Biochemisches Praktikum fu r Bachelor Biowissenschaften

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1 Biochemisches Praktikum fu r Bachelor Biowissenschaften Fassung vom Februar 2013 Universität Kaiserslautern Fachbereich Chemie Prof. Dr. W. E. Trommer

2 2 Inhalt Zeitplan zum Biochemie-Praktikum für Bachelor-Biowissenschaften zum WS 2012/ Sicherheitsinstruktionen:... 5 Anmerkungen zum Praktikum... 6 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Einleitung Versuchsbeschreibung Versuchsdurchführung Reagenzien und Chemikalien Versuchsablauf Bestückung der Mikrotiterplatte Auswertung Literatur Hemmkinetik mit Lactatdehydrogenase Einführung Proteine Enzyme Enzymkinetik nach Michaelis und Menten Kinetik der kompetitiven Hemmung Lactatdehydrogenase Photometrie Aufgabe Experimentelle Erwägungen Die Aufgabe unterteilt sich wie folgt: Durchführung Von den Assistenten werden folgende Stammlösungen bereitgestellt: Von den Studierenden werden folgende Stammlösungen hergestellt: Messung ohne Inhibitor Messung mit 0,3 ml AMP-Lösung Messung mit 0,6 ml AMP-Lösung Auswertung Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen ohne Inhibitor Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen mit 0,3 ml AMP- Lösung Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen mit 0,6 ml AMP- Lösung... 33

3 3 Die reziproke oder Lineweaver-Burk-Auftragung Berechnung der Inhibitorkonstante K I sowie Berechnung und Umrechnung des Durchschnittwerts von v max Abschließende Beurteilung... 43

4 4 Zeitplan zum Biochemie-Praktikum für Bachelor-Biowissenschaften zum WS 2012/13 Mo., Di., Mi., Do., Vorbesprechung 10:00 alle Gruppen ELISA Coaten 14:00 h: Gruppen 1A-1F ELISA 9:00 h: Gruppen 1A-1F LDH-Hemmkinetik 9:00 h: Gruppen 1A-1C 13:30 h: Gruppen 1D-1F ELISA Coaten 15:30 h: Gruppen 3A-3F ELISA 9:00 h: Gruppen 3A-3F LDH-Hemmkinetik 9:00 h: Gruppen 3A-3C 13:30 h: Gruppen 3D-3F ELISA Coaten 15:30 h: Gruppen 2A-2F ELISA 9:00 h: Gruppen 2A-2F LDH-Hemmkinetik 9:00 h: Gruppen 2A-2C 13:30 h: Gruppen 2D-2F

5 5 Sicherheitsinstruktionen: Allgemeine Sicherheit: Informieren Sie sich bei Praktikumsbeginn über die Sicherheitseinrichtungen im Praktikumslabor: Feuerlöäscher, Feuermelder, Notduschen, Augenduschen, Not-Ausschalter für Elektrizität, Erste-Hilfe-Kasten. Notfall/Unfall-Pläne und Brandfall-Regeln sind neben den Türen ausgehängt. Unfälle und Notfälle sofort bei Assistenten melden. Fluchtwegepläne sind auf dem Gang ausgehängt. Im Alarmfall das Gebäude auf dem kürzesten Weg verlassen, keine Aufzüge benützen, sich auf dem großen Parkplatz hinter dem Chemie-Gebäude versammeln. Tragen Sie im Labor immer Schutzkleidung: Labormantel (Baumwolle, kein Synthetic), Schutzbrille, geschlossene Schuhe. Beim Arbeiten mit Gefahrstoffen Einmalhandschuhe benützen (von uns gestellt). Straßenkleidung etc. nicht ins Labor mitnehmen, sondern in den Spinden einschließen. Im Labor nicht Essen und Trinken. Keine Lebensmittel in das Labor mitnehmen. Arbeiten Sie nicht alleine im Labor und machen Sie keine Experimente, die nicht vorgesehen sind.

6 6 Anmerkungen zum Praktikum Sollten Sicherheitsregeln im Labor nicht befolgt werden, können Praktikant(inn)en vom Praktikum oder dem Versuchstag ausgeschlossen werden. Protokolle zu den einzelnen Versuchen sind spätestens 1 Woche nach Beendigung des Versuchs beim Versuchsassistenten / der Versuchsassistentin abzugeben. Alle verwendeten Messwerte etc. sind im jeweiligen Protokoll anzugeben. Rechenwege sind nachvollziehbar darzulegen. Protokolle sind in Papierform abzugeben.

7 7 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 1. Einleitung 7 2. Versuchsbeschreibung Versuchsdurchführung Reagenzien und Chemikalien Versuchsablauf Bestückung der Mikrotiterplatte Auswertung Literatur Einleitung Die intakte Oberfläche des Körpers stellt eine wirksame Barriere gegenüber den meisten Mikroorganismen (Viren, Bakterien, Pilzen, Parasiten) dar. Um dennoch eingedrungene Mikroben unschädlich zu machen, verfügen Wirbeltiere über ein Abwehrsystem aus Molekülen und Zellen, das Immunsystem. Alle Zellen des Immunsystems stammen von pluripotenten Stammzellen ab, die sich im Laufe ihrer Entwicklung in zwei Zellinien, die myeloische und die lymphatische, differenzieren. Die myeloische Reihe besteht zum gößten Teil aus Phagozyten, welche in der Lage sind, Fremdorganismen zu endocytieren und zu verdauen. Die Zellen der lymphatischen Reihe (Lymphocyten) differenzieren, je nach Umgebung (microenvironment) in der sie heranreifen, in T- und B-Zellen. T-Zellen entwickeln sich dabei im Thymus, während B-Zellen bei Säugetieren im Knochenmark (bone marrow) entstehen. Neben der zellvermittelten Immunreaktion spielen auch lösliche Faktoren bei der Immunantwort eine große Rolle (humorale Immunantwort). Den Hauptträger dieser Abwehr bilden die Immunglobuline oder Antikörper. Diese werden - nach einem Kontakt des lymphatischen Systems mit fremden immunogenen Molekülen - von Plasmazellen, die sich aus B-Zellen entwickeln, gebildet. Moleküle, die im Organismus die Bildung dieser Antikörper induzieren, nennt man Antigene. Die Antikörper erkennen das infektiöse Agens spezifisch, das heißt, ein bestimmter Antikörper erkennt nur sein zugehöriges Antigen. Die Bindung erfolgt dabei nicht an das gesamte Antigen, sondern nur an eine bestimmte Stelle, die Antigendeterminante (Epitop).

