Sie mit der Zeitmessung nach Füllen der ersten Vertiefung. Geben Sie 100 µl Stopplösung in jede Vertiefung, und zwar in derselben Reihenfolge, in der Sie die Substratlösung zugegeben hatten

5 Schütteln Sie gründlich. Messen Sie die Extinktionswerte (OD) innerhalb von 10 min nach Zugabe der Stopplösung mit einem Photometer bei 450 nm. AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE 1. Richtwerte zur Überprüfung der korrekten Testdurchführung Berechnen Sie den Prozentsatz (P) der optischen Dichte des Negativ-Kontrollserums NK (ODNK) nach folgender Formel: P = OD NK x 100 OD PK (ODPK = optische Dichte des Positiv-Kontrollserums PK) Die Testdurchführung war korrekt, wenn folgende Richtwerte erreicht wurden: OD des Positiv-Kontrollserums PK: OD PK > 0,8 < 2,8 Prozentsatz des Negativ-Kontrollserums NK: P < Berechnung der Testergebnisse Ziehen Sie von der optischen Dichte des Positiv-Kontrollserums (OD PK ) und von der optischen Dichte der Proben (OD Probe ) die optische Dichte des Negativ-Kontrollserums (OD NK ) ab. ODPK, korr = ODPK ODNK OD Probe, korr = OD Probe OD NK Berechnen Sie den Prozentsatz der optischen Dichte der Proben (Testergebnis, TE) nach folgender Formel: TE = OD Probe, korr x 100 OD PK, korr 3. Bewertung der Testergebnisse TE <14: negativ TE fraglich TE >19: positiv INTERPRETATION DER TESTERGEBNISSE Die Interpretation der Testergebnisse sollte vom behandelnden Tierarzt im veterinärmedizinischen Kontext, vor allem unter Berücksichtigung von Anamnese, klinischer Symptomatik, Titerdynamik (serodiagnostische Verfolgsuntersuchungen) und differentialdiagnostischer Abgrenzung anderer Krankheitsursachen erfolgen

6 ART DER AUFBEWAHRUNG Lagern Sie sämtliche Testkit-Bestandteile bei 4 bis 7 C. Bringen Sie nur die benötigte Anzahl an Mikrotiterplatten-Vertiefungen sowie die Reagenzien vor der Benutzung auf Raumtemperatur (18 bis 25 C) Einzelheiten siehe vorn (Art der Anwendung, 2. Vorbereitung der Testreagenzien). Setzen Sie die Substratlösung nicht starkem Licht aus. Die Bestandteile des Testkits dürfen nicht verunreinigt und nicht mit Bestandteilen aus anderen Chargen vermischt werden. BESONDERE HINWEISE Benutzen Sie die Bestandteile des Testkits nicht nach Ablauf des Verfalldatums. Den Test sollten nur Personen mit Kenntnissen in der Labortätigkeit ausführen. Die für ELISA-Tests übliche Umsichtigkeit wie Verwendung sorgfältig gereinigter Gefäße, sorgfältiges Pipettieren und Waschen während der Testdurchführung sowie die Einhaltung der vorgeschriebenen Zeiten sind notwendig, um die Genauigkeit der Testergebnisse zu gewährleisten. VORSICHTSMAßNAHMEN UND WARNHINWEISE Einige Bestandteile des Testkits enthalten gefährliche Stoffe (Natriumazid, Kathon, Pro- Clin 300). Bei der Beseitigung der Abfälle sind die jeweils gültigen gesetzlichen Bestimmungen einzuhalten. Nur für den tierärztlichen Gebrauch gi-hund-d gi-bed-v2-deutsch-web.docx Ausgabe 04/

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