RealLine Candida albicans Str-Format

Transkript

1 Instructions for use / Gebrauchsinformation ASSAY KIT FOR THE QUALITATIVE DETECTION OF CANDIDA ALBICANS DNA BY REAL- TIME PCR METHOD KIT FÜR DEN QUALITATIVEN NACHWEIS VON CANDIDA ALBICANS DNA DURCH REAL- TIME PCR In vitro diagnosticum / In-vitro Diagnostikum Str Format VBD rcs gültig ab / valid from: February 2013 / Februar 2013 Rev Page/Seite 1 of/von 16

2 Explanation of symbols used in labeling / Erläuterungen der Symbole auf den Etiketten English German IVD For in vitro diagnostic use In vitro Diagnostikum LOT Batch code Lot-Nummer REF Catalogue number Katalog-Nummer Use by Verwendbar bis Temperature limitation Consult instructions for use Keep out of sunlight Lagertemperatur Gebrauchsinformation beachten vor Sonneneinstrahlung schützen BIORON Diagnostics GmbH Rheinhorststr Ludwigshafen (Germany) Phone Fax: info@bioron.de Legals: Limited Product Warranty: This warranty limits our liability for the replacement of this product. No warranties of any kind, express or implied, including, without limitation, implied warranties of merchantability or fitness for a particular purpose, are provided. BIORON Diagnostics GmbH shall have no liability for any direct, indirect, consequential, or incidental damages arising out of the use, the results of use, or the inability to use this product. Trademarks: FAM, HEX, JOE and ROX are trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US and certain other countries. iq and CFX are trademarks of Bio-Rad Laboratories, Inc. Rotor-Gene is a registered trademark of Qiagen Group, Germany. Page/Seite 2 of/von 16

3 Table of content / Inhaltsverzeichnis: ENGLISH 1. INTRODUCTION 4 2. KIT CONTENTS 5 3. PRINCIPLE OF THE METHOD 5 4. SPECIFICATIONS 5 5. WARNING AND PRECAUTIONS 6 6. ADDITIONAL MATERIALS AND DEVICES REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 7 7. PREPARATION OF THE ANALYSED SAMPLES AND REAGENTS 7 8. PROCEDURE 8 9. DATA ANALYSIS AND INTERPRETATION STORAGE AND TRANSPORTATION 9 DEUTSCH 1. EINLEITUNG INHALT DES KITS PRINZIP DER METHODE SPEZIFITÄT WARNHINWEISE UND SICHERHEITMAßNAHMEN ZUSÄTZLICHE BENÖTIGTE MATERIALIEN UND GERÄTE VORBEREITUNG DER ZU ANALYSIERENDEN PROBEN UND REAGENZIEN DURCHFÜHRUNG DATENANALYSE UND INTERPRETATION LAGERUNG UND TRANSPORT 16 Page/Seite 3 of/von 16

4 ASSAY KIT FOR THE QUALITATIVE DETECTION OF CANDIDA ALBICANS DNA BY REAL- TIME PCR In vitro diagnosticum 1. INTRODUCTION Clinical Information: Candida albicans - a yeast- trigger diseases under certain conditions. About 30% of people are colonized (mucous membranes of the mouth, throat, digestive tract and genital area). Systemic fungal infections (fungemias) including those by C. albicans have emerged as important causes of morbidity and mortality in immunocompromised patients (e.g., AIDS, cancer chemotherapy, organ or bone marrow transplantation). Biofilms with C. albicans can be formed on the surface of implantable medical devices. In addition, hospital-acquired infections by C. albicans have become a cause of major health concerns. The (Str-format) assay kit is designed to detect Candida albicans DNA isolated from clinical specimens using one of the following extraction kits: RealLine DNA-Express (REF VBC8899) RealLine DNA-Extraction 2 (REF VBC8897) RealLine DNA-Extraction 3 (REF VBC8889) RealLine Extraction 100 (REF VBC8896) RealLine (Str-format) kit is designed for the analysis of clinical materials such as scrapings of the epithelial cells, semen, prostatic fluid, urine. The assay is based on the real-time polymerase chain reaction (PCR) method with fluorescent detection of the amplified product. (Str-format) kit is designed for the analysis of clinical materials: scrapings of the epithelial cells, semen, prostatic fluid, and urine. The Kit contains 96 tubes (0.2ml) in strips with lyophilized Mastermix. 50µl of extracted DNA have to be pipetted into the tube and the ready mastermix is diluted. The kit contains reagents required for 96 tests, including control samples and the positive control sample. The kit is validated for use with: iq 5 icycler (Bio-Rad, USA) The kit is compatible with real-time PCR systems such as iq icycler, CFX 96 (Bio-Rad, USA) and DT-96 (DNA-Technology, Russia). The use of:! Extraction Kits for nucleic acids from clinical specimen from other supplier! other real-time PCR devices! appropriate reaction volumes, other than 50µl have to be validated in the lab by the user. The special notes regarding the internal control IC have to be strongly followed. Page/Seite 4 of/von 16