8 8 Die Grundstruktur aller Antikörper besteht aus je zwei identischen leichten und schweren Polypeptidketten, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind (Abb. 1). V L C L V H Antigenbindungsstellen C H 1 Disulfidbrücke Türangel- (hinge) Region C H 2 C H 3 schwere Kette 450 Reste Kohlenhydrat leichte Kette 212 Reste Abb. 1: Grundstruktur eines Antikörpers (IgG) Von der kleineren Polypeptidkette (light chain) mit einem Molekulargewicht von Da existieren zwei Formen, die - und die -Form. Ihre Struktur gliedert sich in zwei globuläre Regionen (Domänen), die in sich durch je eine Disulfidbrücke stabilisiert sind. Diejenige Region, welche die Carboxylgruppe enthält, zeigt bei einem Vergleich der Aminosäuresequenzen verschiedener Antikörper eine hohe Übereinstimmung und wird daher als konstante Region (C L -Region, constant light chain) bezeichnet. Das aminoterminale Ende besitzt eine große Sequenzvariabilität und wird daher variable Region (V L -Region, variable light chain) genannt. Die schwere Polypeptidkette (heavy chain) existiert in fünf Formen () mit einem Molekulargewicht von Da. Jede dieser Formen ist mit einem Leichtkettentyp frei kombinierbar, wodurch die fünf Immunglobulinklassen (IgA, IgD, IgE, IgG bzw. IgM) entstehen. Variationen in der Schwerkettenstruktur innerhalb einer Klasse (z. B. 1, 2, 3 u. 4 ) führt zur Bildung von Subklassen (entsprechend: IgG1, IgG2, IgG3, bzw. IgG4). Die Struktur der schweren Ketten ist denen der Leichtkette sehr ähnlich. Bedingt durch die größere Molmasse besitzen sie jedoch neben der variablen Region (V H -Region, variable heavy chain) drei

9 9 konstante Domänen (C H 1, C H 2, C H 3). Der Kohlenhydratanteil, den alle Antikörper besitzen, ist an die C H 2-Region gebunden. Die pflanzliche Proteinase Papain spaltet Immunglobuline in der Region zwischen den C H 1- und C H 2- Domänen, der sogenannten Türangelregion (hinge region), wodurch zwei identische Fab-Fragmente und ein Fc-Fragment entstehen (Abb. 2). Ein weiteres Enzym für die Fragmentierung von Antikörpern ist Pepsin, welches zwei größere Fragmente erzeugt, das F(ab') 2 -Fragment, das die über die Hinge- Region miteinander verbundenen Fab-Regionen umfasst, und das pfc'- Fragment, welches den C H 3- Domänen des Antikörpermoleküls entspricht. Mit diesen Fragmenten konnte gezeigt werden, dass die Antigen-Antikörper-Bindungsorte in den variablen Bereichen (V L, V H ) des Antikörpers liegen, während der Fc-Teil die Bindung des Immunglobulins an verschiedene Zellen des Immunsystems, sowie Komplementfaktoren vermittelt. Die hohe Beweglichkeit der Hinge-Region erlaubt eine Änderung des Abstandes der Antigenbindungsorte, wodurch diese unabhängig voneinander verfügbar sind.

10 10 F(ab ) 2 Peptide mit niedriger Molmasse pfc Pepsin Papain sekundäre Spaltung durch Papain Fc Fc Fab Abb. 2: Enzymatische Spaltung von Immunglobulinen Bei der Gewinnung von Antikörpern unterscheidet man diese in zwei Gruppen:

11 11 1) polyklonale Antikörper: Hier handelt es sich um eine Mischung von verschiedenen, gegen diverse Epitope gerichteten Antikörpern. Sie werden aus dem Serum von zuvor mit Antigen immunisierten Tieren gewonnen. 2) monoklonale Antikörper: Richten sich genau gegen ein spezifisches Epitop eines Antigens. Für die Gewinnung werden Plasmazellen von zuvor immunisierten Tieren durch Fusion mit Tumorzellen immortalisiert (Hybridom-Technik). Die so erhaltenen Hybridoma- Zellen werden mehrfach vereinzelt (kloniert), so dass sich ein Zellstamm ergibt, der auf nur eine Plasmazelle zurückgeht. Dieser Zellstamm kann nun theoretisch eine unendlich große Menge monoklonaler Antikörper bilden. 2. Versuchsbeschreibung Zur Bestimmung von Antikörpertitern (AK) gegen bestimmte Antigene existiert mittlerweile eine Vielzahl von Methoden, wobei an dieser Stelle nur der RIA (radioimmunoassay) und der ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) genannt seien. Beide Assays sind sehr einfach in der Durchführung, doch sehr sensitiv und zuverlässig, was zu deren weit verbreiteter Anwendung geführt hat. Die Grundlage beider Methoden beruht auf der Tatsache, dass bestimmte Kunststoffoberflächen (z. B. Polystyrol, Polypropylen, Polycarbonat, Polyvinylchlorid) geringe Mengen der meisten Proteine fest binden können. Beim ELISA können je nach Problemstellung verschiedene Typen des Tests durchgeführt werden: 1) indirekter ELISA: Das zu testende Antigen wird an eine geeignete Plastikoberfläche adsorbiert (Coating, I in Abb. 3). Nach Entfernen des Antigens werden noch freie Bindungsstellen mit einem nicht reagierenden Protein (z.b. Rinderserumalbumin) blockiert (hier nicht dargestellt). Die Detektion des Antigens erfolgt über einen für dieses Antigen spezifischen Primärantikörper (II in Abb. 3). Durch einen Sekundärantikörper, der an den Primärantikörper bindet und mit einem Enzym markiert ist, kann nach Zugabe des entsprechenden Substrats ein Nachweis des Antigens über die Enzymreaktion erfolgen (III in Abb. 3).

