ENTEROTOXÄMIE ELISA-TESTKIT (BIO K 290) (CLOSTRIDIUM PERFRINGENS)

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1 Gebrauchsinformation In vitro-diagnostikum Version BIO K vom 18/04/13 ENTEROTOXÄMIE ELISA-TESTKIT (BIO K 290) (CLOSTRIDIUM PERFRINGENS) ELISA-Testkit zum Antigennachweis des Clostridium perfringens-bakteriums und dessen Toxine Alpha, Beta und Epsilon Direkter Test für Kulturüberstände und biologische Flüssigkeiten I - ANWENDUNGSGEBIET Sandwich-ELISA-Test Diagnosetest für alle Tierarten Der Urheber der zumeist akut oder sogar perakut verlaufenden Enterotoxämie ist das Clostridium perfringens- Bakterium (C. perfringens). Unter noch weitgehend unbekannten Umständen kann es zu massiver Vermehrung der Bakterien im Darmtrakt kommen. Die dabei entstehenden bakteriellen Toxine werden resorbiert, gelangen in den Blutkreislauf und sind für das Krankheitsbild verantwortlich. C. perfringens ist ein grampositives, strikt anaerobes, sporenbildendes Stäbchenbakterium und verursacht eine Vielzahl von Krankheiten bei Mensch und Tier. Der kosmopolitische Erreger besiedelt den Verdauungstrakt aller Tierarten und des Menschen und wird auch im Boden, im Wasser und in der Luft gefunden. Die Pathogenität von C. perfringens wird durch die Produktion verschiedener Exotoxine bestimmt. Vier dieser Toxine - Alpha, Beta, Epsilon und Jota - werden wesentliche letale Toxine genannt, weil sie bei Mäusen nach intraperitonealer oder intravenöser Verabreichung zum Tode führen. Basierend auf der Kombination der produzierten wesentlichen letalen Toxine können die Stämme von C. perfringens in 5 Toxinotypen (A, B, C, D, E) eingeteilt werden. Zu einer sicheren Enterotoxämie-Diagnose ist neben dem eigentlichen Bakteriennachweis eine quantitative Analyse und eine Typisierung der isolierten Stämme durch Nachweis der verschiedenen Toxine notwendig. Der Enterotoxämie Elisa-Testkit ermöglicht eine phänotypische Toxintypisierung durch den Nachweis der Toxine Alpha, Beta und Epsilon. Durch den Nachweis eines Epitops von C. perfringens erlaubt der Test zusätzlich eine semiquantitative Einschätzung des Bakterienwachstums. Der Test kann mit biologischen Proben (Darmflüssigkeit oder dem Kadaver entnommene perikardiale oder peritoneale Flüssigkeit) oder mit Kulturüberständen durchgeführt werden. II - TESTPRINZIP Die Reihen A, C, E und G der Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen sind mit spezifischen Antikörpern beschichtet, die die Toxine Alpha, Beta, Epsilon und ein Epitop des Erregers C. perfringens erkennen. Diese Antikörper dienen zur Bindung der in den Proben (Kulturüberstand, Darminhalt, Aszites,...) enthaltenen Toxine und Bakterien. Die Reihen B, D, F und H sind mit unspezifischen Antikörpern beschichtet. Diese negativen Kontrollreihen (unspezifische Bindung) erlauben die Anzahl falsch positiver Resultate stark einzuschränken. Die verdünnten biologischen Proben und die unverdünnten Kulturüberstände werden während einer Stunde auf der Platte inkubiert. Nach einem Waschvorgang werden die Konjugate - mono- oder polyklonale, an das Peroxidaseenzym gebundene spezifische anti-c. perfringens Alpha-, anti-c. perfringens Beta- oder anti-c. perfringens Epsilon-Toxin Antikörper oder ein monoklonaler, an das Peroxidaseenzym gebundener spezifischer anti-c. perfringens Antikörper - in die Vertiefungen verteilt. Nach einer zweiten einstündigen Inkubationszeit und einem zweiten Waschvorgang wird die TMB-Substrat-Lösung zugefügt. Das darin enthaltene Chromogen TMB (Tetramethylbenzidine) reagiert empfindlicher als andere mit der Peroxidase reagierende Farbstoffe und ist 1