5 2. KIT CONTENTS Universal Positive Control sample (PC) 1 vial, 1 ml; RealLine Pathogen Diagnostic Kits Ready Master Mix (RMM), lyophilized 96 test-tubes (12 strips x 8 tubes); The kit is additionally supplied with optical-transparent PCR-film or hinged caps. 3. PRINCIPLE OF THE METHOD The Real time PCR is based on the detection of the fluorescence, produced by a reporter molecule, which increases as the reaction proceeds. Reporter molecule is dual-labeled DNAprobe, which specifically binds to the target region of pathogen DNA. Fluorescent signal increases due to the fluorescent dye and quencher separating by Taq DNA-polymerase exonuclease activity during amplification. PCR process consists of repeated cycles: temperature denaturation of DNA, primer annealing and complementary chain synthesis. Threshold cycle value Ct is the cycle number at which the fluorescence generated within a reaction crosses the fluorescence threshold, a fluorescent signal rises significantly above the background fluorescence. Ct depends on initial quantity of pathogen DNA template. The use of Internal Control (IC) prevents generation of false negative results associated with possible loss of DNA template during specimen preparation. IC indicates if PCR inhibitors occur in the reaction mixture. IC template should be added in each single sample (including control samples) prior to DNA extraction procedure. The amplification and detection of IC does not influence the sensitivity or specificity of the target DNA PCR. Note: IC is a component of the NA extraction kits of RealLine series. Internal Control is added to the sample during NA isolation step and is used throughout the whole process of NA extraction, amplification, detection. 4. SPECIFICATIONS I. Sensitivity: Sensitivity control was performed on 5 samples containing 100 Candida albicans DNA copies per sample, prepared from SRS (Standard Reference Sample containing Candida albicans DNA), reg. No The sensitivity equals 100%. II. Specificity: Specificity of Candida albicans DNA detection was determined using negative DNA-extracts of the Standard Reference Panel (Reg. No ), consisting of samples containing IC DNA and not containing DNA of STD agents. Specificity of Candida albicans DNA detection equals 100%. III. Diagnostic evaluation: Diagnostic evaluation was performed on 50 clinical samples: 20 samples (No. 1-20), negative samples; 20 samples (No.21-40), positive samples containing Candida albicans DNA; 10 samples (No ), obtained from individuals infected with Trichomonas vaginalis. Page/Seite 5 of/von 16