12 12 III I Antigen II Abb. 3: indirekter ELISA 2) Sandwich-ELISA: Im Gegensatz zum indirekten ELISA wird hier nicht das Antigen, sondern ein für das Antigen spezifischer Antikörper an die Plastikoberfläche gebunden. Dieser ist, nachdem noch freie Bindungstellen mit einem nicht reagierenden Protein blockiert wurden, in der Lage, sein Antigen aus einer Probelösung zu binden. Die Detektion erfolgt wiederum über einen zweiten Antikörper, der an ein anderes Epitop des Antigens bindet und so das Sandwich bildet (AK-Antigen- AK-Komplex). Der Nachweis der Bindung erfolgt wie im indirekten ELISA über einen mit Enzym markierten Sekundärantikörper, der z.b. ein farbloses Substrat zu einer farbigen Verbindung umsetzt. 3) kompetitiver ELISA: Anstelle eines zweiten, markierten Antikörpers wird ein markiertes Kompetitor-Antigen verwendet. Dieses ist dem Analyten (Antigen) strukturell ähnlich und konkurriert so mit diesem um die Bindungstellen am Antikörper. Je weniger Analyt in einer Probe enthalten ist, desto mehr Kompetitor bindet an den Antikörper und desto intensiver ist die Farbreaktion. Die Farbintensität verhält sich umgekehrt zur Analyt-Konzentration: wenig Analyt = fast alle Paratope (Bindungsstelle am Antikörper) vom markierten Kompetitor besetzt = starke Farbreaktion viel Analyt = schwache Farbreaktion Im Praktikumsversuch soll ein His-Tag markiertes Protein (Gelonin) aus Expressionsversuchen mittels eines indirekten ELISAs nachgewiesen werden. Es wird deshalb ein monoklonaler Anti-His-Tag Antikörper als Primärantikörper verwendet. Zur Nachweisreaktion wird ein an Alkalische Phosphatase (AP) gebundener Anti-Maus-Antikörper verwendet. Das Substrat der Alkalischen Phosphatase ist para-nitrophenylphosphat. Durch das Enzym wird hydrolytisch die Phosphatgruppe abgespalten und es bildet sich zunächst farbloses para-nitrophenol. Im Alkalischen wird para- Nitrophenol zum gelben para-nitrophenolat-anion, welches bei 405 nm photometrisch bestimmt werden kann. Reaktion:

13 13 3. Versuchsdurchführung 3.1 Reagenzien und Chemikalien Testprotein (Antigen) Rekombinantes Gelonin mit His-Tag (10 µg/ml) Gelonin aus Samen von Gelonium multiflorum (10 µg/ml) Kontrollen Negativkontrollen: 10 µg/ml Cytochrom c Positivkontrolle: 10 µg/ml rekombinantes Gelonin Primärantikörper Monoklonaler antigenspezifischer Antikörper: Mouse-Anti-His-Antikörper Verdünnung: 1:2000 mit PBS-Tween Enzymkonjugat Alkalische-Phosphatase-markierte, polyklonale Antikörper gegen Maus-Immunglobuline: Anti-mouse-lgG-Antikörper (AP) Verdünnung: 1:1000 mit PBS-Tween Coating-Puffer Lösung A: 100 ml 0,2 M Na 2 CO 3 (2,12 g ad 100 ml) Lösung B: 100 ml 0,2 M NaHCO 3 (1,68 g ad 100 ml) Gebrauchslösung : 8,5 ml Lösung A + 4 ml Lösung B ph 10,6 (ph-kontrolle) ad 50 ml mit bidest. Wasser Waschpuffer PBS-Tween Na 2 HPO 4 0,92 g NaH 2 PO 4 * H 2 O 0,35 g NaCl 8,18 g ph 7,2 ad 1 l mit deionisiertem Wasser 100 ml zur Seite stellen (= PBS-Puffer) zu den restlichen 900 ml:

14 14 Tween 20 0,45 ml Blockierlösung 1% BSA in PBS 250 mg BSA in 25 ml PBS Substratpuffer (AP) MgCl 2 * 6 H 2 O 0,1 g DEA (Diethanolamin) 97 ml ph 9,8 ad 1 l bidest. Wasser Substratlösung (AP) 15 mg p-nitrophenylphosphat ad 15 ml Substratpuffer 3.2 Versuchsablauf a) Das Antigen wird im Coating-Puffer auf eine Konzentration von 10 g/ml eingestellt. Je Napf werden 100 µl dieser Lösung eingebracht. Die Bindung an die feste Phase erfolgt über Nacht bei 4 C. b) Die Näpfe der Platte werden durch Ausschlagen geleert. Pro Napf werden 200 µl der Blockierlösung eingefüllt. Die Inkubation erfolgt bei Raumtemperatur für 90 min. c) 2-maliges Waschen mit jeweils 200 µl PBS-Tween-Puffer. Ausschlagen der Näpfe. d) Je Napf werden 100 l Primärantikörperlösung eingebracht. Die Inkubation erfolgt bei Raumtemperatur für 1 h (siehe Aufteilung der Mikrotiterplatte, Abschn. 3.3) e) 2 Waschen. Näpfe ausschlagen. f) Das Enzymkonjugat wird auf eine geeignete Arbeitskonzentration gebracht, d. h. ca verdünnt (10 l Enzymkonjugatlsg ml PBS-Tween) und 100 l pro Napf eingebracht. Die Inkubation erfolgt bei Raumtemperatur für 1 h. g) 2 Waschen. Näpfe ausschlagen. h) 100 l Substratlösung zugeben. Die Entwicklung erfolgt bei Raumtemperatur. Die Platte wird nach 10 min mit Hilfe eines EIA-Readers bei 414 nm vermessen. 3.3 Bestückung der Mikrotiterplatte a) Blank: Für die Messung benötigt der EIA-Reader eine Spalte der Platte als Blank. In die Spalte 1 dürfen deshalb keine Proben eingebracht werden. Stattdessen wird PBS einpipettiert. Alle anderen Schritte wie Blockieren, Konjugatzugabe usw. erfolgen wie beschrieben.

15 b) Negativkontrolle: 15 Um falsche positive Ergebnisse auszuschließen, müssen in jedem ELISA Negativkontrollen durchgeführt werden. Zu diesem Zweck wird eine Spalte der Platte nicht mit Antigen beschichtet. Das weitere Vorgehen erfolgt wieder wie beschrieben. Die Ursachen für falschpositive Ergebnisse können sein: Unspezifische Adsorption des Enzymkonjugates an das Plastikmaterial, Kreuzreaktionen des Enzymkonjugates, c) Positivkontrolle: Um sicherzustellen, dass der ELISA richtig durchgeführt wurde, sollte immer eine Spalte der Platte mit einer Probe bestückt werden, von der bekannt ist, dass sie für das verwendete Antigen spezifische Antikörper enthält. Diese Löcher müssen sich beim Entwickeln auf jeden Fall färben. 4. Auswertung Hinweis: Bitte pro Gruppe einen USB-Stick mitbringen. Die Messdaten stehen nur in digitaler Form zur Verfügung. Die Auswertung erfolgt zunächst optisch, indem man die Löcher notiert, die deutlich stärker gefärbt sind als die Negativkontrollen. Die Messwerte des EIA-Readers werden statistisch ausgewertet. Dazu werden die Negativkontrollen gemittelt und die Standardabweichung berechnet. Für jede Probe wird ebenfalls der Mittelwert aus den Messwerten gebildet. Eine Probe ist dann positiv, wenn dieser Mittelwert größer ist als die Summe aus dem Mittelwert der Negativkontrollen und der zweifachen Standardabweichung. 5. Literatur Harlow, E., Lane, D., Antibodies. A Laboratory Manual, ColdSpringHarbor Laboratory, New York, Kap. 14, Immunoassays, S Goding, J. W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2nd ed., Academic Press, London, Kap. 3.10, Screening Assays, S Peters, J. H., Baumgarten, H., (Hrsg.), Monoklonale Antikörper. Herstellung und Charakterisierung, 2. Auflage, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Kap. 10, Nachweis von monoklonalen Antikörpern, S

