CASA-ELISA medac. Monoklonaler Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung des Cancer Associated Serum Antigen 700-VPD/240805

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1 CASAELISA medac Monoklonaler Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung des Cancer Associated Serum Antigen 700VPD/240805

2 HERSTELLER medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg VERTRIEB medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel.: / Fax: / BESTELLADRESSE Tel.: / Fax: / Literatur: S VPD/240805

3 CASAELISA medac Monoklonaler Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung des Cancer Associated Serum Antigen (CASA) KatalogNr.: 700 NUR FÜR FORSCHUNGSZWECKE EINFÜHRUNG Das Cancer Associated Serum Antigen (CASA) ist ein epitheliales Muzin. Dieses Glykoprotein wird auf der Oberfläche von Ovarial und anderen Epithelialtumorzellen exprimiert und ist bei Patienten mit Ovarialkarzinom, aber auch bei Mamma und Lungenkarzinom, in erhöhter Konzentration im Serum nachweisbar. CASA wird unabhängig bzw. komplementär zu anderen Tumormarkern exprimiert. Der CASAELISA medac ist ein SandwichAssay (s. Abb. 1). Es werden zwei monoklonale Antikörper zur Bestimmung der CASASpiegel im Serum eingesetzt. Der Antikörper BC2 ist auf der Mikrotiterplatte fixiert und bindet im ersten Reaktionsschritt das im Serum vorliegende CASA. Im zweiten Reaktionsschritt wird der Antikörper BC3 an das auf der Platte fixierte CASA angelagert. Der Nachweis des gebundenen CASA Komplexes erfolgt über die Zugabe eines Peroxidasemarkierten Konjugats. Die Peroxidase modifiziert das ABTSSubstrat. Die OD des Reaktionsproduktes korreliert mit der CASAKonzentration der. 700VPD/

4 TESTPRINZIP (Abb. 1) Mit AntiCASAAntikörper BC2 (IgG, Maus, monoklonal) beschichtete Mikrotiterplatte. Bindung des CASA über den Antiköper an die Platte. Bindung des Zweitantikörpers BC3 (IgM, Maus, monoklonal) an CASA. Bindung des AntiMausIgMPOD Konjugates an den BC2CASABC3 Komplex Durch Zugabe des ABTSSubstrats entsteht ein Farbkomplex, dessen OD mit der CASAKonzentration der korreliert. Die photometrische Auswertung erfolgt bei 405 nm VPD/240805

5 PACKUNGSINHALT KATNR.: Mikrotiterplatte: 12 Teststreifen à 8 Vertiefungen (mit Halterahmen und Trockenmittel im Aluminiumbeutel vakuumverschweißt), brechbar, beschichtet mit AntiCASA Antikörper BC2,IgG, Maus, monoklonal, gebrauchsfertig. 2. Standards: 6 Röhrchen à 200 µl mit 2, 4, 8, 16, 32 und 64 U/ml CASA, gebrauchsfertig, Xn, gesundheitsschädlich, R22, S233660, enthält Natriumazid (0,1 %) und Thimerosal (0,02 %). 3. Positive Kontrolle: 1 Röhrchen à 200 µl, humanes Serum (Konzentrationsangabe chargenabhängig auf dem Etikett vermerkt), gebrauchsfertig, Xn, gesundheitsschädlich, R22, S233660, enthält Natriumazid (0,1 %) und Thimerosal (0,02 %). 4. Negative Kontrolle: 1 Röhrchen à 2 ml, humanes Serum (Konzentration < 2 U/ml), gebrauchsfertig, Xn, gesundheitsschädlich, R22, S233660, enthält Natriumazid (0,1 %) und Thimerosal (0,02 %). 5. Monoklonaler Antikörper BC3: 1 Röhrchen à 100 µl, IgM, Maus (400x). 6. Konjugat: 1 Röhrchen à 50 µl, HRPkonjugiertes AntiMausIgM (Fc) (1000x), enthält Thimerosal (0,02 %). 7. ABTSSubstrat: 1 Fläschchen à 15 ml, gebrauchsfertig. 8. Verdünnungspuffer: 1 Flasche à 42 ml, Tris/Tween (10 x), ph 7,5, enthält Thimerosal (0,02 %). 9. Waschpuffer: 1 Flasche à 42 ml, PBS (20 x), ph 7, Stopplösung: 1 Fläschchen à 15 ml, 2,5 % Natriumfluorid (NaF), gebrauchsfertig. 700VPD/