2 nicht kanzerogen. Enthält die Probe ein oder mehrere Toxine, bleiben ein oder mehrere Konjugate in den entsprechenden Vertiefungen haften und das Enzym katalysiert die Verwandlung des farblosen Chromogens in ein blaues Endprodukt. Die Farbintensität ist proportional zum Toxingehalt der Probe. Enthält die Probe eine große Menge Bakterien, entsteht in der mit den spezifischen anti-c. perfringens Antikörpern beschichteten Vertiefung ein positives Signal. Die Enzymreaktion wird durch Säurezufuhr gestoppt und die optische Dichte in einem Spektralphotometer gemessen. Die gemessene optische Dichte der negativen, mit unspezifischen Antikörpern beschichteten Vertiefung wird von derjenigen abgezogen, die man auf der entsprechenden positiven, mit spezifischen Antikörpern beschichteten Vertiefung abgelesen hat. Ein positives Kontrollantigen ist im Kit enthalten, um die Validität der erhaltenen Resultate sicherzustellen. TOXINOTYPEN Toxinotyp Alpha Beta Epsilon Jota A B C D E III - BESTANDTEILE DER TESTPACKUNG - Testplatten : 2 Mikrotiterplatten zu je 96 Vertiefungen, 12 Streifen zu je 8 Reaktionsvertiefungen : Waagerechte Reihe A : beschichtet mit spezifischen anti-c. perfringens Alpha-Toxin Antikörpern (polyklonale Antikörper vom Meerschweinchen). Waagerechte Reihe B : negative Kontrolle des C. perfringens Alpha-Toxins (beschichtet mit Waagerechte Reihe C : beschichtet mit spezifischen anti-c. perfringens Beta-Toxin Antikörpern (monoklonale Antikörper). Waagerechte Reihe D : negative Kontrolle des C. perfringens Beta-Toxins (beschichtet mit Waagerechte Reihe E : beschichtet mit spezifischen anti-c. perfringens Epsilon-Toxin Antikörpern (monoklonale Antikörper). Waagerechte Reihe F : negative Kontrolle des C. perfringens Epsilon-Toxins (beschichtet mit Waagerechte Reihe G : beschichtet mit spezifischen anti-c. perfringens Antikörpern (monoklonale Antikörper). Waagerechte Reihe H : negative Kontrolle des C. perfringens-bakteriums (beschichtet mit Die Mikrotiterplatten zwischen +2 C und +8 C aufbewahren. - Waschkonzentrat : 1 x 100 ml (20 x konzentriert), zwischen +2 C und +8 C aufbewahren. - Verdünnungspuffer : 1 x 50 ml (5 x konzentriert), zwischen +2 C und +8 C aufbewahren. - Konjugatlösungen : 4 x 6 ml, gebrauchsfertig. Die spezifischen Antikörper sind an die Meerrettichperoxidase gebunden. Die jeweilige Spezifität ist auf den Fläschchen angegeben und durch eine Farbe gekennzeichnet. - 1 x anti-c. perfringens Alpha-Toxin, monoklonale Antikörper (rot) - 1 x anti-c. perfringens Beta-Toxin, polyklonale Antikörper vom Kaninchen (gelb) - 1 x anti-c. perfringens Epsilon-Toxin, polyklonale Antikörper vom Kaninchen (blau) - 1 x anti-c. perfringens, monoklonale Antikörper (grün) Die Konjugatlösungen zwischen +2 C und +8 C aufbewahren. - Positives Kontrollantigen : 1 x 4 ml, gebrauchsfertig, zwischen +2 C und +8 C aufbewahren. - TMB-Substrat-Lösung : 1 x 25 ml, gebrauchsfertig, zwischen +2 C und +8 C lichtgeschützt aufbewahren. - Stopplösung : 1 x 15 ml 1 M Phosphorsäure (ätzend), gebrauchsfertig. 2

