BIO-X PARAINFLUENZA 3 ELISA KIT

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1 BIO-X PARAINFLUENZA 3 ELISA KIT Indirekter Test für Blutseren und Milchproben TESTKIT ZUR SEROLOGISCHEN DIAGNOSE DES PARAINFLUENZA 3 VIRUSES BEIM RIND I - ANWENDUNGSGEBIET Das Parainfluenza 3 (PI3) Virus wurde erstmals 1959 aus Nasentupfern eines Rindes, mit Symptomen des Shipping Fever s, isoliert. Das Virus ist weltweit in der Rinderpopulation verbreitet. Die meisten klinischen Fälle wurden bei Jungtieren als Pneumonie diagnostiziert. Die Infektion mit PI3 kann auch subklinisch verlaufen, so daß Serokonversionen auch bei gesunden Tieren nachgewiesen Erkrankungen in den Wintermonaten (Oktober bis März) sind häufiger als während des übrigen Jahres. Mischinfektionen von PI3 Virus mit BRSV, Adenovirus aber auch BVDV werden häufig beobachtet, bakterielle Sekundärinfektionen komplizieren den Erkrankungsverlauf. Deshalb ist es nicht möglich, aus rein klinischer Sicht eine Diagnose zu stellen. Die Untersuchung von Serumpaaren aus der akuten Phase der Erkrankung und 2-3 Wochen später im ELISA erlaubt eine klare Aussage über eine stattgefundene Infektion mit dem Virus. Bei letalem Verlauf kann das Virus entweder in Kryoschnitten der Lunge durch Immunfluoreszenz oder im PI3 Antigen Elisa nachgewiesen II TESTPRINZIP Mikrotitertestplatten mit je 96 Reaktionsvertiefungen (6 Strips mit je 16 Vertiefungen) wurden mit gereinigtem PI3-Virus beschichtet und zwar die senkrechten Reihen 1, 3, 5, 7, 9 und 11. Die senkrechte Reihen 2, 4, 6, 8, 10 und 12 dagegen wurden mit unspezifischem Antigen beschichtet. Letztere dienen der Erkennung von falsch positiven Resultaten. Die verdünnten Serumproben werden auf der Platte inkubiert. Die Milchproben werden unverdünnt benutzt. Nach einem Waschvorgang wird das Peroxydasekonjugat in die Reaktionsvertiefungen pipettiert. Nach einer zweiten Inkubationszeit und einem zweiten Waschvorgang wird das Substrat (H 2 O 2 ) mit dem Chromogen (Tetramethylbenzidine, TMB) auf die Platte verteilt. TMB ist nicht kanzerogen und reagiert empfindlicher als andere Farbstoffe. Spezifische Antikörper in Blutseren oder Milchproben bleiben am Antigen haften und reagieren ihrerseits mit dem in der zweiten Inkubation zugefügten Protein G-Peroxydase-Konjugat. Die Peroxydase katalisiert die Verwandlung des farblosen Chromogens in ein blaues Endprodukt. Die Farbintensität ist proportional zum Gehalt der Antikörper in der Probe. Von den gemessenen Probenextinktionen wird jeweils der Wert für die optische Dichte der negativen Kontrollen (senkrechte Reihen 2, 4, 6, 8, 10 bzw. 12) subtrahiert. Ein positives Kontrollserum ist im Kit enthalten. Es stammt von einem immunisierten Rind, enthält Antikörper gegenüber dem PI 3-Virus und dient zur Validierung des Kits. Die Reaktivität der unbekannten Seren wird von 0 bis bewertet. III - BESTANDTEILE DER TESTPACKUNG 1