6 1. LAGERUNG UND HALTBARKEIT MATERIAL/REAGENZ ZUSTAND LAGERUNG HALTBARKEIT Mikrotiterplatte geöffnet C 4 Wochen im Beutel mit Trockenmittel Standards, geöffnet C bis Verfalldatum Kontrollen monoklonaler Antikörper BC3 verdünnt Raumtemperatur 1 Tag(frisch ansetzen!) Konjugat verdünnt Raumtemperatur 1 Tag (frisch ansetzen!) Verdünnungspuffer, Waschpuffer geöffnet, konzentriert C bis Verfalldatum ABTSSubstrat, Stopplösung geöffnet, C 48 Std. verdünnt geöffnet C bis Verfalldatum Die Reagenzien sind nach Ablauf des angegebenen Verfalldatums nicht mehr zu verwenden. 2. ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE REAGENZIEN UND MATERIALIEN 2.1. Aqua ad iniectabilia (H 2 O bidest.) 2.2. Mikroliterpipetten für entsprechende Volumina Glaspipetten Saubere Glas oder Kunststoffgefäße zum Verdünnen von Verdünnungspuffer, Waschpuffer, monoklonalem Antikörper und Konjugat Röhrchen für ggf. notwendige Serumverdünnungen Feuchte Kammer Geeignete Vorrichtung zum Waschen der Mikrotiterplatte (z.b. Multistepper oder ELISAWaschgerät) MikrotiterplattenPhotometer mit Filter für 405 nm VPD/240805

7 3. ANSETZEN DER REAGENZIEN Alle Kitkomponenten müssen vor Testansatz auf Raumtemperatur gebracht werden. Ermitteln Sie die Anzahl der benötigten Mikrotitervertiefungen Mikrotiterplatte Der Aluminiumbeutel muß nach jeder Entnahme zusammen mit dem Trockenmittel wieder fest verschlossen werden. Lagerung und Haltbarkeit der nicht verwendeten Mikrotitervertiefungen s. Tabelle Verdünnungspuffer 1 Teil Verdünnungspuffer (10 x) wird mit 9 Teilen Aqua ad iniectabilia angesetzt (z.b. 20 ml Verdünnungspuffer (10 x) mit 180 ml Aqua ad iniectabilia). Evtl. im Verdünnungspuffer (10 x) vorhandene Kristalle sind vor dem Ansetzen durch Erwärmen (max. 37 C) und/oder Rühren bei RT in Lösung zu bringen Waschpuffer 1 Teil Waschpuffer (20 x) wird mit 19 Teilen Aqua ad iniectabilia angesetzt (z.b. 20 ml Waschpuffer (20 x) mit 380 ml Aqua ad iniectabilia). Evtl. im Waschpuffer (10 x) vorhandene Kristalle sind vor dem Ansetzen durch Erwärmen (max. 37 C) und/oder Rühren bei RT in Lösung zu bringen Monoklonaler Antikörper BC3 Der Antikörper (400 x) wird mit gebrauchsfertigem Verdünnungspuffer vor jedem Ansatz frisch verdünnt (z.b. 25 µl Antikörper (400 x) mit 10 ml Verdünnungspuffer). Der Antikörper ist vor jedem Ansatz frisch zu verdünnen Konjugat Das Konjugat (1000 x) wird kurz vor Gebrauch mit gebrauchsfertigem Verdünnungspuffer angesetzt (z. B. 10 µl Konjugat mit 10 ml Verdünnungspuffer.) Nur bei exakter Einhaltung der Arbeitsvorschrift und bei Verwendung der Testkitspezifischen Reagenzien werden valide und reproduzierbare Ergebnisse erhalten. Die Reagenzien einer Charge sind nicht mit Reagenzien anderer Chargen oder anderer Hersteller zu mischen. 700VPD/