16 16 Hemmkinetik mit Lactatdehydrogenase Einführung Proteine Proteine gehören zu den wichtigsten Makromolekülen lebender Zellen. Sie sind aus 20 verschiedenen Aminosäuren aufgebaut, die in spezieller Reihenfolge (Sequenz, Primärstruktur) über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind (Polypeptidketten). Die meisten Polypeptidketten bestehen aus ca. 100 bis 300 Aminosäureresten, entsprechend molaren Massen von ca bis g/mol, es gibt jedoch auch kleinere und viel größere.die Aminosäuren besitzen Seitenketten mit unterschiedlichen physikalischen (hydophob, hyophil) und chemischen Eigenschaften (aromatisch, polar, sauer, basisch). Die fortlaufende Kette von Peptidbindungen und C α -Atomen wird Rückgrat genannt. Die Polypeptidketten sind in der Zelle nicht beliebig ausgestreckt oder geknickt, sondern liegen in ganz bestimmten Konformationen (Faltungen) vor, die von der Aminosäuresequenz abhängen und durch Wechselwirkungen oder Kräfte (hydrophobe Wechselwirkungen, Van-der-Waals-Kräfte, ionische Kräfte, Wasserstoffbrückenbindungen) oder zusätzliche kovalent-chemische Bindungen (Disulfidbrücken) zwischen ihren Atomen und Atomgruppen stabilisiert werden (Raumstruktur, Tertiärstruktur). Im wässrigen Milieu der Zelle ordnen sich hydrophobe Aminosäurereste im Inneren der Struktur an, geladene und polare Gruppen stellen an der Außenseite Kontakte und Wechselwirkungen mit dem Wasser her. Teilstrukturen sind oft in chrakteristischer regelmäßiger Form ausgebildet und werden durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Atomen des Rückgrats stabilisiert (Sekundärstrukturen wie schraubenförmige α-helices oder aus aneinandergelagerten Strängen gebildete β-faltblätter). Schließlich können sich auch mehrere gefaltete Polypeptidketten (Untereinheiten) zusammenlagern (Quartärstruktur). Die Raumstruktur der Proteine (sog. native Struktur) ist wichtig für ihre biologische Funktion. Unter verschiedenen Bedingungen - z. B. Hitze, extreme ph-werte, Detergentien oder unpolare Lösungsmittel - kann es zur Entfaltung (Denaturierung) unter Verlust der definierten Raumstruktur und der Funktion kommen. Die dabei entstehenden Zufallsstrukturen neigen zur Aggregation und werden in Wasser unlöslich. Enzyme Die Funktion vieler Proteine ist es, chemische Reaktionen zu beschleunigen. Sie wirken damit als Katalysatoren und werden Enzyme genannt. Ein wichtiges Funktionsprinzip bei der enzymatischen Aktivität ist neben anderen, dass die Enzyme das reaktionsfähige Molekül (Substrat) samt eventuellen Reaktionspartnern (Cosubstrate) in solcher Weise binden, dass die Reaktion erleichtert (die Energie des Übergangszustandes herabgesetzt) wird. Dabei sind die meisten Enzyme spezifisch für die Substrate, die sie binden, und die Reaktion, die sie an ihnen katalysieren. Bestimmte Substrate mittlerer Molekülgröße, die nach der Reaktion in kurzen Reaktionszyklen regeneriert werden (und damit in gewissem Sinn ebenso wenig verbraucht werden wie die Enzyme), werden als Coenzyme bezeichnet. Das Gleichgewicht der Reaktion wird bei der Katalyse nicht verändert und es wird sowohl die Hin- wie auch die Rückreaktion katalysiert. Die Bindung der Substrate und Coenzyme durch das Enzym findet an spezifischen Bereichen (Bindungsstellen oder -taschen) seiner Struktur statt. Mit diesen Bereichen überlappen sich teilweise die sog. aktiven Zentren, an denen die eigentliche katalysierte Reaktion stattfindet. Die Reaktionsgeschwindigkeit der katalysierten Reaktion (d. i. wieviel Substrat sich pro Zeiteinheit in Produkt

17 17 umsetzt) kann bei gegebener Enzymkonzentration eine Obergrenze (maximale Geschwindigkeit, v max ) nicht übersteigen (Sättigungskinetik), die erreicht wird, sobald alle Bindungsstellen des Enzyms mit Substrat gesättigt sind. Neben den Substraten gibt es natürlich vorkommende oder künstlich erzeugte Stoffe, die die Enzymaktivität reversibel beeinflussen. Diese Effektoren werden in Aktivatoren, die die Aktivität erhöhen, und Inhibitoren, welche sie erniedrigen, eingeteilt. Sie können eigene Bindungsstellen am Enzym besetzen und ihre Wirkung durch Beeinflussung der Enzymkonformation ausüben (allosterische Effektoren) oder es können mit dem Substrat aufgrund struktureller Ähnlichkeit um dieselbe Bindungsstelle konkurrierende Hemmstoffe die Katalyse behindern (kompetitive Hemmung). Enzymkinetik nach Michaelis und Menten Die Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatisch katalysierten Reaktion hängt u. a. auch von der Substratkonzentration ab. Bei der maximalen Umsatzgeschwindigkeit (v max ) ist das Enzym vollständig mit Substrat abgesättigt, während bei geringeren Substratkonzentrationen nicht alle Enzymmoleküle abgesättigt sind. v v max v max /2 K M [S] Abb. 1 Sättigungskinetik (Reaktionsgeschwindigkeit über Substratkonzentration aufgetragen) 1923 lieferten Michaelis und Menten die mathematische Analyse dieses Verhaltens. Sie nahmen folgenden Reaktionsverlauf an: E + S k 1 k 2 ES k 3 k 4 P + E (E = Enzym, S = Substrat, ES = Enzymsubstratkomplex, P = Produkt) [E] ist die Gesamtkonzentration an Enzym, ([E] - [ES]) die Konzentration an freiem Enzym. Die Menge an S, die an E gebunden wird, ist, bezogen auf die Gesamtmenge an S, sehr klein und kann vernachlässigt werden. [S] entspricht dann zu Beginn der Messung der eingesetzten Substratkonzentration, da noch kein P gebildet wurde. Aus demselben Grund ist bei Messung der Anfangsgeschwindigkeit die Bildung von ES aus P + E mit der Geschwindigkeitskonstante k 4 vernachlässigbar.