2 - Platten: 2 Mikrotiter Testplatten zu je 96 Vertiefungen, 6 Strips zu je 16 Reaktionsvertiefungen. Die senkrechten Reihen 1, 3, 5, 7, 9 und 11 sind mit dem PI 3-Virus beschichtet wogegen die senkrechten Reihen 2, 4, 6, 8, 10 und 12 mit einem negativen Antigen beschichtet sind. - Waschpuffer: 1 x 100 ml (20 x konzentriert), bei 4 C aufbewahren; - Verdünnungspuffer: 1 x 30 ml (5 x konzentriert und gefärbt), bei 4 C aufbewahren; - Kontrollseren: 1 x 0,5 ml positives Serum vom Rind, gefriergetrocknet und 1 x 0,5 ml negatives Serum vom Rind, gefriergetrocknet. - Peroxidasekonjugat: 1 x 25 ml anti-rinderimmunoglobulin, Protein G Peroxydasekonjugat, gebrauchsfertig, bei 4 C aufbewahren; - Chromogen: 1 x 25 ml TMB (Tetramethylbenzidine) gebrauchsfertig. Bei 4 C aufbewahren; - Stopplösung: 1 x 15 ml, 1 M Phosphorsäure (Vorsicht ätzend!); BIO K 239/2 Mikrotiter Testplatten 2 Waschpuffer 1 X 100 ml (20 X) Verdünnungspuffer 1 X 30 ml (5 X) Konjugat 1 X 25 ml (1 X) positives Serum 1 X 0,5 ml (1 X) freeze-dried negatives Serum 1 X 0,5 ml (1 X) freeze-dried TMB gebrauchsfertig 1 X 25 ml (1 X) Stopplösung 1 X 15 ml (1 X) IV ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL UND GERÄTE Destilliertes Wasser, Messzylinder, Bechergläser, Plastikröhrchen, Röhrchenständer, Pipettenspitzen, Reagenzbehälter für Mehrkanalpipetten, Deckel für Mikrotiterplatten, Abklebefolie für Mikrotiterplatten, Einund Mehrkanalpipetten, Mikrotiterplatten-Spektralphotometer, Mikrotiterplatten-Washer und Mikrotiterplatten- Schüttler (fakultativ). V - HINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN - Dieser Test ist außschließlich für die in-vitro Diagnostik am Rind bestimmt. - Die Reagenzien müssen zwischen 4 und 8 C aufbewahrt - Das unverdünnte Waschpuffer und das unverdünnte Verdünnungspuffer können bei Raumtemperatur aufbewahrt Die verdünnten Puffer können ungefähr 6 Wochen zwischen +4 C und +8 C aufbewahrt - Das Konjugat muß konzentriert bei 4 C aufbewahrt - Sofern man die unbenutzten Riegel mit dem dessicant in einer gutverschlossenen Aluminum Poch aufbewahrt, können sie bis zum Verfalldatum benutzt - Das positive Kontrollserum sowie das negative Kontrollserum müssen nach Auflösung aliquotiert bei -20 C aufbewahrt - Eine Funktionstüchtigkeit der Reagenzien über das Verfalldatum hinaus kann nicht garantiert Das Gleiche gilt auch für Reagenzien die abweichend von dieser Anleitung aufbewahrt oder verwendet wurden. - Keine Reagenzien aus anderen Testpackungen benutzen. - Die Qualität des Wassers, das zur Herstellung der verschiedenen für den Test benötigten Lösungen dient, ist sehr wichtig. Es darf keine oxydative Stoffe (wie z.b. Bleichlauge) und keine Metallsalze enthalten. - Lösungen, die von Bakterien oder Pilzen befallen sind, müssen entfernt - Einige Reagenzien enthalten Merthiolat. Diese Substanz ist giftig beim Einatmen und beim Kontakt mit der Haut. Vorsicht ist geboten. - Die Stopplösung enthält 1M Phosphorsäure (ätzend). Vorsichtig manipulieren. - Die Materialien des Testkits sind nach Gebrauch als infektiös zu betrachten und zu inaktivieren. - Um ein sicheres Resultat zu bekommen, muss man der Gebrauchsanleitung genauestens folgen und zwar vor allem, was die Verdünnungen angeht und auch die Inkubationszeiten und Temperaturen. VI VORBEREITUNG DER REAGENZIEN Waschpuffer: Durch die Lagerung des Waschpuffers bei niedrigen Temperaturen können Kristalle entstehen. Wird lediglich ein Teil der Lösung benötigt, so ist sie auf 21 C +/-3 C zu erwärmen bis die 2

