Mikroskopie. durchgeführt am von Matthias Dräger und Alexander Narweleit

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1 Mikroskopie durchgeführt am von Matthias Dräger und Alexander Narweleit PHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN Physikalische Grundlagen. Einleitung Ein klassisches optisches ild ist eine Projektion eines Gegenstandes auf eine Ebene durch ein optisches System. Diese gibt die Geometrie sowie die farblichen Eigenschaften des Gegenstandes wieder. Das menschliche Auge kann Strukturen erkennen, die größer als ca. 0,02mm sind. Um kleinere Strukturen erkennen zu können, wird ein Instrument benötigt, welches eine Vergrößerung auf der Retina des Auges abbildet (z.. Lupe oder Mikroskop)..2 Optische Systeme Strahlen, die parallel zur optischen Achse verlaufen, werden so gebrochen, dass sie auf der anderen Seite durch den rennpunkt verlaufen (alle Parallelstrahlen schneiden sich hinter der Linse in deren rennpunkt). Letztere Strahlen nennt man rennstrahlen. Umgekehrt werden rennstrahlen derart gebrochen, dass sie zu Parallelstrahlen werden. Mittelpunktstrahlen gehen durch den Linsenmittelpunkt ungebrochen hindurch. Daher entsteht eine Invertierung des ildes auf der Ebene. Dies gilt allerdings nur für dünne Linsen, bei dicken treten Abweichungen auf. Abbildung : Schematische Darstellung von Strahlengängen In der folgenden Abbildung sind die rennweite f, Gegenstandsweite g (oder s) und die ildweite b dargestellt: Abbildung 2: Darstellung von f, s und b Quelle:

2 .2 Optische Systeme PHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN Anhand Abbildung 2 und den Strahlensätzen wollen wir die folgende Gleichung für das Abbildungsverhalten herleiten. Als erstes wenden wir die Strahlensätze auf den rennpunktstrahl auf der linken Seite der Linse an: Analog gilt dies auch für die rechte Seite: G = g f f () G = f b f Wir wenden nun den Strahlensatz auf den Mittelpunktstrahl an und erhalten: G = g b (2) (3) Wir sehen, dass die linken Terme der Gleichungen (), (2) und (3) gleich sind, somit müssen auch die rechten Terme dieser Gleichungen gleich sein. Wir setzen nun Gleichung () mit (3) gleich: g f = g f b f = g b (g f) f = g b g b f f = g ( ) f b g f b g = ( ) b g f b g = b ( g f ) g f = g b g f = g b + f = b + g (4) Für die Gegenstandsweite g wird auch häufig s verwendet. Die Gleichung für das Abbildungsverhalten lautet also: f = b + s Für ein scharfes ild muss die rennweite so angepasst werden, dass die oben genannte Gleichung erfüllt ist. Die minimale Entfernung, die zu einer Abbildung führt, liegt bei 5cm vom Auge. Die deutliche Sehweite ist s 0 25cm. Die Vergrößerung G, also das Verhälnis der ild- und Gegenstandsgröße ist gleich dem Verhälnis der ildweite zur Gegenstandsweite: G = b g Da man die ildgröße auf der Retina nicht bestimmen kann, verwendet man die Sehwinkel für die erechnung. Dies sind die Winkel, unter denen die Endstrahlen des Gegenstandes durch den Mittelpunkt der Augenlinse verlaufen. (5) (6) 2

3 .2 Optische Systeme PHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN Abbildung 3: Definition der Vergrößerung aus dem etrachtungswinkel Quelle: ɛ 0 ist der Sehwinkel, unter dem man einen Gegenstand G ohne optische Hilfsmittel sieht. Dieser Winkel hängt vom Abstand zwischen Auge und Gegenstand ab; je näher der Gegenstand, umso größer der Sehwinkel. S = 25cm. ɛ ist der Sehwinkel, unter dem der Gegenstand im optischen Instrument erscheint. Je größer der Sehwinkel ɛ, desto größer sieht das Auge den Gegenstand. Sehwinkel : Γ = tan ɛ tan ɛ 0 (7) Eine Lupe ist nun eine Sammellinse, die so zwischen Auge und Gegenstand gehalten wird, dass innerhalb der rennweite f der Sammellinse liegt. Γ Lupe = s 0 f Man sieht, dass die Vergrößerung bei einer Lupe nur von der rennweite der Lupenlinse abhängt. Wird die rennweite kleiner als cm, werden die oben genannten Abbildungsfehler zu groß. Daher liegt die maximal ausnutzbare Lupenvergrößerung bei etwa 25. (8) Abbildung 4: Entspanntes Auge in deutlicher Sehweite Abbildung 5: etrachtung mit Lupe, Auge in deutlicher Sehweite Das Mikroskop besteht im Prinzip aus zwei Sammellinsen, einer Projektionslinse und einer Lupe. Das Objekt befindet sich zwischen einfacher und doppelter rennweite des Objektivs, so dass an einer festliegenden Stelle im Tubus des Mikroskops ein reelles, umgekehrtes, vergrößertes Zwischenbild des 3