18 18 Ist die Bildungsgeschwindigkeit von ES, k 1 ([E] - [ES]) [S], gleich seiner Zerfallsgeschwindigkeit, k 2 [ES] + k 3 [ES], so besteht ein Fließgleichgewicht (stationärer Zustand, steady state). Gleichsetzen der beiden Ausdrücke und Zusammenfassen der drei Geschwindigkeitskonstanten ergibt die Michaeliskonstante K M k2 k k 1 3 E ES ES S Wenn k 2 k 3, kann k 3 vernachlässigt werden, und K M k 2 /k 1 = K D ist die Dissoziationskonstante des Gleichgewichts E + S ES. Eine Bestimmung von K M ist dann möglich, wenn [ES] bestimmt werden kann. Dies ist auf direktem Weg sehr schwierig, aber die Reaktionsgeschwindigkeit ist proportional [ES]: v = k 3 [ES] (2) Aus Gleichung (1) wird [ES] errechnet: ES E S S K M Dieser Wert wird in Gleichung (2) eingesetzt: v k 3 K M E S S Wenn [S] so groß ist, dass die gesamte eingesetzte Enzymmenge als Enzymsubstratkomplex vorliegt ([E] = [ES]), ist die maximale Geschwindigkeit erreicht: Daher: v max = k 3 [E] v v K max M S S Dies ist die von Michaelis und Menten entwickelte Gleichung. Bei halbmaximaler Geschwindigkeit wird K M = [S]. K M hat somit die Dimension einer Konzentration. Bei Enzymreaktionen, an denen zwei oder mehr Substrate (und/oder Coenzyme) beteiligt sind, kann für jedes ein eigener K M -Wert bestimmt werden, indem man bei dessen Messung die übrigen Substrate (Coenzyme) in sättigenden Konzentrationen einsetzt. Kinetik der kompetitiven Hemmung Die kompetitive Hemmung beruht darauf, dass in einer individuellen Bindungstasche des Enzyms entweder das Substrat oder den Hemmstoff gebunden werden kann, aber nicht beide. Bei großem Überschuss an Substrat kann trotz der Anwesenheit von Inhibitor die Maximalgeschwindigkeit erreicht werden, die sich daher nicht ändert. Die Substratkonzentration, bei der die halbmaximale Geschwindigkeit errreicht wird (die scheinbare Michaelis-Konstante) wird erhöht. (1)

19 19 Wir haben in der Reaktionsgleichung ein konkurrierendes Gleichgewicht (k 5 /k 6 ) zu berücksichtigen: EI + I k 6 k 5 E + S k 2 k 1 ES k 3 k 4 P + E (I = Inhibitor, EI = Enzym-Inhibitor-Komplex) In der Michaelis-Menten-Gleichung wird K M mit einem Term multipliziert, der die Inhibitorkonzentration [I] und die Inhibitorkonstante K I enthält: v K M vmax S I 1 K I S v max v max /2 ohne Inhibitor mit Inhibitor mit mehr Inhibitor K M K M (1+[I]/K I ) (scheinbare K M ) Abb. 2 Kinetik mit kompetitivem Inhibitor

20 20 Lactatdehydrogenase Lactatdehydrogenase (LDH) ist ein Protein aus vier gleichen Untereinheiten (Homotetramer): Abb. 3 Lactatdehydrogenase aus menschlichem Skelettmuskel (Bild: Wikipedia, Strukturdaten: Protein Data Bank, Eintrag 1i10). Es ist keine atomar aufgelöste Struktur wiedergegeben, sondern eine schematische Repräsentation des Protein-Rückgrats durch Bänder und Schnüre. Ihrer Funktion nach ist LDH ein Enzym, das die Reduktion von Pyruvat zu Lactat katalysiert unter gleichzeitiger Oxidation des Coenzyms NADH zu NAD +. Pyruvat + NADH + H + (LDH) L-Lactat + NAD + Pyruvat entsteht in der Glykolyse aus Glucose, wobei gleichzeitig NADH und ATP gebildet werden. Die Regenerierung von NAD + aus NADH in der LDH-Reaktion ermöglicht die Fortsetzung der Glykolyse und somit die weitere ATP-Bildung, auch wenn keine anderen Elektronenakzeptoren (Oxidationsmittel) wie z. B. Sauerstoff (O 2 ) vorhanden sind (z. B. anaerobe Muskelarbeit) oder genetisch bedingt keine Atmungskette existiert (z. B. anaerobe Bakterien).

21 H H H 21 Pyruvat NAD + NADH O - L-Lactat AMP Abb. 4 Strukturformeln von Pyruvat, L-Lactat, NAD +, NADH und AMP. Die Struktur von NADH ist abgekürzt, ihren fehlenden Teil sieht man bei NAD +. Man beachte die Struktur-Übereinstimmungen bei AMP und NAD + /NADH. Photometrie Wird eine Küvette, die mit einer absorbierenden Flüssigkeit oder Lösung gefüllt ist, von Licht durchstrahlt, dann bewirkt die Absorption durch den Küvetteninhalt eine Intensitätsabnahme des Lichtstrahls. Diese ist von der Wellenlänge des Lichts, der Konzentration der absorbierenden Probe, der Länge des Lichtweges durch die Messlösung sowie einer Stoffkonstanten (dem Extinktionskoeffizienten ) abhängig. Die Wellenlängen, bei denen ein Maximum hat (die Absorptionsmaxima) sind für absorbierende Atomgruppierungen (Chromophore) wie z. B. Nitrogruppen, Doppelbindungen, Aromaten u. v. a. charakteristisch. Die Konzentrationsbestimmung durch Messung der Absorption (auch Extinktion genannt) einer monochromatischen Strahlung nach Durchgang durch die Messlösung bezeichnet man als Photometrie. Grundlage für die photometrischen Konzentrationsbestimmungen ist das Lambert-Beersche Gesetz, nach dem sich die Konzentration einer Lichtenergie absorbierenden Verbindung in verdünnter Lösung berechnen lässt: c E d c = Konzentration [mol/l] = molarer Extinktionskoeffizient [l mol 1 cm 1 ] d = Schichtdicke der Küvette [cm] E = Extinktion (dimensionslos) Die Ableitung des Lambert-Beerschen Gesetzes ist den Lehrbüchern zu entnehmen. Aufgabe Bestimmung der K M -Werte bzw. scheinbaren K M -Werte der LDH aus Schweine-Skelettmuskel für NAD + ohne Inhibitor und mit zwei verschiedenen Inhibitor-Konzentrationen sowie Bestimmung der Maximalgeschwindigkeit und der Inhibitorkonstanten für AMP in diesem System.