3 Kristalle sich völlig gelöst haben. Nach gründlichem Durchmischen wird das erwünschte Volumen entnommen. Zur Herstellung der gebrauchsfertigen Lösung ist 1 Teil Waschpuffer (20 x) mit 19 Teilen destilliertem oder entionisiertem Wasser zu verdünnen. Die verdünnte Lösung kann bei 4 C aufbewahrt Verdünnungspuffer: Der Verdünnungspuffer muß bei 4 C aufbewahrt Bei Entnahme von Teilmengen ebenfalls vorher gut durchmischen. Zur Herstellung des gebrauchsfertigen Puffers ist 1 Teil (5 x) mit 4 Teilen destilliertem oder entionisiertem Wasser zu verdünnen. Der verdünnte Puffer kann bei 4 C aufbewahrt Ensteht ein Sediment auf dem Boden des Fläschchens, so ist die Lösung zu filtrieren (z.b. Whatman Filterpapier). - Konjugat: Das Konjugat enthält monoklonale Antikörper gegen Rinder-Immunoglobuline (IgG1) und ist mit Meerrettichperoxydase markiert. Das flüssige Konjugat kann bis zu einem Jahr bei 4 C aufbewahrt Zum Gebrauch wird das Konjugat 1/50 im Verdünnungspuffer verdünnt. - Kontrollserum: Das positive Kontrollserum ist gefriergetrocknet. Der Inhalt eines Fläschchens wird in 0,5 ml destilliertem oder entionisiertem Wasser gelöst. Das gelöste Kontrollserum soll aliquotiert und bei minus 20 C aufbewahrt - Entwicklerlösung: Zur Herstellung der Entwicklerlösung mischt man kurz vor Gebrauch, 950 µl Substratlösung mit 50 µl TMB. - Stopplösung: Die Stopplösung ist gebrauchsfertig. VII AUFARBEITUNG DER PROBEN Die zu untersuchenden Serumproben werden im Verhältnis 1:100 in gebrauchsfertigem Verdünnungspuffer verdünnt. Für den Test wird mindestens 0,2ml (besser 1 ml) der verdünnten Serumprobe benötigt. Das positive Kontrollserum wird auf die gleiche Art und Weise verdünnt nachdem das Serum in 0,500 ml desionisiertes Wasser aufgelöst wurde. Die Milchproben werden unverdünnt aufgetragen. VIII TESTDURCHFUERUNG 1- Alle Reagenzien mindestens 30 Minuten vor Beginn auf 21 C +/-3 C bringen. 2- Die benötigten Strips aus der Umhüllung nehmen und in den Rahmen geben. 3- Die nicht benützten Strips werden in der Umhüllung gelagert. 4- Für die Serumproben verteilen Sie je 1 ml verdünnten Verdünnungspuffer in 5- oder 10 ml Röhrchen. Fügen sie 10 Mikroliter der Serumprobe pro Röhrchen hinzu. Jede Serumprobe in ein anderes identifiziertes Röhrchen. Kurz auf einem Shaker durchschütteln. 5- Die Milchproben 20 Minuten lang bei 4000 G zentrifugieren. Eine gläserne Pasteurpipette nehmen um die Flüssigkeit unter der oberen Fettschicht zu entnehmen. Die unteren Zellenschicht nicht berühren. 6- Die verdünnten Serumproben zu je 100 µl pro Vertiefung verteilen. Beispiel: Probe 1 in A1 und A2, Probe 2 in B1 und B2, Probe 3 in C1 und C2 usw Das positive verdünnte Kontrollserum zu je 100 µl pro Vertiefung folgendermaßen auf die Platte auftragen: zum Beispiel H1 und H2. Das negative Kontrollserum zu je 100 µl pro Vertiefung folgendermaßen auf die Platte auftragen: zum Beispiel G1 und G2. 