6 Determination of sensitivity was performed on 20 clinical samples obtained from the clinical material containing Candida albicans with a CE-marked reference kit for the detection of Candida albicans. " (Str-format) kit determined all 20 samples as positive. Analysis by the reference kit proved all 20 samples containing Candida albicans to be positive. Diagnostic sensitivity equals 100%. Determination of specificity was performed on 20 samples obtained from donors and 10 samples obtained from individuals infected with Trichomonas vaginalis, with the CE-marked reference kit. When studying clinical samples obtained from healthy donors by ", negative results were recorded for all 20 samples. Analysis of similar samples by the reference kit confirms the results obtained in all cases. Studying clinical samples obtained from individuals infected with Trichomonas vaginalis using " (Str-format), negative results were recorded for all 10 samples. Analysis of similar samples by reference kit confirms the results obtained in all cases. Thus, " (Str-format) and the CE-marked reference kit show a 100% agreement in results. Specificity equals 100%. 5. WARNING AND PRECAUTIONS For in vitro use only. The kits must be used by skilled personnel only. When handling the kit, follow the national safety requirements for working with pathogens. To prevent contamination, the stages of DNA isolation and PCR test run must be spatially separated. Avoid microbial and nuclease contamination of reagents when removing aliquots from reagent vials. Wear protective disposable gloves, laboratory coats and eye protection when handling specimens and kit reagents. Every workplace must be provided with its own set of variable-volume pipettes, necessary auxiliary materials and equipment. It is prohibited to relocate them to other workplaces. The use of sterile disposable pipette tips is recommended. Never use the same tips for different samples. Do not pool reagents from different lots or from different vials of the same lot. Dispose unused reagents and waste in accordance with country, federal, state and local regulations. Do not use the kit after the expiration date. Page/Seite 6 of/von 16

7 6. ADDITIONAL MATERIALS AND DEVICES REQUIRED BUT NOT SUPPLIED real time PCR system, like described in p.1 DNA-Extraction Kit, RealLine DNA-Extraction 3 or see p.1 Extractions Kits with Internal control reagent; Internal Control reagent (VBC8881) and Negative Control Sample or H 2 O (molecular biology grade) if the kit is used with the extraction kits of other supplier; safety laminar cabinet; refrigerator; half-automatic variable-volume single-channel pipettes; disposable medical non-sterile powder-free gloves; disposable pipette tips with aerosol barrier; biohazard waste container. 7. PREPARATION OF THE ANALYSED SAMPLES AND REAGENTS Each group of samples undergoing the procedure of DNA isolation must include a Positive Control sample (PC) from this kit and a Negative Control sample (NC) which is a component of the DNA extraction kit. We strongly recommend the implementation of the Internal Control IC, the Negative Control NC and Positive Control PC samples to the extraction procedure. When using a kit of another supplier for the extraction of nucleic acids as recommended in p1., add 20 µl of IC (VBC8881) to each tube. For the NC use 100µl of the Negative Control Sample or H 2 O (molecular biology grade). For the PC use 70 µl of Negative Control Sample or H 2 O (molecular biology grade) and 30 µl of Positive Control to the tube marked PC Sample preparation Prepare the samples for the assay using RealLine DNA - Express, RealLine DNA - Extraction 2, RealLine DNA Extraction 3 or RealLine Extraction 100 extraction kits according their instruction manuals. If samples of isolated DNA were stored frozen prior the assay, thaw them and keep at least 30 minutes at a temperature of 18 to 25 C. The isolated DNA can be stored at 2 to 8 C for 2 days. After initial opening shelf life of Positive Control sample at 2 to 8 C is 1 month Preparation of the reagents. Prior the test take the kit out of the refrigerator and keep the Ready Master Mix (RMM) closed in the package at C for at least 30 minutes. Then open the package and cut the necessary number of tubes in strips with RMM (including prepared samples and controls) with the knife. The tubes hold together with the covering film. Put the remaining strips immediately back into the foil pouch, squeeze the air out and tightly close with the clip. After initial opening the shelf life of RMM at 2 to 8 C is 3 months. Page/Seite 7 of/von 16

