Nachweis von Antikörpern gegen porzine Influenza A Viren Ergebnisse eines Ringtests Untersuchungen von Feldproben. V. Herwig, C. Laue, R.

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1 Nachweis von Antikörpern gegen porzine Influenza A Viren Ergebnisse eines Ringtests Untersuchungen von Feldproben V. Herwig, C. Laue, R. Dürrwald

2 Haemagglutinationshemmungstest Nachweis von Antikörpern mittels Haemagglutinationshemmungstest ( bzw. HAI) gegen: Parainfluenzavirus Typ 3 Newcastle Disease Virus Reoviren 13 Porzines Parvovirus Influenzaviren (Pferd, Schwein, Geflügel) Egg Drop Syndrom Virus Rabbit Haemorrhagic Disease Virus Viren Antikörper Antikörper Erythrozyten inhibierte aus Serum umhüllte Viren Haemagglutination nach Jeffrey C. Pommerville: Alcamo's Fundamentals of Microbiology

3 Durchführung des Erythrozyten Erythrozyten und Kontrolle Antigen Serumverdünnung Erythrozyten Antigenzugabe (Virus) Überschuss Überschuss von: Antikörpern von: Antigen Draufsicht Überschuss 1: 1: 1: 1: 1: von: Antikörpern Antigen (Virus) Inkubation der AntigenAntikörper Inkubation Serumverdünnung Erythrozyten der Antigen Mischung Antikörper Mischung Seitenansicht

4 Durchführung des () positiver Antikörpernachweis negativer Antikörpernachweis á á H1N á H3N Titer gegen H1N

5 Varianten der Durchführung Variante Teilnehmer Mikrotiterplatte (Typ) Dauer [Minuten] VForm UForm Antigen Antikörper Mischung Temperatur [ C] 4 RT 1 17 Antigenzugabe Vorgelegtes Serum [µl] Antigenmenge [µl] 5 18 Serumverdünnung 4 14 HA Titer 48 8

6 Varianten der Durchführung () Erythrozyten Spezies Variante Huhn Mensch Meerschwein Teilnehmer 15 1 Antigen Antikörper Erythrozyten Mischung Konzentration Dauer [Minuten],5 1 % 9 (bzw. 1 x ü.n.) Temperatur [ C] 4 RT 5 13

7 Beobachtungen zur Durchführung Plattentyp UForm: gute Ablesbarkeit bei den meisten Antigenen steigert den Wert bei hohen Titern VForm: gute Ablesbarkeit bei einigen Antigenen steigert den Wert bei niedrigen Titern Temperatur niedrige Temperatur senkt den Titer Erythrozytenspezies gute Resultate bei Huhn, Mensch, Gerbil nur frische Erythrozytenlösung (max. 1 Tage) nutzen

8 Material für den Test Verwendete Antigene für den Haemagglutinationshemmungstest () Subtyp H3N H1N Stammbezeichnung A/sw/Haselünne/IDT617/3 A/sw/Bakum/IDT1769/3 A/sw/Bakum/183/ Verwendete Antikörper (Kontrollen): Lyophilisierte, FPLCgereinigte polyklonale Antikörper vom Schwein (nach Vakzination mit den oben beschriebenen Antigenen)

9 Material für den Test () Verwendete Serumproben Probe Subtyp H3N H1N NK Mix:, H3N, H1N Mix:, H3N, H1N H7N7 Name A/sw/Belzig//1 A/sw/Potsdam/1/81 A/sw/Bakum/5/95 A/sw/Belzig/54/1 A/sw/Lohne/1/97 A/sw/Bakum/99/93 A/sw/Scottland/4144/94 A/sw/Gent/765/99 A/sw/Bakum/183/ Kontrollserum Maternale Antikörper Siehe Antigene A/turkey/Germany/R11/1

10 Ergebnisse gegen den Subtyp H3N J C D E O N M L K I H G F B A IDT H3N H1N Lab. Lyophilisat H7N7 H1N NK H3N >56 > >16384 >496 >496 >496 >14 >14 > >48 > > >

11 Ergebnisse des Der ermöglichte (bei allen Unterschieden) eine qualitative und quantitative Erfassung des Ergebnisses Anregung: Einsatz von Neuraminidase verhindert unspezifische Reaktionen im Aktuelle Antigene sollten für die Antikörperbestimmung verwendet werden Institut A B C Jahr der Isolierung Ca Ca. 198 Stamm Ringtest Institut Ringtest Institut Ringtest Institut Serum mit Antikörper gegen Subtyp H3N Belzig/54/1 (Probe 4) > Lohne/1/1997 (Probe 5) >

12 Zusatz: Sind ELISA geeignet? ELISA HerdChek Swine Influenza Antibody Test Kit (IDEXX) H3N H1N NK Mix H7N7 ist nicht spezifisch Lyophilisat Lab H1N H3N IDT 1 3 ELISA HerdChek Swine Influenza H3N Antibody Test Kit (IDEXX) ist nicht spezifisch H3N H1N NK Mix H7N7 Lyophilisat Lab H1N H3N IDT 1 ELISA Systeme detektieren subtypübergreifend (Detektion von Antikörpern gegen konservierte Virusproteine?)

13 Zusatz: Sind ELISA geeignet ()? Vergleich von 45 österreichischen Feldseren * Serum mit Antikörper gegen Subtyp H3N Methode IDEXX Biovet IDEXX Biovet H3N H3N Seroprävalenz 19, % 15,1 % 9,5 % 4, % 38,1 % 69, % Korrelationskoeffizient,755,535,79,567 Sensitivität,69,83,81,91 Spezifität,97,83,93,5 ELISA Systeme mit deutlichen Abweichungen zum (Biovet falschpositive; IDEXX falschnegativ) Mögliche Gründe: Verwendung alter Stämme und genetisch unterschiedlicher Stämme (USA), cutoff Festlegung (Sind die negativen Kontrollen negativ?) *Lang et al.; Wien. Tierärztl. Mschr. 94 (7), 9633

14 Abweichende Durchführungsarten bewirkten unterschiedliche Resultate ELISA Systeme sind nicht spezifisch ermöglichte (bei allen Differenzen) eine Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit qualitative und quantitative Erfassung von Antikörpern im Serum Empfehlungen: Nutzung aktueller Antigene Vorbehandlung mit Neuraminidase