4 .2 Optische Systeme PHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN Objekts entsteht. Das Zwischenbild wird mit der zweiten Sammellinse als Okular betrachtet, das als Lupe dient. Das ild wird scharf gestellt, indem durch Heben oder Senken des Tubus die Gegenstandsweite s zwischen Objekt und Objektiv verändert wird. Die Größen f und b sind dabei durch Objektiv bzw. Tubuslänge fest vorgegeben. Die Gesamtvergrößerung des Mikroskops ist das Produkt von Objektivund Okularvergrößerung: Γ gesamt = Γ Objektiv Γ Okular (9) Wenn sich die etrachtung nun um Objekte dreht, deren Größe mit der Wellenlänge vergleichbar ist, so können eugung und Interferenz nicht mehr vernachlässigt werden. Es verhält sich wie bei monochromatischem Licht, welches durch einen Spalt strahlt, dessen reite mit einer Wellenlänge vergleichbar ist. Durch eine Linse werden die verschiedenen eugungsordnungen wieder gesammelt, Abbildung 6: eugungsfigur einer Lochblende durch die folgende Interferenz kommt die Lichtverteilung im ild zustande. Wenn α der Winkel zwischen dem zentralen Lichtstreifen I 0 und dem Randstrahl durch das Objektiv ist und λ die Vakuumwellenlänge des Lichts, so gilt für den kleinsten noch auflösbaren Abstand: d = λ 0 sin α Um kleine Objekte erkennen zu können, wird weiterhin eine Immersionsflüssigkeit zwischen Objekt und Objektiv eingesetzt, um so die Wellenlänge um den rechungsindex n der Flüssigkeit zu verringern. ei einer Immersionsflüssigkeit mit dem Index n gilt also: d = λ 0 n sin α = λ 0 N Hierbei stellt der Nenner die numerische Aspersion N = n sin α dar. N ist auf den Objektiven angegeben. Diese sind für bestimmte Medien konzipiert, daher kann es bei schlechter Wahl der Immersionsflüssigkeit zu ildfehlern kommen. Wenn man diese Apertur vergrößert oder die Wellenlänge verkleinert, so steigt das Auflösungsvermögen: (0) () A = d (2) 4

5 .2 Optische Systeme PHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN Abbildung 7: Strahlengang nach Durchgang durch einen einfachen Spalt Die Vergrößerung sollte zwischen 500 und 000 N liegen, da die Abbildung sonst zu klein ist (< 500N) oder es zu Unschärfeeffekten kommt (> 000N). Strukturen bleiben im ild nur dann getrennt, wenn ihre eugungsscheibchen klein genug sind und nicht miteinander verschmelzen. d a λ (3) d a λ a α (4) Der Linsendurchmesser lässt sich durch den Öffnungswinkel ɛ ausdrücken: Abbildung 8: Zum beugungsbedingt kleinsten auflösbaren Punktabstand tan ɛ = 2 a a = 2 tan ɛ Für kleine Winkel ɛ 30 kann der Tangens näherungsweise durch Sinus ersetzt werden, wodurch wir für den kleinsten auflösbaren Punkabstand folgende Gleichung erhalten: d = 2 λ sin ɛ Somit haben wir nun eine sinnvolle Grenze für die Vergrößerung gegeben, die vom Punktabstand d abhängt und auch auf den Grenzwinkel des Auflösungsvermögens des Auges in deutlicher Sehweite ( 00 Grad) ezug nimmt: Γ grenz = tan (8) 00 d 250mm (5) (6) (7) 5