5- Für das Screening von Serumpaaren zur Feststellung einer Serokonversion werden die Platten eine Stunde bei 21 C +/-3 C inkubiert. Für eine Anwendung als Positiv/Negativ-Test erreicht man eine höhere Sensitivität durch Inkubation bei 37 C oder noch besser- auf einem Plattenschüttler bei 21 C +/-3 C. Dabei kann die Extinktion stark positiver Seren Werte von 2,0 (Meßgrenze bei einigen Readern) übersteigen. 6- Waschvorgang: die Platte mit einer schnellen Handbewegung über einem großen Behälter, der später desinfiziert wird, entleeren. Testvertiefungen in einen Behälter mit der Waschlösung eintauchen oder eine automatische Waschvorrichtung benutzen. Der Waschvorgang wird 3 mal wiederholt. 7- Platte auf saugender Unterlage ausklopfen. 8- Das Konjugat wird unverdünnt zu je 100 µl pro benutzte Vertiefung verteilen. 9- Eine Stunde bei 21 C +/-3 C, 37 C oder auf einem Plattenschüttler inkubieren (in Abhängigkeit vom unter Pkt. 5 gewählten Verfahren). 10- Platte waschen wie unter 6. und 7.beschrieben. 11- Gebrauchsfertige Entwicklerlösung möglichst rasch 100 µl pro Vertiefung verteilen. Die Entwicklerlösung darf vor Gebrauch keine Blaufärbung aufweisen Minuten bei 21 C +/-3 C lichtgeschützt einwirken lassen. Diese Inkubationszeit kann, wenn nötig, verkürzt oder verlängert 3

4 13-50 µl Stopplösung pro Vertiefung einpipettieren und die Platte unmittelbar danach mit einem Plattenphotometer (ELISA-Reader) bei einer Wellenlänge von 450 nm messen. Das Chromogen kann manchmal in den Vertiefungen kristallisieren und sedimentieren (z.b. bei einem sehr hohen O.D. Wert IX AUSWERTUNG DER RESULTATE Für jede Probe, muß die Differenz der Extinktionen ( Delta optische Dichte) zwischen Versuchswert und negativem Kontrollwert berechnet Dazu wird von jedem O.D. Wert der senkrechten ungeraden Reihe der entsprechende O.D. Wert der geraden senkrechten Reihe subtrahiert. Negative Werte müssen berücksichtigt Das Gleiche geschieht mit dem positiven Kontrollserum. Der Test ist valide, wenn das positive Kontrollserum, für jedes Antigen eine Extinktionsdifferenz hat, die nach 10 Minuten mit der Entwicklerlösung mindestens so hoch ist, wie die, auf dem beigefügten Chargenprotokoll. Teilen Sie die Probenwerte durch den Wert der positiven Probe und multiplizieren dann diesen Wert mit 100. Sie bekommen so einen Prozentsatz. Bestimmen Sie die Reaktivität des Serums indem Sie die erste Tabelle der mitgelieferten «Quality Control» (Chargenprüfung) benutzen. Die Probe ist als positiv zu bewerten, wenn das Resultat höher oder gleich + ist. Der Nachweis einer deutlichen Serokonversion in, im Abstand von 2-3 Wochen entnommenen Serumpaaren, erlaubt eine klare Aussage. Eine deutliche Serokonversion liegt bei einem Unterschied in der Bewertung von mindestens zwei Kreuzen (z.b > ++++ oder + --->+++) vor. Val = Delta OD Sample * 100 Delta OD positive VIII ORDERING INFORMATION BIO-X PI3 ELISA KIT: 2x48 tests BIO K 239/2 4

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