22 22 Als Inhibitor wird AMP benutzt. Es kann auf Grund struktureller Ähnlichkeit mit NAD + (s. Abb. 4) an dieselbe Bindungstasche der LDH binden und hemmt daher kompetitiv. Experimentelle Erwägungen Aus praktischen Gründen untersuchen wir die Rückreaktion der physiologischen LDH- Reaktion: L-Lactat + NAD + (LDH) Pyruvat + NADH + H + Während der Reaktion nimmt die Konzentration von NADH und Pyruvat zu. Während Pyruvat (und Lactat) wegen mangelnder Absorption im sichtbaren oder nahen UV-Licht photometrisch schlecht zu bestimmen sind, kann NADH bei einer Wellenlänge von 340 nm verfolgt werden, wo eine seiner Absorptionsbanden ein Maximum besitzt, ohne dass NAD + dort absorbiert. (Manchmal wird NADH gerätebedingt auch bei 366 nm gemessen. Dies entspricht jedoch nicht seinem Absorptionsmaximum und ist daher weniger günstig.) ε [10 3 l mol -1 cm -1 ] Abb. 5 Absorptionsspektren von NAD + und NADH Der molare Extinktionskoeffizient bei 340 nm ε 340 von NADH beträgt 6300 l mol 1 cm 1. Die Schichtdicke unserer Küvetten beträgt 1 cm. Das bedeutet z. B., dass eine molare Lösung (Lösung von 0,1 mmol/l) von NADH in unserer Küvette bei 340 nm eine Extinktion von 0,63 aufweisen würde. Da Reaktionsgeschwindigkeiten grundsätzlich temperaturabhängig sind, müssen die Proben thermostatisiert werden. Um die Gültigkeit der Michaelis-Menten-Gleichung sicherzustellen, muss die Anfangsgeschwindigkeit bestimmt werden. Daher wird das Enzym zuletzt zugegeben, möglichst schnell gemischt und sofort gemessen.

23 23 Die Aufgabe unterteilt sich wie folgt: 1. Messung der Reaktionsgeschwindigkeit bei 5 verschiedenen NAD + -Konzentrationen. Die Konzentration von Lactat wird dabei in gleichbleibender, sättigender Höhe eingesetzt. AMP wird zunächst nicht zugegeben. 2. Zweimalige Wiederholung der Messreihe bei zwei verschiedenen AMP-Konzentrationen. 3. Auswertung Durchführung Von den Assistenten werden folgende Stammlösungen bereitgestellt: Lösung Konzentration, ph Vorbereitungshinweise für Assistenten Glycinpuffer 0,1 M, ph 9,5 Phosphatpuffer 67 mm NaH 2 PO 4, ph 7,2 LDH aus Schweine- Skelettmuskel ca. 0,125 mg/ml in Phosphatpuffer ph 7,2, genaue Konz. wird bekannt gegeben 100 µl Ammoniumsulfatsuspension (10 mg/ml) 10 min zentrifugieren bei rpm (Eppendorf- Zentrifuge). Pellet aufnehmen in 200 µl Phosphatpuffer. Photometr. Konz.-Best.: A 280 = 1,34 entspricht 1 mg/ml (für diese Messung 1:10 verdünnen). Tabelle 1 Für Versuch 1:40 verdünnen. Von den Studierenden werden folgende Stammlösungen hergestellt: Lösung Konzentration Hinweise NAD + 10 mm in Wasser (sprich: 10 millimolar, Bedeutung: 10 mmol/l) molare Masse M W = 663,4 genaue Einwaage wird bekannt gegeben AMP 10 mm in Glycinpuffer ph 9,5 M W = 347,22 genaue Einwaage wird bekannt gegeben L-Lactat 0,7 M in Glycinpuffer ph 9,5 Lithium-Lactat, M W = 96,01 genaue Einwaage wird bekannt gegeben Tabelle 2 Alle Stammlösungen werden mit Eiswasser gekühlt. Messung ohne Inhibitor In 15-ml-Falcon-Röhrchen werden die in der folgenden Tabelle 3 aufgeführten Mengen zusammenpipettiert und gemischt (Raumtemperatur). Pipettierschema Angaben in ml Probe Glycin-Puffer 4,655 4,640 4,610 4,55 4,40 Lactat 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 AMP NAD + 0,045 0,06 0,09 0,15 0,3 Summe Tabelle 3

24 24 Messung der Proben Aus jedem Röhrchen werden 0,5 ml entnommen und in nummerierte Plastikküvetten bis zur Messung (mind. 5 min) im Thermoblock auf 25 temperiert. Danach werden für Küvette 1 folgende Operationen durchgeführt, wobei die Messwerte in die unten stehende Tabelle 4 eingetragen werden: Küvette in den Strahlengang des Photometers stellen (Markierungspfeil nach vorne zeigend). Photometer mit geschlossenem Deckel bei 340 nm auf 0 abgleichen ( blanken ). Dann muss es schnell gehen: Stoppuhr starten, möglichst gleichzeitig 10 µl der Enzymstammlösung in die Küvette pipettieren, schnell aber gründlich mit der Pipette umrühren, Deckel des Photometers schließen und nach 6 s E 340 ablesen und notieren (Tabelle 4). Danach weitere 90 s lang alle 9 s E 340 und Zeit ablesen und notieren. Auf dieselbe Weise werden die Proben 2 5 gemessen und die Werte in die unten stehende Tabelle 4 eingetragen. Messdaten ohne Inhibitor Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Zeit [s] E 340 Zeit [s] E 340 Zeit [s] E 340 Zeit [s] E 340 Zeit [s] E Tabelle 4

25 Messung mit 0,3 ml AMP-Lösung In 15-ml-Falcon-Röhrchen werden die in der folgenden Tabelle 5 aufgeführten Mengen zusammenpipettiert und gemischt (Raumtemperatur). 25 Pipettierschema Angaben in ml Probe Glycin-Puffer 4,355 4,34 4,31 4,25 4,1 Lactat 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 AMP 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 NAD + 0,045 0,06 0,09 0,15 0,3 Summe Tabelle 5 Messung der Proben Die Proben 1 5 werden wie oben beschrieben gemessen und die Werte in die unten stehende Tabelle 6 eingetragen. Messdaten mit 0,3 ml AMP-Lösung Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Zeit [s] E 340 Zeit [s] E 340 Zeit [s] E 340 Zeit [s] E 340 Zeit [s] E Tabelle 6 Messung mit 0,6 ml AMP-Lösung In 15-ml-Falcon-Röhrchen werden die in der folgenden Tabelle 8 aufgeführten Mengen zusammenpipettiert und gemischt (Raumtemperatur).

