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1 Sächsische Landesbibliothek - Staats- und Universitätsbibliothek Dresden (SLUB) Zweigbibliothek Medizin Diese Hochschulschrift finden Sie original in Printform zur Ausleihe in der Zweigbibliothek Medizin Nähere Angaben zu Standort, Öffnungszeiten usw. finden Sie auf der Homepage der SLUB. Auf den folgenden Seiten finden Sie Titelblatt und Inhaltsverzeichnis der Hochschulschrift.

2 Entwicklung eines Sandwich-ELISA zum Nachweis der potentiellen humanen Karzinommarker CEACAM20, EphA2 und MIC-1 Dissertationschrift zur Erlangung eines doctor rerum medicinalium (Dr. rer. medic.) der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus der Technischen Universität Dresden vorgelegt von Hubertus Schleer aus Freiburg Dresden 2008

3 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Tumormarker Definition klassischer und molekularer Marker Beispiele Limitierungen und Grenzen von Tumormarkern Stellenwert des CEA als Tumormarker Stellenwert des PSA als Tumormarker Strategien zur Erhöhung der Validität von Tumormarkerassays Neue Tumormarkerkandidaten Kombination von Tumormarkem zur Verbesserung der Validität Genetische Immunisierung Analyseverfahren für Protein-Tumormarker Ziel der Arbeit 23 2 Material und Methoden Material Allgemeine Geräte Allgemeine Verbrauchsmaterialien Chemikalien und Zellkulturmaterialien DNA als Matrize Oligonukleotide Antikörper Rekombinante Proteine Zubehör und Reagenzien für die genetische Immunisierung Reagenzien und Zubehör für die ELISA und CELISA Software und Internetadressen Methoden Molekularbiologische Methoden Polymerase-Kettenreaktion DNA-Reinigung DNA-Auftrennung durch Agarose-Gelelektrophorese Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Schneiden von DNA mit Restriktionsendonukleasen (Restriktionsverdau) Isolierung von DNA aus Agarosegelen Ligation DNA-Sequenzierung Proteinbiochemische Methoden Präparation von Zelllysaten Bestimmung der Proteinkonzentration Pufferwechsel Reinigung der Antikörper mittels Affinitätschromatographie Bestimmung der Unterklassen der Isorypen Biotinylierung und HRP-Markierung von Antikörpern Kultur prokaryotischer Zellen Nährmedien und Platten zur Selektion Transformation kompetenter Bakterien Herstellung von E. coli-dauerkulturen Analytische und präparative Plasmidisolierungen Bestimmung der Konzentration und Reinheit von DNA 35

4 2.2.4 Kultur eukaryotischer Zellen Kultivierung von Zellen Bestimmung der Zellzahl Einfrieren und Auftauen von Kulturzellen Transiente Transfektion von Kulturzellen Fusion von Lymphozyten mit Myelomzellen Subklonierung Herstellung von Zellkulturüberstand in größerem Maßstab (Produktion und Aufreinigung monoklonaler Antikörper) Genetische Immunisierung Ablauf der genetischen Immunisierung Herstellung der Munition" für die Gene Gun Immunisierung von Mäusen Test des Immunserums Präparation der Versuchtiere Immunologische Methoden Analyse transient transfizierter Kulturzellen mittels Durchflusszytometrie Analyse transient transfizierter Kulturzellen mittels zeilbasiertem ELISA(CELISA) Antibody-capture Enzyme-linked Immunosorbant Assay Aufbau eines Sandwich-ELISA Immunfluoreszenzfärbung von Zellen Immunhistologie 51 3 Ergebnisse Entwicklung der monoklonalen Antikörper gegen potentielle Turnormarker Analyse der cdna- und Aminosäuresequenzen Analyse der Ähnlichkeit zwischen humanen und murinen Proteinsequenzen Identifizierung von Sequenzmotiven Amplifikation der EphA2 und CEACAM20-cDNAs und Klonierung in Expressionsvektoren Expressionsvektoren Amplifikation und Klonierung Überprüfung der Expression der DNA-Konstrukte (Immunisierungs- und Nachweisvektoren) Genetische Immunisierung von Mäusen und Herstellung von polyklonalen Seren Herstellung monoklonaler Antikörper Herstellung von Hybridomzellen und Selektion positiver Klone Subklonierung ausgewählter Klone Qualitätskontrolle der aufgereinigten monoklonalen Antikörper Charakterisierung der hergestellten Antikörper Klassifizierung der Isotypen und Unterklassen Charakterisierung der Antikörper HT-12D8 (cc-ceacam20) und Koc- 5H5 (a-epha2) mittels Immunfluoreszenz Immunbistologische Charakterisierung des a-ceacam20 Antikörpers HD-6G4-A Lokalisierung der Binderegion im Falle von CEACAM Ausschluss der intrafamiliären Kreuzreaktivität ausgewählter oc- CEACAM20-und a-epha2-antikörper 75

5 3.5 Entwicklung von Sandwich-ELISA zum Nachweis von CEACAM20, EphA2 und MIC Identifizierung potentiell Sandwich-ELISA-fähiger Antikörperpaare Bestimmung der Effizienz der HRP-Markierung der Antikörper Bestimmung einer geeigneten Verdünnung des Detektor- Antikörpers zur Epitopbestitnmung Ergebnisse der Kompetitions-CELISA Herstellung von Zelllysaten zur Gewinnung der löslichen Antigene Sandwich-ELISA: Identifizierung geeigneter Antikörperpaare zur Detektion von löslichem CEACAM20 und EphA Bestimmung der Effizienz verschiedener Antikörperkombinationen Titrationskurven: analytische Spezifität, analytische Sensitivität und Nachweisgrenze ausgewählter Sandwich-ELISA-Systeme 92 4 Diskussion Einführung Antikörperherstellung mittels genetischer Immunisierung Die Immunisierungsstrategie Die Expression der Antigene als Voraussetzung für die Immunisierung Induktion der Immunantwort in Mäusen Herstellung monoklonaler Antikörper Charakterisierung der monoklonalen Antikörper Prädominates Vorkommen von Antikörpern der Unterklasse IgGl Nachweis der hohen Spezifität der Antikörper gegenüber nativem Protein Lokalisierung der Binderegion mit Hilfe eines neuartigen Kompatibilitätstests Ausschluss von Kreuzreaktivitäten als unerwünschte Eigenschaft monoklonaler Antikörper Etablierung der Sandwich-ELISA Identifizierung kompatibler Antikörperpaare Herstellung eines Proteinstandards Sandwich-ELISA Analytische Spezifität Analytische Sensitivität Nachweisgrenze Limitationen und Stärken der Arbeit Zusammenfassung Literaturverzeichnis 123 Anhang A-l A Abbildungsverzeichnis A-l B Tabellenverzeichnis A-2 C Oligonukleotide A-2 D Sequenzen A-3 Danksagung Eidesstattliche Erklärung Thesen I III IV

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