6 3 VERSUCHSAUFAU Abbildung 9: Strahlengang durch ein Mikroskop 2 Aufgaben. (Mikroskopischer Strahlengang): Aufbau eines einfachen Mikroskops aus einer Objektivlinse und einer Okularlinse auf einer optischen ank. Experimentelle estimmung der Vergrößerung für drei verschiedene Tubuslängen (t = 00 mm, 50 mm und 200 mm) und Vergleich der Ergebnisse mit den theoretisch erwarteten Werten. 2. (Okularmikrometer): Einsetzen einer Skala in die Zwischenbildebene des Mikroskops als Okularmikrometer (Messokular). Kalibrierung des Messokulars und estimmung des Linienabstandes eines Kreuzgitters (Gitterkonstante). 3. (Auflösungsgrenze): eobachtung der Auflösungsgrenze des Mikroskops an dem Kreuzgitter und estimmung der numerischen Apertur des Objektivs für diesen Grenzfall. erechnung des damit auflösbaren kleinsten Punktabstandes nach der Abbeschen eugungstheorie und Vergleich mit der tatsächlichen Gitterkonstanten. 4. (Rechenaufgabe Grenzvergrößerung): Angabe des kleinsten auflösbaren Punktabstandes für stärkste optische Mikroskope (Apertur A =,4 mit Immersionsmittel) und der dadurch gegebenen Grenze einer sinnvollen Vergrößerung (förderliche Vergrößerung). 3 Versuchsaufbau Abbildung 0: Versuchsaufbau zur Aufgabe ; s 25cm, s 2 5cm 6

7 5 VERSUCHSDURCHFÜHRUNG 4 Geräte und Materialien Für den Versuch verwendeten wir folgende Geräte: Okularlinse mit rennweite f ok = (40 ± )mm Objektivlinse mit rennweite f obj = (50 ± )mm lendenscheibe zum Abblenden des Objektivs, Millimeterskala auf Glasträger ( 00-mm-Teilung Okularmikrometer) halbdurchlässige Glasplatte zum Einspiegeln einer Vergleichsskala ein Kreuzgitter zwei beleuchtete Skalen (mm-teilung) 5 Versuchsdurchführung 5. Aufgabe Im ersten Versuch haben wir ein einfaches Mikroskop aus der gegebenen Okular- und der Objektivlinse gebaut (siehe Abbildung 0). Im folgenden ist der Abstand d als Summe von der Tubuslänge t und den beiden rennweiten f ok = (40 ± )mm und f obj = (50 ± )mm definiert: d = t + f ok + f obj (9) In der folgenden Tabelle bedeutet die Vergörßerung :n, dass Abstand zwischen zwei Strichen auf der Vergleichsskala genau n Abständen von Strichen auf der Skala entsprich: t in mm d in mm Vergrößerung :n 00 ± 0 90 ± 2 0 ± 2 50 ± ± 2 5 ± ± ± 2 22 ± 2 Tabelle : Vergrößerung bei verschiedenen Tubuslängen Ich lege einen Fehler für die Tubuslänge mit 0mm fest, da ich den Eindruck hatte, dass mein Partner schielte... Die Fehler der Linsen mit jeweils mm wurden auf die 0mm hinzuaddiert. 5.2 Aufgabe 2 In diesem Versuch haben wir eine Skala in die Zwischenbildebene eingesetzt und anschließend ein Kreuzgitter, von dem wir die Drahstärke s und den Drahtabstand d bestimmt haben. Wir räumen hierbei einen Ablesefehler von Skt ein: Die Skalierung des Okularmikrometers beträgt: s = (2 ± )Skt d = (7 ± )Skt Skalierung = Skt : (7 ±, 2)Skt Dieser Wert bedeutet, dass 7 Skalenteile im Okularmikrometer Skalenteil in der Objektskala sind. Desweiteren ist das Verhältnis von Objektskala zur Vergleichsskala bei einer Tubuslänge von 300mm: Skt : (33 ± 6)mm also Skt. auf der Objektskala ist ca. 33mm auf der Vergleichsskala lang. 7