26 26 Pipettierschema Angaben in ml Probe Glycin-Puffer 4,055 4,04 4,01 3,95 3,8 Lactat 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 AMP 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 NAD + 0,045 0,06 0,09 0,15 0,3 Summe Tabelle 7 Messung der Proben Die Proben 1 5 werden wie oben beschrieben gemessen und die Werte in die unten stehende Tabelle 8 eingetragen. Messdaten mit 0,6 ml AMP-Lösung Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Zeit [s] E 340 Zeit [s] E 340 Zeit [s] E 340 Zeit [s] E 340 Zeit [s] E Tabelle 8 Auswertung Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen Aus jeder Zeitreihe einer Probe muss die Anfangsgeschwindigkeit bestimmt werden. Dazu wird wie folgt vorgegangen: (1) Ein Diagramm (Abszisse = Zeit-Achse (t), Ordinate = Extinktions-Achse (E 340 )) wird vorbereitet. Skalieren Sie Extinktionsachse so, dass alle Messpunkt Platz finden. (2) Die Messpunkte werden in das Diagramm eingetragen.

27 ΔE = 0,62 27 (3) Die Messpunkte im Diagramm werden von Hand mit einer glatten Kurve gefittet (angenähert). Die Kurve muss nicht alle Messpunkte exakt berühren, da sie eine Ausgleichskurve darstellen soll und die Messpunkte streuen können. (4) Die glatte Kurve wird über den Beginn der Messung hinaus nach links bis zum Schnittpunkt mit der Abszisse (Zeit-Achse) extrapoliert (weitergeführt). Dabei soll der bisherige Krümmungsverlauf der Kurve so gut wie möglich weitergeführt werden. Auf Grund von Unwägbarkeiten beim Mischvorgang wird die Extrapolation im Allgemeinen die Abszisse nicht bei t=0 schneiden. (5) Am Schnittpunkt mit der Abszisse wird mit dem Lineal eine Tangente an die extrapolierte Kurve gelegt. (6) Mit Hilfe eines Steigungsdreiecks an der Tangente wird die Tangentensteigung und somit die Anfangssteigung der Kurve ermittelt. Diese entspricht der Anfangsgeschwindigkeit der Enzymreaktion. Beispiel: E 340 0,8 Δt = 1 min 0,6 0,4 0,2 t [s] -3 Abb Beispiel für die graphische Auswertung einer Extinktions/Zeit-Kurve. ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: 0,62 / 1 min = 0,62/min

28 28 Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen ohne Inhibitor Ohne Inhibitor, Probe 1 E 340 t [s] ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: 96 Ohne Inhibitor, Probe 2 E 340 t [s] ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: 96

29 Ohne Inhibitor, Probe 3 29 E 340 t [s] ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: 96 Ohne Inhibitor, Probe 4 E 340 t [s] ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: 96

30 30 Ohne Inhibitor, Probe 5 E 340 t [s] ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: 96 Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen mit 0,3 ml AMP-Lösung Mit 0,3 ml AMP-Lösung, Probe 1 E 340 t [s] ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: 96

31 Mit 0,3 ml AMP-Lösung, Probe 2 31 E 340 t [s] ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: 96 Mit 0,3 ml AMP-Lösung, Probe 3 E 340 t [s] ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: 96

32 32 Mit 0,3 ml AMP-Lösung, Probe 4 E 340 t [s] ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: 96 Mit 0,3 ml AMP-Lösung, Probe 5 E 340 t [s] ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: 96

33 Graphische Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten aus den Zeitreihen mit 0,6 ml AMP-Lösung 33 Mit 0,6 ml AMP-Lösung, Probe 1 E 340 t [s] ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: 96 Mit 0,6 ml AMP-Lösung, Probe 2 E 340 t [s] ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: 96

34 34 Mit 0,6 ml AMP-Lösung, Probe 3 E 340 t [s] ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: 96 Mit 0,6 ml AMP-Lösung, Probe 4 E 340 t [s] ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: 96

35 Mit 0,6 ml AMP-Lösung, Probe 5 35 E ΔE/Δt aus dem Steigungsdreieck: t [s] 96 Die reziproke oder Lineweaver-Burk-Auftragung Die Auftragung der Anfangsgeschwindigkeit v über der anfänglichen Substratkonzentration [S] wie in Abb. 1 hat die Schwierigkeit, dass sehr hohe NAD + -Konzentrationen angewandt werden müssten, um den Maximalwert v max zu erhalten. Das Verfahren von Lineweaver und Burk umgeht diese Schwierigkeit. Die Michaelis-Menten- Gleichung wird folgendermaßen umgeformt: S S 1 KM KM 1 1 v v v v max max S max Diese Gleichung hat die allgemeine Form y = ax + b (mit y = 1/v und x = 1/[S]) und stellt die Gleichung einer Geraden dar. Es resultiert daher eine Gerade, wenn die experimentell gewonnenen Daten in Form von 1/v gegen 1/[S] aufgetragen werden. Die Steigung a der Geraden entspricht K M /v max, der Ordinatenabschnitt 1/v max und der Abszissenabschnitt 1/K M (Abb. 3).

36 36 1/v a=k M /v max Abb. 7 2/v max 1/v max x 1/K M 1/K M 1/[S] Reziproke oder Lineweaver-Burk-Auftragung Die ermittelten Tangentensteigungen (ΔE/Δt) sind nach dem Lambert-Beerschen Gesetz proportional zur jeweiligen zeitlichen Zunahme der NADH-Konzentration (Δc/Δt) und somit zur Geschwindigkeit v der enzymatischen Reaktion. Proportionalitätsfaktor ist 1/ε 340, wobei ε 340 = 6300 l mol -1 cm -1. Zusätzlich muss die Schichtdicke d der Probe im Strahlengang berücksichtigt werden (1 cm): [ ] [ ] oder mit anderen Einheiten: [ ] Die Extinktion E und die Extinktionsänderung ΔE sind dimensionslos. Statt 1/[S] wird 1/[NAD + ], die reziproke NAD + -Konzentration zu Beginn der jeweiligen Reaktion in der Küvette, auf der Abszisse aufgetragen. Verdünnungsberechnung NAD + wurde zunächst von der Stammlösung in das Falcon-Röhrchen pipettiert und dadurch verdünnt. Das Volumen im Falcon-Röhrchen ist 5 ml. Die NAD + -Konzentration im Falcon- Röhrchen berechnet sich also wie folgt: [NAD + ] Falcon = [NAD + ] Stammlösung NAD + -Volumen pipettiert / 5 ml Die Stammlösung ist 10 mm oder 10 µmol/ml, also wird: [NAD + ] Falcon = 10 µmol/ml NAD + -Volumen pipettiert / 5 ml Nachdem 0,5 ml Lösung aus dem Falcon-Röhrchen in die Küvette pipettiert wurden, wurden 0,01 ml Enzymlösung dazugegeben und dadurch das NAD + nochmals verdünnt (von 0,5 ml auf 0,51 ml). Man rechnet: [NAD + ] Küvette = [NAD + ] Falcon 0,5/0,51 = 10 µmol/ml NAD + -Volumen pipettiert / 5 ml 0,5/0,51