3 BIO K 290/2 Mikrotiterplatten 2 Waschkonzentrat 1 X 100 ml (20 X) Verdünnungspuffer 1 X 50 ml (5 X) Konjugatlösungen 4 X 6 ml Positives Kontrollantigen 1 X 4 ml TMB-Substrat-Lösung 1 X 25 ml Stopplösung 1 X 15 ml IV - ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES UND NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL UND GERÄT Destilliertes Wasser, Messzylinder, Bechergläser, Plastikröhrchen, Röhrchenständer, Pipettenspitzen, Reagenzbehälter für Mehrkanalpipetten, Deckel für Mikrotiterplatten, Abklebefolie für Mikrotiterplatten, Einund Mehrkanalpipetten, Mikrotiterplatten-Spektralphotometer, Mikrotiterplatten-Washer und Mikrotiterplatten- Schüttler (fakultativ). V - HINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN - Dieser Test ist ausschließlich für den tiermedizinischen Gebrauch und die In-vitro-Diagnostik bestimmt. - Die Reagenzien müssen zwischen +2 C und +8 C aufbewahrt werden. - Das Waschkonzentrat und der konzentrierte Verdünnungspuffer können bei Zimmertemperatur gelagert werden. Die verdünnten, gebrauchsfertigen Lösungen können 6 Wochen verwendet werden, wenn sie zwischen +2 C und +8 C aufbewahrt werden. - Nichtverwendete Teststreifen müssen unverzüglich in die Aluminiumverpackung zurückgelegt werden. Dabei ist darauf zu achten, dass der Trockenmittelbeutel nicht feucht und die Verpackung wieder luftdicht verschlossen wird. Unter diesen Bedingungen können die Streifen bis zum angegebenen Verfallsdatum verwendet werden. - Keine Reagenzien aus verschiedenen Testpackungen benutzen. - Die Qualität des Wassers, das zur Herstellung der verschiedenen für den Test benötigten Lösungen dient, ist sehr wichtig. Es darf keine oxidativen Stoffe (z.b. Bleichlauge) oder Schwermetallsalze enthalten, denn sie könnten mit dem Chromogen TMB reagieren. - Lösungen, die durch Bakterien oder Pilze verunreinigt sind, müssen entfernt werden. - Die Stopplösung enthält 1M Phosphorsäure (ätzend). Vorsichtig manipulieren. - Alle Materialien, die mit den Proben in Kontakt kommen, sind als potenziell infektiös zu betrachten und unter Anwendung der landeseigenen Gesetzgebung zu entsorgen. - Das Testprotokoll muss genauestens befolgt werden, um die Validität der Resultate zu garantieren. Insbesondere sind die Inkubationszeiten und -temperaturen sowie das genaue Abmessen der Reagenz- und Verdünnungsvolumen zu beachten. VI - VORBEREITUNG DER REAGENZIEN - Waschlösung : Durch die Lagerung des Waschkonzentrats bei niedrigen Temperaturen können spontan Kristalle entstehen. Wird lediglich ein Teil des Konzentrats gebraucht, so ist es auf +21 C +/- 3 C zu erwärmen, bis die Kristalle sich völlig gelöst haben. Nach gründlichem Durchmischen wird das benötigte Volumen entnommen. Zur Herstellung der gebrauchsfertigen Waschlösung wird 1 Teil Waschkonzentrat (20 x konzentriert) mit 19 Teilen destilliertem oder demineralisiertem Wasser verdünnt. Die verdünnte Lösung zwischen +2 C und +8 C aufbewahren. - Verdünnungspuffer : Dient zur Verdünnung der biologischen Proben. Vor Entnahme von Teilmengen die Lösung gründlich durchmischen. Durch die Lagerung des konzentrierten Verdünnungspuffers bei +21 C +/- 3 C kann eine Sedimentbildung auf dem Flaschenboden verhindert werden. Zur Herstellung der gebrauchsfertigen Lösung wird 1 Teil Verdünnungspuffer (5 x konzentriert) mit 4 Teilen destilliertem oder demineralisiertem Wasser gemischt. Die verdünnte Lösung zwischen +2 C und +8 C aufbewahren. - Konjugatlösungen : Die Konjugatlösungen sind gebrauchsfertig. - Positives Kontrollantigen : Die Kontrollantigenlösung ist gebrauchsfertig. - TMB-Substrat-Lösung : Die TMB-Substrat-Lösung ist gebrauchsfertig. - Stopplösung : Die Stopplösung ist gebrauchsfertig. 3