8 5.3 Aufgabe 3 6 AUSWERTUNG 5.3 Aufgabe 3 Wir haben nun eine lende mit verschiedenen Durchmessern zwischen Gitter und Objektiv gestellt. Anschließend haben wir den lendendurchmesser solange verkleinert, bis das Gitter nicht mehr zu sehen war. is zu einem lendendurchmesser von 0,6mm war das Gitter erkennbar. 6 Auswertung 6. Aufgabe Zuerst ermitteln wir die theoretischen Werte für die gegebenen Tubuslängen t von 00, 50 und 200mm. Die deutliche Sehweite s 0 ist dabei 250mm. Wir benutzen (9): Fehlerrechnung: Γ gesamt = Γ Objektiv Γ Okular Γ gesamt = t s 0 f obj Γ gesamt = f ok t 50mm 250mm 40mm = t 8 δγ gesamt = δt + δf obj + δs 0 + δf ok ( t Γ gesamt = t + f obj + s 0 + f ok f obj s 0 f ok ( t Γ gesamt = t ) 40 ( t Γ gesamt = t + 9 ) t ) t t f obj Die Ergebnisse mit einer signifikanten Stelle sind in der folgenden Tabelle aufgelistet: Wir sehen, t in mm Γ theoretisch Γ eobachtung 00 ± 0 3 ± 2 0 ± 2 50 ± 0 9 ± 3 5 ± ± 0 25 ± 3 22 ± 2 s 0 f ok Tabelle 2: Vergleich: Theoretische und beobachtete Vergrößerung dass sich unsere Messwerte zwar von den theoretischen unterscheiden, allerdings sind sie allesamt im einfachen bis zweifachen Fehlerintervall angesiedelt und sind daher noch verträglich. 6.2 Aufgabe 2 Aus der Durchfführung sind uns folgende Werte für die Drahtstärke s und dem Drahtabstand d bekannt: s = (2 ± )Skt d = (7 ± )Skt Außerdem sind (7 ±, 2)Skt von der Mikrometerskala ungefähr Skt. von der Objektskala und Skt. von der Objektskala wiederum (33 ± 6)mm von der Vergleichsskala, dessen Einheit in Millimetern 8

9 6.3 Aufgabe 3 6 AUSWERTUNG angegeben wurde. Wir führen für die Verhältnisse die Variable X ein: ( X µ Obj = 7 ± ), 2 Skt X Obj Verg = (33 ± 6)mm Wir berechnen nun für die Drahtstärke s und dem Drahtabstand d die tatsächliche Größe in Millimetern. Dabei teilen wir erst durch 7, um auf die Einheit der Objektskala zu kommen und multiplizieren anschließend mit 33 um zur Einheit Millimeter zu gelangen: s inmm = s X µ Obj X Obj Verg s inmm = 2Skt 33mm 9, 4mm 7Skt Fehlerrechnung: δs inmm = δs + δx µ Obj + δx Obj Verg ( s s inmm = s + X µ Obj + X Obj Verg X µ Obj X Obj Verg ( Skt s inmm = 7Skt + 7Skt, 2Skt + 6mm 33mm ) s inmm ) 2Skt 33mm 58mm 7Skt Wir sehen das der Fehler von 58mm den Messwert von 9mm weit überschreitet. Dies liegt daran, dass wir zu viele Fehler mit eingeschlossen haben. In der folgenden Fehlerrechnung berechnen wir den Fehler von,2 Skt. direkt mit den Verhälnismäßigkeiten in mm um: s inmm = Skt 33mm 4, 7mm 7Skt Dieser Wert macht mehr Sinn als Ergebnis der ausführlichen Fehlerrechnung. Wir erhalten also für die Drahtstärke das Ergebnis: s = (9 ± 5)mm. Wir gehen nun analog für die erechnung des Drahtabstandes vor: d inmm = d X µ Obj X Obj Verg d inmm = 7Skt 33mm = 33, 0mm 7Skt Der Fehler sieht wie folgt aus: d inmm = Skt 33mm 4, 7mm 7Skt Für den Drahtabstand erhalten wir: d = (33 ± 5)mm. 6.3 Aufgabe 3 Wie in der Durchführung angegeben, ist das Gitter bis zu einem lendendurchmesser von 0,6mm erkennbar. Wir haben folgende Werte gegeben: = 0, 6mm λ = 550nm f obj = a = (50 ± )mm 9