37 Maßgeblich ist die Konzentration in der Küvette. Genau dieselben Überlegungen gelten für den Inhibitor AMP. Berechnen Sie: 37 AMP-Volumen pipettiert [ml] [AMP] in Küvette [µmol/ml] 0,3 0,6 Tabelle 9

38 38 Umrechnung der Messwerte Tragen Sie Ihre Messergebnisse in die folgende Tabelle 10 ein oder erstellen Sie eine gleichwertige Excel-Tabelle und legen Sie diese mit dem Protokoll vor. Ohne Inhibitor NAD + -Vol. pipettiert [ml] [NAD + ] in Küvette [µmol/ml] 1/[NAD + ] in Küvette [ml/µmol] Steigung ΔE/Δt [1/min] v [ ] 1/v [ ] Probe 1 0,045 Probe 2 0,06 Probe 3 0,09 Probe 4 0,15 Probe 5 0,3 Mit 0,3 ml AMP NAD + -Vol. pipettiert [ml] [NAD + ] in Küvette [µmol/ml] 1/[NAD + ] in Küvette [ml/µmol] Steigung ΔE/Δt [1/min] v [ ] 1/v [ ] Probe 1 0,045 Probe 2 0,06 Probe 3 0,09 Probe 4 0,15 Probe 5 0,3 Mit 0,6 ml AMP NAD + -Vol. pipettiert [ml] [NAD + ] in Küvette [µmol/ml] 1/[NAD + ] in Küvette [ml/µmol] Steigung ΔE/Δt [1/min] v [ ] 1/v [ ] Probe 1 0,045 Probe 2 0,06 Probe 3 0,09 Probe 4 0,15 Probe 5 0,3 Tabelle 10

39 39 Graphische Bestimmung oder Berechnung der (scheinbaren) K M-Werte und der Maximalgeschwindigkeit Zeichnen Sie für jede Inhibitorkonzentration ein Diagramm mit den reziproken Geschwindigkeiten über den reziproken NAD + -Konzentrationen (bezogen auf Küvette). Zeichnen Sie mit dem Lineal eine Ausgleichsgerade ein und entnehmen Sie 1/K M (aus dem Abszissenabschnitt) und somit K M nach dem Vorbild von Abb. 7. Entnehmen Sie auch 1/v (aus dem Ordinatenabschnitt) und somit v. oder erstellen Sie die Diagramme und berechnen Sie die Ausgleichsgeraden sowie die K M - und v-werte mit einem Computer. Legen Sie die Computerdiagramme dem Assistenten mit diesem Protokoll vor. Für die Messungen in Abwesenheit von AMP erhalten wir den -Wert für NAD +. In Anwesenheit von AMP erhalten wir scheinbare -Werte. Die Einheit der - und -Werte ist µmol/ml oder mm. Ohne AMP 1/v [min ml / µmol] 1/[NAD+] [ml/µmol] Ergebnis ohne Inhibitor: (1/mM) (mm) (min/mm) (mm/min) Tabelle 11

40 40 Mit 0,3 ml AMP-Lösung 1/v [min ml / µmol] 1/[NAD+] [ml/µmol] Ergebnis mit 0,3 ml AMP: (1/mM) (mm) (min/mm) (mm/min) Tabelle 12

41 Mit 0,6 ml AMP-Lösung 41 1/v [min ml / µmol] 1/[NAD+] [ml/µmol] Ergebnis mit 0,6 ml AMP: (1/mM) (mm) (min/mm) (mm/min) Tabelle 13 Berechnung der Inhibitorkonstante K I sowie Berechnung und Umrechnung des Durchschnittwerts von v max Für die Messungen in Abwesenheit von AMP erhalten wir den -Wert für NAD +. In Anwesenheit von AMP erhalten wir scheinbare -Werte, für die gilt: ( ) Da K M und [I] bekannt sind, kann K I, die Inhibitorkonstante von AMP für NAD + bei LDH, berechnet werden:

42 42 Auch K I hat die Einheit µmol/ml oder mm. Berechnen Sie die Inhibitorkonstante K I, indem Sie für [I] die AMP-Konzentrationen aus Tabelle 9 und für K M den Wert aus der Messung ohne Inhibitor (Tabelle 11) einsetzen: [ ] (aus Tabelle 9) [ ] (aus Messung) [ ] Durchschnitt [ ] mit 0,3 ml AMP-Lösung mit 0,6 ml AMP-Lösung Tabelle 14 Die oben erhaltene Maximalgeschwindigkeit v max wird in der Enzymkinetik als volumenbezogene Aktivität bezeichnet und die oben dafür verwendeten Einheiten ( U/ml bezeichnet (U: von unit ). ) werden traditionell als Bei kompetitiver Inhibition ändert sich v max nicht. Wir sollten also bei allen Inhibitorkonzentrationen ähnliche v max -Werte erhalten haben und bilden daraus den Durchschnitt: [ ] (aus Messung) Durchschnitt [ ] ohne Inhibitor mit 0,3 ml AMP-Lösung mit 0,6 ml AMP-Lösung Tabelle 15 Um die spezifische Aktivität des Enzyms (in U/mg oder ) zu erhalten, muss die volumenbezogene Aktivität (Durchschnitt aus Tabelle 15) durch die Enzymkonzentration in der Küvette dividiert werden. Die Enzymkonzentration in der Küvette ist die bekannt gegebene Konzentration der Enzymstammlösung (in ) multipliziert mit. Letzteres ist der Faktor der Verdünnung, die dem Enzym widerfährt, weil 0,01 ml Enzymstammlösung zu 0,5 ml Küvetteninhalt gegeben werden. Berechnen Sie die Enzymkonzentration in der Küvette: Konzentration der Enzymstammlösung [ ] Konzentration in Küvette [ ]

43 Berechnen Sie die Aktivitätsmenge in der Küvette und die spezifische Aktivität des Enzyms: 43 volumenbez. Aktivität [U/ml] (v max aus Tabelle 15) spezifische Aktivität [U/mg] Abschließende Beurteilung Entsprachen alle Messergebnisse Ihren Erwartungen? o o Ja Nein Falls nicht, welche Ergebnisse waren unerwartet und welche Gründe könnten dafür vorliegen?