4 VII - AUFBEREITUNG DER PROBEN - Biologische Proben : Die flüssigen, biologischen Proben im Verhältnis 1:2 im gebrauchsfertigen Verdünnungspuffer verdünnen (in einem Reagenzröhrchen ein Teil Probe mit einem Teil Verdünnungspuffer mischen). Bei Proben mit festerer Konsistenz kann die Zugabe von Glaskügelchen und kräftiges Schütteln die Homogenisierung erleichtern. - Kulturüberstände : Die Kulturüberstände werden unverdünnt aufgetragen. Die besten Resultate werden mit Kulturen, die in flüssiger TGY-Nährlösung unter anaeroben Bedingungen bei +37 C (Kultur im Reagenzröhrchen ohne Schütteln) bebrütet wurden, erreicht. Die optimale Bebrütungsdauer für die Produktion des Alpha-Toxins liegt bei 4 Stunden oder zumindest bis zur maximalen Gasproduktion. Für den Nachweis der Toxine Beta und Epsilon wird eine Bebrütung von mindestens 8 Stunden oder eine Übernachtkultur durchgeführt. Liegen keinerlei Informationen zum Clostridien-Stamm vor, ist eine Inkubation von 8 Stunden bei +37 C ohne Schütteln angeraten. Zusammensetzung der TGY-Nährlösung : - Tryptikase (trypsinisiertes Kaseinpepton) : 30 g - Hefeextrakt : 20 g - Glukose : 1 g - L-Zystein : 1 g Die Tryptikase und das Hefeextrakt in 950 ml destilliertem Wasser auflösen und im Autoklav sterilisieren. Glukose und L-Zystein in 50 ml destilliertem Wasser auflösen und steril filtern. Nach Abkühlen des Nährmediums (950 ml), das Glukose-L-Zystein-Gemisch (50 ml) zufügen. VIII - TESTDURCHFÜHRUNG 1- Alle Reagenzien vor Gebrauch auf +21 C +/- 3 C bringen. 2- Die benötigten Streifen aus der Umhüllung nehmen und in den Rahmen geben. 3- Die verdünnten biologischen Proben und die unverdünnten Kulturüberstände zu je 100 µl pro Vertiefung verteilen. Dabei folgende Anordnung beachten: z.b.: Probe 1 von Vertiefung A1 bis H1, Probe 2 von Vertiefung A2 bis H2, usw Die Kontrollantigenlösung zu je 100 µl pro Vertiefung ebenfalls auf eine komplette senkrechte Reihe auftragen, z.b. Vertiefungen A3 bis H3. 4- Eine Stunde bei +21 C +/- 3 C mit Deckel inkubieren. 5- Waschvorgang: die Platte mit einer schnellen Handbewegung über einem Behälter entleeren und auf sauberer, saugender Unterlage gut ausklopfen. Danach die Vertiefungen vorsichtig mittels einer Spritzflasche mit der Waschlösung füllen und sie wieder mit einer schnellen Handbewegung über dem Behälter entleeren. Diesen Waschvorgang noch zweimal wiederholen, wobei besonders darauf zu achten ist, dass sich keine Luftblasen in den Vertiefungen bilden und die Vertiefungen nicht austrocknen. Eine automatische Waschvorrichtung (Mikrotiterplatten-Washer) kann auch benutzt werden. In diesem Fall ist jedoch darauf zu achten, dass die Nadeln den Boden der Vertiefung nicht berühren, um eine Beschädigung der adsorbierten Reagenzien zu vermeiden. 6- Die Platte auf sauberer, saugender Unterlage ausklopfen. 