8 4. UNTERSUCHUNGSMATERIAL 4.1. Der Test ist geeignet zur Untersuchung von Serum Eine Vorbehandlung der Seren, wie z.b. Inaktivierung, ist nicht erforderlich, sie sollten jedoch nicht mikrobiell kontaminiert und frei von Humanerythrozyten sein Frische Serumproben können für 24 Stunden bei C gelagert werden. Für eine längere Lagerung müssen die Seren in Aliquots bei 18 C oder darunter eingefroren werden (mindestens 3 Monate haltbar). Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden Die Patientenseren und die Kontrollen werden initial unverdünnt eingesetzt. Bei CASAKonzentrationen > 64 U/ml sind die Seren mit der negativen Kontrolle zu verdünnen (vorzugsweise 1:5) und erneut zu bestimmen. 5.A. ARBEITSVORSCHRIFT 5.1. Ansetzen des Verdünnungspuffers Die Verpackung der Mikrotiterplatte am ZIPVerschluß öffnen und die erforderliche Anzahl Mikrotitervertiefungen entnehmen (s.3.1.). Die Mikrotitervertiefungen sind gebrauchsfertig und müssen nicht vorgewaschen werden Jeweils 75 µl des gebrauchsfertigen Verdünnungspuffers in die Vertiefungen pipettieren Jeweils 25 µl der Standards, Kontrollen bzw. zu untersuchenden Serumproben pro Vertiefung pipettieren. Wir empfehlen Doppelbestimmungen. Empfohlenes Pipettierschema: A B C D E F G H Std. F 2 U/ml Std. E 4 U/ml Std. D 8 U/ml Std. C 16 U/ml Std. B 32 u/ml Std. A 64 U/ml Negative Kontrolle Positive Kontrolle Std. F 2 U/ml Std. E 4 U/ml Std. D 8 U/ml Std. C 16 U/ml Std. B 32 U/ml Std. A 64 U/ml Negative Kontrolle Positive Kontrolle VPD/240805

9 5.5. Die Mikrotitervertiefungen leicht schütteln, abgedeckt 60 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) in einer feuchten Kammer inkubieren Verdünnen des Waschpuffers Verdünnen des monoklonalen Antikörpers BC Nach Inkubation die Mikrotitervertiefungen dreimal mit jeweils 300 µl gebrauchsfertigem Waschpuffer waschen. Der zweite und dritte Waschgang erfolgen jeweils mit 1 2 Minuten Einwirkzeit. Nach Beendigung des Waschvorgangs Mikrotitervertiefungen auf Filterpapier ausklopfen. Nicht austrocknen lassen! Umgehend weiterverwenden! µl des monoklonalen Antikörpers BC3 in jede Vertiefung pipettieren Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubieren Verdünnen des Konjugats Nach Inkubation die Mikrotitervertiefungen erneut waschen (s. 5.8.) µl Konjugat in jede Vertiefung pipettieren Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubieren Nach Inkubation die Mikrotitervertiefungen erneut waschen (s. 5.8.) µl ABTSSubstrat in jede Vertiefung pipettieren. Die Mikrotiterplatte wird leicht geschüttelt Die EnzymSubstratReaktion vollzieht sich innerhalb einer Inkubationszeit von Minuten bei Raumtemperatur. Die Reaktion sollte gestoppt werden, wenn die OD des Standards A einen Wert von ca. 1,6 erreicht hat. Die Reaktionskinetik kann durch Messungen im Verlaufe der EnzymSubstratReaktion verfolgt werden. Vor jeder Messung ist die Mikrotiterplatte zu schütteln! Die enzymatische Reaktion wird nach Minuten mit 100 µl Stopplösung je Vertiefung gestoppt. Die Platte vor dem Messen kurz schütteln Der Testansatz ist innerhalb vom 30 Minuten photometrisch bei einer Wellenlänge von 405 nm auszuwerten. 700VPD/