8 8. PROCEDURE 8.1. Label the tubes with RMM for each specimen and control. Attention! Labels should be placed on the lateral side of the tubes. RealLine Pathogen Diagnostic Kits 8.2. Add 50 µl of corresponding isolated DNA solution to each tube using a separate pipette tip with filter. Do not touch the pellet! Tightly close the tubes with caps or seal with the PCR transparent film Place the tubes into the real-time PCR system Program real time PCR system as follows: Stage 1: 50 С, 2 min; Stage 2: 95 С, 2 min; Stage 3: 94 C, 10 sec 60 C*, 20 sec 50 cycles * Measure the fluorescence at 60 C Select the amplification detection channels: Collect real-time PCR data through the FAM channel for detection of amplification of IC DNA. Collect real-time PCR data through the ROX channel for detection of amplification of Candida albicans DNA Program the positions of test tubes with samples, positive and negative controls according to the instruction manual for the real time PCR system in use Run the program. 9. DATA ANALYSIS AND INTERPRETATION When using iq5 icycler and CFX 96 (Bio-Rad, USA) or similar real time PCR systems analysis is carried out in accordance with the enclosed instruction manual For PC the program should detect: increase of the IC DNA amplification signal (channel FAM ) and determine the threshold cycle, IC Ct; increase of the Candida albicans DNA amplification signal (channel ROX ) and determine the Ct value; 9.2. For NC the program should detect the increase of the amplification signal of IC DNA (channel FAM ) and determine the threshold cycle, IC Ct. No ROX fluorescent increase should appear (no Candida albicans DNA amplification). When Ct value for NC through ROX channel is less than or equal to 40, this indicates the presence of contamination (see paragraph 9.7.). Page/Seite 8 of/von 16

9 9.3. For each sample the program should detect the increase of the amplification signal of IC DNA (channel FAM ) and determine IC Ct Calculate (IC Ct) av as an average IC Ct of all analyzed samples (including PC and NC). IC Ct values that differ by more than 2 cycles from the (IC Ct) av should be ignored. Recalculate the (IC Ct) av for the remaining values after the screening The sample is considered negative (not containing Candida albicans DNA), if Ct value via ROX channel for this sample is above 40 or is not determined. When IC Ct value for such sample differs from the (IC Ct) av value by more than 2 cycles, the result is regarded as equivocal. A repeated analysis of the sample, starting with the DNA isolation step is necessary The sample is considered positive (containing Candida albicans DNA), when Ct value via ROX channel for this sample is less than or equals to In case of contamination all positive results of this individual PCR run are considered equivocal. Actions are required to identify and eliminate the source of contamination, and repeat the analysis of all samples of this run that were identified as positive. Samples that showed negative results in this run should be considered as negative. 10. STORAGE AND TRANSPORTATION Store the assay kit at (2-8) С in the manufacturer s packing. Transportation at 25 С for up to 10 days is allowed. Do not freeze the kit! Do not pool reagents from different lots or from different vials of the same lot. Strictly follow the Instruction manual for reliable results. Do not use kits with damaged inner packages and get in contact with BIORON Diagnostics GmbH. Storage and shelf life of solutions and components of the kit after initial opening: Positive Control sample: 1 month at 2 to 8 C. Ready Master Mix (RMM): 3 months at 2 to 8 C. Page/Seite 9 of/von 16

10 KIT FÜR DEN QUALITATIVEN NACHWEIS VON CANDIDA ALBICANS DNA DURCH REAL- TIME PCR In-vitro Diagnostikum 1. EINLEITUNG Klinische Informationen: Candida albicans - ein Hefe - kann verschiedene Krankheiten unter bestimmten Bedingungen hervorrufen. Über 30% der Menschen sind in den Schleimhäuten des Mundes, Rachens, Magens, Darms und des Genitalbereichs mit C.albicans besiedelt. Systemische Pilzinfektionen auch mit C. albicans sind wichtige Ursachen von Morbidität und Mortalität bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem (z.b. AIDS, Krebs-Chemotherapie, Organ- oder Knochenmarktransplantation). Auch können Biofilme mit C. albicans auf der Oberfläche von implantierbaren medizinischen Vorrichtungen gebildet werden. Darüber hinaus können Infektionen durch im Krankenhaus erworbene C. albicans ausgeprägte gesundheitliche Beschwerden hervorrufen. Das (Str-format) Assay Kit wurde für den DNA-Nachweis von Candida albicans entwickelt, das aus klinischen Proben durch die Verwendung der folgenden Extraktions-Kits isoliert wurde: RealLine DNA-Express (REF VBC8899) RealLine DNA-Extraction 2 (REF VBC8897) RealLine DNA-Extraction 3 (REF VBC8889) RealLine Extraction 100 (REF VBC8896) Das (Str-format) ist für die Analyse von klinischem Material wie den Abstrichen von Epithelzellen, Sperma, Flüssigkeit der Prostata und Urin entwickelt worden. Der Nachweis basiert auf der Methode der Real-Time Polymerase Kettenreaktionen (PCR) mittels Fluoreszenz-Detektion des amplifizierten Produkts. Das (Str-format) Kit wurde für die ist für die Analyse von klinischem Material wie den Abstriche von Epithelzellen, Sperma, Flüssigkeit der Prostata und Urin entwickelt worden. Der Kit enthält 96 Tubes (0,2ml) in Strips (8er) mit lyophilisiertem Mastermix, in jedem Tube ist eine Reaktion für je 50µl Endvolumen vorhanden. Der Kit enthält Reagenzien für 96 Ansätze einschließlich der Kontrollproben und die Positivkontrolle. Der Kit ist validiert für den Gebrauch mit dem iq 5 icycler (Bio-Rad, USA). Der Kit ist kompatibel mit den Real-time PCR Geräten wie, iq icycler, CFX 96 (Bio-Rad, USA) and DT- 96 (DNA-Technology, Russia). Page/Seite 10 of/von 16