10 6.4 Aufgabe 4 6 AUSWERTUNG Zunächst berechnen wir den Sehwinkel ɛ: tan ɛ = 2 a ɛ = arctan 0, 6mm = arctan 34, 38 2 a 00mm Fehlerrechnung: ( ) δɛ = arctan 2 a + δa arctan 2 a ( ɛ = arctan 2 a + a ) arctan a 2 a arctan 2 a ( ɛ = 0, 6mm arctan 00mm + mm ) 0, 6mm arctan 0, 6mm 50mm 00mm arctan, 4 00mm Für erhalten als Ergebnis: ɛ = (34 ± 2) Wir berechnen nun die Apertur N mit n für Luft und folgender Formel: Fehlerrechnung: δn = δ sin ɛ N = n sin ɛ = sin 34 0, 559 N = sin ɛ + ɛ sin ɛ n sin 34 Für die Apertur erhalten wir: N = (0, 56 ± 0, 02) Nach Abbe gilt: N = sin ( ) sin 34 sin 34 0, 06 Fehlerrechnung: d = λ sin ɛ d = 500nm sin nm δd = δλ + δ sin ɛ = δ sin ɛ λ d = sin ɛ + ɛ sin ɛ sin ɛ d = sin ( ) sin nm sin 34 26nm Nach der Abbeschen eugungstheorie ist der Punktabstand d = (894 ± 26)nm. 6.4 Aufgabe 4 In dieser Aufgabe soll der kleinste auflösbare Punktabstand bei einer Apertur N von,4 mit Immersionsmittel und die Grenzvergrößerung berechnet werden. Den Wert von λ haben wir dem Abschnitt Grenzvergrößerung aus dem Physik-Skript entnommen. Wir haben folgende Werte gegeben: N =, 4 λ = 550nm 0

11 Wir berechnen nun den kleinsten auflösbaren Punktabstand mit (7): d min = λ 0 N = 500nm, 4 392, 86nm 7 ZUSAMMENFASSUNG UND DISKUSSION Mit dieser Größe kann nun mit (4) die Grenzvergrößerung berechnet werden: Γ grenz = tan 00 d 250mm = tan , mm 250mm, 08 7 Zusammenfassung und Diskussion In Aufgabe ging es um die Veränderung der Vergrößerung bei variierender Tubuslänge. Wir können feststellen, dass die Vergrößerung linear zur Tubuslänge wächst (sowohl bei den theoretisch errechneten Werten als auch bei unseren eobachtungen). Die Abweichungen liegen im ein- bis zweifachen Fehlerintervall und sind daher noch verträglich. Die Diskrepanzen zu den theoretischen Werten lassen sich dadurch erklären, dass der nötige Abstand der Vergleichsskala von 250mm nicht unbedingt gewährleistet war, da wir mehrfach nachjustieren und nur mit einem Lineal abmessen konnten. Hinzu kommt, dass auch die Entfernung unserer Augen sich stets veränderte, wenn wir uns abwechselten, um den jeweils anderen beobachten zu lassen. Aufgabe 2 beinhaltete die estimmung von Drahtstärke s und Drahtabstand d eines Gitters. Wir berechneten über die Objekt- und Vergleichsskala die gemessenen Werte in Millimeter um und erhielten: s = (9 ± 5)mm d = (33 ± 5)mm Diese ermittelten wir, indem wir das Verhältnis von Okularmikrometer zu Objektskala und von Objektskala zur Vergleichsskala bestimmten. Dies dürfte aufgrund der oben beschriebenen Justierung der Vergleichsskala recht fehlerträchtig gewesen sein, weswegen wir mehrfach das Verhältnis überprüft haben. Wir hoffen dadurch den Gesamtfehler minimiert zu haben. Für Aufgabe 3 bestimmten wir die Auflösungsgrenze des Mikroskops. Diese war bei einem lendendurchmesser von 0,6mm erreicht. Daraus ergaben sich die Apertur N = (0, 56±0, 02) und der minimal auflösbare Punktabstand d = (894 ± 26)nm. Aufgabe 4 war lediglich eine Rechnung, in der wir anhand einer gegebenen Apertur den kleinsten auflösbaren Punktabstand sowie die Grenzvergrößerung angeben sollten. Wir kamen auf: d min 393nm Γ grenz