Immunologische Techniken. Gelpräzipitationsreaktionen 1. Immundiffusion 2. Immunelektrophorese

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1 Immunologische Techniken Gelpräzipitationsreaktionen 1. Immundiffusion 2. Immunelektrophorese

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4 Direkte und indirekte Hämagglutination Direkte Hämagglutination: wenig empfindlich Indirekte Hämagglutination: hochempfindlich Anti-Globulin Zone der Abstossung wegen negativer Oberflächenladung Anwendung: Blutgruppenserologie

5 Prinzip: Während die Bildung eines löslichen Immunkomplexes kaum sichtbar wird, wird ein Immunkomplex leicht sichtbar, wenn das Antigen in Form von Erythrozyten vorliegt (Hämagglutination). Diesen Vorteil nützt man aus, um mikrobielle Antigene an die Erythrozyten- Oberfläche zu koppeln. Dadurch kann das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern leicht sichtbar gemacht werden. In der Regel verwendet man Schaferythrozyten für diesen Nachweis. Zugabe von Serum Hämagglutination Beladen von Erythrozyten mit Antigen Beispiel einer Hämagglutinationsplatte: 1:2 1:4 1:8 1:16 1: :128 1:256 1:512 pos.ktr. neg.ktr. Testseren Koppeln von Antigen an Erythrozyten: Behandlung mit Tannin Behandlung mit CrCl 3 andere positiv schwach positiv Endtiter prozone effect : abgeschwächt Anwendung: Infektionsimmunologie

6 Coombs Test Hämagglutination

7 Demonstration: Komplementbindungsreaktion (KBR) Prinzip: Die Bildung eines Immunkomplexes hat Komplementbindung zur Folge, so dass für die Lyse eines nachfolgend zugegebenen Schaferythrozyten-IgG-Komplexes (Ambozeptor) kein Komplement mehr zur Verfügung steht. Keine Lyse heisst deshalb Antikörper vorhanden und umgekehrt. + Testserum Antigen-spezifische Antikörper vorhanden + Komplement + Ambozeptor + Komplement + Ambozeptor Keine Lyse Antigen Anwendung des KBR: Klassische Infektionsimmunologie Antigen-spezifische Antikörper nicht vorhanden Lyse

8 Direkte und indirekte Immunfluoreszenz FACS: Fluorescence activated cell sorter

9 Fluorescence-activated cell sorting (FACS) Prinzip: Die Trennung von negativ geladenen, sich in Tröpfchen befindenden Einzelzellen wird durch magnetische Platten gesteuert, deren Ladung jeweils abhängig ist von der Fluoreszenz- Intensität einer Zelle. Auflösung in Tröpfchen Fluoreszenz-Detektor Laser Anwendung: Ablenkung gemäss Aufladung (Fluoreszenz-abhängig) An- und Abreicherung von Zellen mit bestimmten Eigenschaften (z.b. Selektion der positiven Zellen nach stabiler Transfektion). + - Fluoreszenz-gesteuerte Aufladung

10 RIA: Radioimmunoassay RAST: Radioallergosorbent test

11 ImmunoCAP

12 RIST: Radioimmunosorbent test

13 ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay 1. normaler ELISA 1. Sandwich ELISA: Beschichten mit Catching Antikörper, fängt Antigen, weiter wie normaler ELISA, zur Quantifizierung von Cytokinen 2. competitiver ELISA: Beschichten mit Antikörper, Prinzip wie RIST, Vergleich mit markiertem Referenzantigen

14 Westernblotting-Immunoblotting

15 Coomassie-Gel MW kd Immunoblot MW kd

16 Affinitätschromatography Monoklonale Antikörper

17 Lymphozytenpräparation durch Ficollgradienten

18 Isolation von mononukleären Zellen mittels Ficoll-Trennlösung 1:2 verdünnen Plasma Mononukleäre Blut 30 Min. 750g Ficoll- Trennlösung Anwendung: Die am häufigsten verwendete Methode zur Isolation von Lymphozyten (und Monozyten) für weitere immunologische Untersuchungen.

19 Magnetobead -Separation Antikörper werden auf verschiedene Weise magnetisch gemacht. Binden diese magnetischen Antikörper an Oberflächenmarker von Zellen, kann man die Marker-positiven Zellen immobilisieren, während sich die negativen Zellen problemlos wegwaschen lassen. Grundprinzip N S N S Methode Dynabeads Methode MiniMacs Anwendung: Universelle Methode zur Reindarstellung von Oberflächenmarker-positiven und negativen Subpopulationen. N S N S Bei der Dynabead-Methode werden relativ grosse Eisenpartikel gebraucht, welche mit Antikörpern beladen sind. Bei der MiniMacs-Methode werden kolloidale Eisenpartikel, die von Plastic umhüllt sind, an die Antikörper gebunden. Die Trennung erfolgt über eine Säule mit Eisenkern, der mit einem Magneten vollständig magnetisiert werden kann. Entfernt man den Magneten, lassen sich die gebundenen Zellen schonend eluieren.

20 Lymphozyten-Panning Prinzip: Oberflächen-Marker-spezifische Antikörper werden an soliden Träger adsorbiert ( coating ). Darauf ausgeplattete Zellen, die den Marker exprimieren, werden an die Oberfläche gebunden, die anderen bleiben ungebunden im Überstand. Coating Anwendung: Panning Einfache, kostengünstige Methode zur An- und Abreicherung von Lymphozyen, die einen bestimmten Marker exprimieren. Leider meist nicht 100% wirksam. Prinzip: Antikörperbeladene Zellen werden mit frischem Komplement lysiert, so dass nur die Marker-negativen Zellen überleben. Negativ-Selektion durch Komplement-Lyse Antikörper Komplement X Anwendung: Universelle Methode zur Negativselektikon einer Marker-exprimierenden Zellpopulation

21 Lymphozytenproliferationstest Zytotoxizitäts Assay

22 Antikörper Screening von cdna Genbanken Construction of a pollen cdna library

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25 Phagedisplay, combinatorial cloning of Fabs

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27 Samples Spots (Proteins) in MT plate are digested and placed into new plate. Digested material placed onto instrument sample plate. MALDI TOF MS spectra Voyager Spec #1 MC[BP = , 22773] E % Intensity Mass (m/z) 0 Database searches 2d-gel processed to remove spots Spots placed into MT plate Protein ids