10 5.B. TABELLE ZUR ARBEITSVORSCHRIFT Negative Positive Standards Kontrolle Kontrolle Verdünnungslösung 75 µl 75 µl 75 µl 75 µl Negative Kontrolle 25 µl Positive Kontrolle 25 µl Standards 25 µl 25 µl 60 min bei RT inkubieren, 3 x mit 300 µl Waschpuffer waschen; zweiter und dritter Waschgang mit 1 2 min Einwirkzeit monoklonaler Antikörper BC3 100 µl 100 µl 100 µl 100µl 30 min bei RT inkubieren, 3 x mit 300 µl Waschpuffer waschen; zweiter und dritter Waschgang mit 1 2 min Einwirkzeit Konjugat 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 30 min bei RT inkubieren, 3 x mit 300 µl Waschpuffer waschen; zweiter und dritter Waschgang mit 1 2 min Einwirkzeit ABTSSubstrat 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl min bei Raumtemperatur inkubieren Stopplösung 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Photometrische Auswertung bei 405 nm 6. TESTBEURTEILUNG (VALIDITÄT) Eine photometrische Auswertung erfolgt bei einer Wellenlänge von 405 nm innerhalb von 30 Minuten nach dem Stoppen der Reaktion. Die Mittelwerte der einzelnen Extinktionen je Standard werden berechnet. Die Doppelbestimmungen sollten nicht mehr als 20 % vom Mittelwert abweichen. Die Extinktionswerte der einzelnen Standards werden gegen die CASAKonzentrationen aufgetragen. Die beste Anpassung der Standardkurve wird in der Regel mittels kubischem Spline erreicht. Es können aber auch Sigmoid und 4 ParameterAuswerteverfahren verwendet werden VPD/240805

11 Die CASAKonzentrationen der Kontrollen und der n werden über die Standardkurve ermittelt. Ggfs. muß bei der Ermittlung der Endkonzentration der Verdünnungsfaktor eines Serums berücksichtigt werden. Die CASAKonzentrationen werden in U/ml angegeben. Chargenspezifische Daten Der Sollwertbereich der positiven Kontrolle ist dem Flaschenetikett zu entnehmen. Sind die oben genannten Sollwertkriterien nicht erfüllt, muss der Test wiederholt werden. Beispiel einer Standardkurve OD UNITS/ml 700VPD/

12 7. LEISTUNGSMERKMALE Die nachfolgenden Leistungsmerkmale wurden im Rahmen der Evaluierung ermittelt. 7.A. NACHWEISGRENZE Die Nachweisgrenze entspricht mit 2 U/ml der Konzentration des niedrigsten Standards. 7.B. INTRAASSAYVARIANZ Die Intraassayvarianz wurde durch Mehrfachbestimmungen von Referenzseren und internen Kontrollseren ermittelt. mittlere U/ml SD VK % 16fachAnalyse 6,7 0,43 6,3 40fachAnalyse 6,5 0,47 7,2 7.C. INTERASSAYVARIANZ Die CASAKonzentrationen von Referenzseren wurden in 28 verschiedenen Ansätzen überprüft. Die Interassayvarianzen liegen bei 10 bis 15 %. 7.D. VERDÜNNUNGSLINEARITÄT UND WIEDERFINDUNG Durch die Zugabe einer definierten CASAKonzentration zur negativen Kontrolle wurde die Verdünnungslinearität bestätigt und eine Wiederfindung von % ermittelt. Verdünnung Ergebnis (U/ml) Wiederfindung (A) A unverdünnt 64,0 100 A + negative 1/2 32,7 102 Kontrolle A + negative 1/4 17,3 108 Kontrolle A + negative Kontrolle 1/8 8, E. NORMBEREICH Der Normbereich für CASA wurde durch die Austestung von 4832 gesunden Frauen unterschiedlicher Altersgruppen ermittelt. Bezogen auf dieses Kollektiv beträgt der Cutoff 4 U/ml bei einer Spezifität von 90 % und 6 U/ml bei einer Spezifität von 95 % VPD/240805

13 CASASpiegel im Serum gesunder Frauen Altersverteilung n 4 U/ml (%) 6 U/ml (%) < > insgesamt Jedes Labor sollte seinen eigenen Referenzbereich erstellen, da CASA Spiegel durch äußere, nicht tumorbedingte Einflüsse beeinflußt werden können. ALLGEMEINE HANDHABUNGSHINWEISE Reagenzienflaschen und deren Verschlüsse nicht vertauschen, um Kreuzkontamination zu vermeiden. Sofort nach Gebrauch die Reagenzflaschen wieder fest verschließen, um Verdunstung und mikrobielle Kontamination zu vermeiden. Nach Gebrauch sind die Reagenzien sofort wieder, entsprechend den vorgeschriebenen Lagerungsbedingungen, zu lagern, um die angegebene Haltbarkeit zu gewährleisten. Um Verwechslungen mit Reagenzien anderer Testsysteme oder Chargen zu vermeiden, sollten alle Komponenten einer Testpackung nach dem Gebrauch zusammen in der Orginalpackung gelagert werden (siehe auch 3.). SICHERHEITSHINWEISE Die Reagenzien humanen Ursprungs wurden auf HBsAg, AntiHIV 1/2 und AntiHCV untersucht und für nicht reaktiv befunden. Dennoch sollten diese Reagenzien wie auch jene, die Bestandteile tierischer Herkunft enthalten (siehe Packungsinhalt), als potentiell infektiös behandelt werden, um das Risiko einer Ansteckung zu vermeiden. R 22: Gesundheitsschädlich beim Verschlucken. S 23: Gas/Aerosol nicht einatmen. S 36: Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung tragen. S 60: Dieses Produkt und sein Behälter sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen. 700VPD/