7- Die Konjugatlösungen zu je 100 µl pro Vertiefung nach folgendem Schema verteilen : - anti-c. perfringens Alpha-Toxin-Konjugat (rot) : waagerechte Reihen A und B - anti-c. perfringens Beta-Toxin-Konjugat (gelb) : waagerechte Reihen C und D - anti-c. perfringens Epsilon-Toxin-Konjugat (blau) : waagerechte Reihen E und F - anti-c. perfringens-konjugat (grün) : waagerechte Reihen G und H. 8- Eine Stunde bei +21 C +/- 3 C mit Deckel inkubieren. 9- Platte waschen wie unter 5. und 6. beschrieben. 10- Die TMB-Substrat-Lösung zu je 100 µl pro Vertiefung verteilen. Die TMB-Substrat-Lösung muss vor dem Auftragen absolut farblos sein. Sollte eine Blaufärbung sichtbar sein, bedeutet dies eine Verunreinigung der Lösung oder des Pipettenmaterials. In diesem Fall die kontaminierte Lösung entsorgen und neues TMB- Substrat mit absolut sauberem Material entnehmen Minuten bei +21 C +/- 3 C ohne Deckel und lichtgeschützt inkubieren. Die Zeitangabe dient als Anhaltspunkt. Unter gewissen Umständen kann sie verkürzt oder verlängert werden µl Stopplösung pro Vertiefung zufügen und unmittelbar danach die optische Dichte (OD) mit einem Plattenspektralphotometer (ELISA Reader) bei einer Wellenlänge von 450 nm messen. Die Zügigkeit dieses Vorgangs ist wichtig, denn das Chromogen TMB kann unter gewissen Bedingungen in den Vertiefungen kristallisieren und so zu falschen Messwerten führen (z.b. bei einem sehr hohen OD-Wert). 4

5 IX - AUSWERTUNG DER RESULTATE Für jede Probe muss die Differenz der Extinktionen (Delta OD) zwischen den mit spezifischen Antikörpern und den entsprechenden, mit unspezifischen Antikörpern beschichteten Reaktionsvertiefungen berechnet werden. Dazu wird von jedem OD-Wert der Reihen A, C, E und G der entsprechende OD-Wert der Reihen B, D, F und H abgezogen. Eventuellen negativen OD-Werten muss Rechnung getragen werden. Zum Beispiel : Probe 1 : A1 B1, C1 D1, E1 F1, G1 H1. Das Gleiche gilt auch für das positive Kontrollantigen : C. perfringens Alpha-Toxin : A3 B3 C. perfringens Beta-Toxin : C3 D3 C. perfringens Epsilon-Toxin : E3 F3 C. perfringens : G3 H3. Der Test ist nur dann valide, wenn die Differenz der Extinktionen (Delta OD) für das positive Kontrollantigen nach 10 Minuten in der TMB-Substrat-Lösung über folgenden Werten liegt (Validation) : - > 1,078 für C. perfringens Alpha-Toxin - > 1,188 für C. perfringens Beta-Toxin - > 1,061 für C. perfringens Epsilon-Toxin - > 1,360 für C. perfringens. Jeder erhaltene Wert (Delta OD) einer Probe wird durch den Wert des entsprechenden positiven Kontrollantigens geteilt und das Ergebnis mit 100 multipliziert, um die Resultate als Prozentwert auszudrücken. Delta OD Probe %Wert = x 100 Delta OD pos. Kontrollantigen Zum Beispiel : A1 B1 %Wert Probe 1 = x 100 (Alpha-Toxin) A3 B3 C1 D x 100 (Beta-Toxin) C3 D3 E1 F1 G1 H x 100 (Epsilon-Toxin) x 100 (C. perfringens) E3 F3 G3 H3 Eine Probe wird als positiv gewertet, wenn der errechnete Prozentwert über folgenden Grenzwerten liegt (siehe auch Tabelle des beigefügten Chargenprüfprotokolls) : - C. perfringens Alpha-Toxin : positiv wenn > 6,96 % - C. perfringens Beta-Toxin : positiv wenn > 6,32 % - C. perfringens Epsilon-Toxin : positiv wenn > 7,07 % - C. perfringens : positiv wenn > 5,51 %. X - BESTELLINFORMATIONEN BIO-X ENTEROTOXÄMIE ELISA-TESTKIT: 2 X 12 Tests BIO K 290/2 5