Immunoassays

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1 Immunoassays Fanden erstmal in den 50er Jahren Verwendung Zuerst nur radioaktive Markierungen für Immunoassays Ab den 70er Jahren auch nicht-radioaktive Assays Klassifizierung der Immunoassays wie folgt: RIA (RadioImmunoAssay) FIA (FloureszentImmunoAssay) IRMA (ImmunoRadioMetricAssay) ILMA (ImmunoLuminoMetricAssay) ELISA (EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay) Immuno-PCR 1

2 Definition Antigen vom Körper als fremd erkannter Stoff, der eine Reaktion des Immunsystems auslöst Antikörper die von B-Lymphozyten u. Plasmazellen als Reaktion auf ein Antigen gebildeten Immunglobuline 2

3 Antigen-Antikörper Interaktion Bindungen: Wasserstoffbdgen Ionisch Hydrophobe Interaktionen Van der Waals Kräfte Viele schwache Bindungen ergeben starke Bindung bei hoher Komplimentarität 3

4 Festphasenkopplung Feste Phase: Boden einer Microtiterplatte Flüssige Phase enthält Analyt 4

5 RIA (RadioImmunoAssay) Markiertes Antigen tritt in Kompetition mit unmarkiertem Antigen (zu analysierende Probe) um Bindungsstelle am Antikörper. Signal ist indirekt proportional der Konzentration vom unmarkierten Antigen. FIA (FloureszentImmunoAssay) Analog RIA, aber floureszenzmarkiert. EIA (EnzymeImmunoAssay) Analog RIA, aber enzymmarkiert. 5

6 IRMA (ImmunoRadioMetricAssay) Markierte Antikörper binden an Antigen, Signal ist damit direkt proportional der Konzentration von Antigen in der zu analysierenden Probe. ILMA (ImmunoLuminoMetricAssay) Analog IRMA, aber luminiszenzmarkiert. 6

7 ELISA (EmzymeLinkedImmunoSorbentAssay) Dient dem Nachweis von Antigenen Antikörpern Haptenen 7

8 ELISA: Prinzip Sandwich Festphasen-gekoppelter AK (erster AK) Nachzuweisendes Antigen bindet an diesen 1. AK Antigen wird mittels Enzym markiertem AK (2. AK) nachgewiesen Als Enzyme dienen HRP (HorseRadishPeroxidase) Alkalische Phosphatase Gebundene Enzymaktivität wird über Substratumsatz vermessen Substrat wird gemeinsam mit löslichem Chromogen angeboten (dieses ist anfänglich farblos und wird durch den Substrat-umsatz zu int. gefärbter, spektroskop. auswertbarer Form) Direkte Proportionalität zw. unbekannter Probe und Farbumsatz 8

9 Elisa-Sandwich-Testprinzip 9

10 Elisa-Sandwich-Testprinzip 10

11 Kompetitiver ELISA Hauptsächlich zum Nachweis von Haptenen wie Steroidhormonen (sind zu klein um zwei AK zu binden) Feste Phase wird/ist mit AK beschichtet Zugabe von Tracer und Hapten (unbekannte Probe) -Tracer = enzymmarkiertes Hapten, wird zu jeder Probe in gleicher Menge beigegeben. -Umso mehr nachzuweisendes Hapten in der Probe ist, umso weniger Tracer wird an die Festphase gebunden (Kompetition). Substratzugabe Tracer setzt Substrat zu Farbstoff um. Umso weniger Tracer umso weniger Farbumsatz, umso mehr Hapten ist in der Probe. Farbe und Probenmenge sind indirekt proportional!!!! Nachteil: Überschuß an Tracer wirkt sich negativ auf Empfindlichkeit aus!! 11

12 Kompetitiver ELISA 12

13 Immuno-PCR Verbindet Spezifität von Immunoassays mit Sensivität von PCR fach sensitiver als ELISA Detektionslimit: fg/ml Für low-copy-viruses Noch nicht im klinischen Einsatz 13

14 Beispiele Blut: HIV1 und HIV2 (Anwesenheit von Anti-HIV Antikörper) Hepatitis C (Anwesenheit von Antikörpern) Hepatitis B (Nachweis von Antikörper und viralem Antigen) Hormone: Schwangerschaftshormon LH (Bestimmung des Eisprungs) TSH, T3 und T4 (Thyroidfunktion) Anabol. Steroide, Sportler: Doping Test Infektionsdetektion Sexuell übertragbare Erreger (HIV, Syphilis, Chlamydien) Hepatitis B und C Toxoplasmose Allergene in Lebensmittel und Hausstaub Rheumatische Faktoren (Autoimmunantikörper) Toxine im Essen Drogen: Kokain, Opiate, Marihuana (9-Tetrahydrocannabinol) 14

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