14 ENTSORGUNGSHINWEISE Die in diesem Produkt enthaltenen Chemikalien und Zubereitungen sowie die bei der Anwendung dieses Produktes anfallenden Reste sind in der Regel Abfälle, die einer ordnungsgemäßen Entsorgung zugeführt werden müssen. Die Entsorgung solcher Abfälle unterliegt den nationalen abfallrechtlichen Gesetzen und Verordnungen. Die zuständige Behörde oder Abfallbeseitigungsunternehmen informieren über die Entsorgung von Sonderabfällen. AUSGABEDATUM: LITERATUR 1. Caffier, H., Oehler, M.K., Kristen, P.: CA 125 versus CASA bei Patientinnen mit benignen Adnextumoren und frühen Ovarialkarzinomen. Anticancer Research 17, 4189, Devine, P.L., et al.: Serum mucin antigens CASA and MSA in tumors of the breast, ovary, lung, pancreas, bladder, colon, and prostate. Cancer 72 (6), , Kristen, P., Dörffler, P., Caffier, H.: Clinical value of CASA versus CA 125 in ovarian cancer in: R. Klapdor (ed.), Current Tumor Diagnosis: Applications, Clinical Relevance, Research, Trends, Cancer of the LungState and Trends in Diagnosis and Therapy. W. Zuckschwerdt Verlag MünchenBonnWienNew York, , Malm, A., et al.: Comparison of the cancerassociated serum antigen (CASA) with CA 125 specificity and sensitivity in benign and malignant disorders. in: R. Klapdor (ed.), Current Tumor Diagnosis: Applications, Clinical Relevance, Research, Trends Cancer of the LungState and Trends in Diagnosis and Therapy. W. Zuckschwerdt Verlag MünchenBonnWienNew York, , VPD/240805

15 5. McGuckin, M.A., et al.: Preoperative discrimination between ovarian carcinoma, nonovarian gynecological malignancy and benign adnexal masses using serum levels of CA 125 and the polymorphic epithelial mucin antigens CASA, OSA and MSA. Int. J. Gynecol. Cancer 2, , McGuckin, M.A., et al.: Circulating tumourassociated mucin concentrations, determined by the CASA assay, in healthy women. Clin. Chim. Acta 214, , McGuckin, M.A., Devine, P.L.: The mucin marker, CASA, in ovarian cancer. Tumordiagn. u. Ther. 16, 1 6, Meisel, M., et al.: A study of serum CASA and CA 125 levels in patients with ovarian carcinoma. Arch. Gynecol. Obstet. 256, 9 15, Sabzehchian, A., et al.: CA 125 and CASA as markers for ovarian tumors. Anticancer Research 17, , Sturm, G., et al.: Evaluation of cancer associated serum antigen (CASA) as an additional tumor marker in ovarian cancer. in: R. Klapdor (ed.), Current Tumor Diagnosis: Applications, Clinical Relevance, Research, Trends Cancer of the LungState and Trends in Diagnosis and Therapy. W. Zuckschwerdt Verlag MünchenBonn WienNew York, , Ward, B.G., et al.: Expression of tumor markers CA 125, CASA and OSA in minimal/ mild endometriosis. Aust. NZ. J. Obstet. Gynecol. 31, , Ward, B.G., et al.: The management of ovarian carcinoma is improved by the use of cancer associated serum antigen (CASA) and CA 125 assays. Cancer 72 (2), , Ward, B.G.: Tumor markers in ovarian cancer: The current state of clinical use. Klin. Lab. 40, , VPD/

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