11 Die Verwendung des Kits! mit anderen Real-time PCR Geräten! mit anderen Reaktionsvolumina als 50µl! mit einem Extraktionskit für Nukleinsäuren von anderen Herstellern muss vom Benutzer im Labor validiert werden. Die Angaben zur Verwendung der internen Kontrolle IC müssen befolgt werden. 2. INHALT DES KITS Universelle Positivkontrolle (PC) 1 Vial, 1 ml; Ready Master Mix (RMM), lyophilisiert 96 Test-Tubes (12 Strips x 8 Tubes); Das Kit enthält zusätzlich optisch transparente PCR-Filme oder aufklappbare Deckel. 3. PRINZIP DER METHODE Die Real-Time PCR basiert auf der Messung von Fluoreszenz, die von einem Reportermolekül ausgeht und im Laufe des Prozesses zunimmt. Reportermoleküle sind dual-markierte DNA- Messer, die spezifisch an die Zielregion der pathogenen DNA binden. Das Fluoreszenzsignal erhöht sich in Abhängigkeit des Fluoreszenzfarbstoffs und wird mittels der Exonuklease Aktivität der Taq DNA-Polymerase während der Amplifikation gequencht. Der PCR Prozess besteht aus der Wiederholung von Zyklen: Temperatur Denaturierung von DNA, Primer Annealing und der Synthese des komplementären Strangs. Der Ct ist der Zyklus bei dem die erzeugte Fluoreszenz innerhalb einer Reaktion die Fluoreszenz des Grenzwerts überschreitet, ein Fluoreszenzsignal steigt signifikant über die Fluoreszenz des Hintergrundwerts. Der Ct hängt von der anfänglichen Quantität des pathogenen DNA Templates ab. Die Verwendung einer internen Kontrolle (IC) verhindert die Entstehung von falsch negativen Ergebnissen, die mit einem möglichen Verlust der Template DNA während der Herstellung der Proben einhergeht. Die IC zeigt auf, ob innerhalb des Reaktionsgemisches PCR Inhibitoren vorhanden sind. Das Template der IC sollte in jedes einzelne Sample (einschließlich der Kontroll- Samples) vor der DNA Extraktionsprozedur zugegeben werden. Die Amplifikation und Detektion der IC beeinträchtigt die Sensitivität und Spezifität der Ziel DNA PCR nicht. 4. SPEZIFITÄT I. Sensitivität: Sensitivitätskontrollen wurden mit 5 Proben hergestellt, die 100 Candida albicans DNA-Kopien pro Probe enthalten und mit dem SRS (Standard Referenz Probe mit Candida albicans DNA) durchgeführt, reg. No Die Sensitivitätsübereinstimmung beträgt 100%. Page/Seite 11 of/von 16

12 II. Spezifität: Die Spezifität des Candida albicans DNA Nachweises wurde durch die Verwendung von negativen DNA-Extrakten des Standard Reference Panel (Reg. No ) determiniert, die Proben mit IC DNA aber nicht DNA des STD Agens enthalten. Der Nachweis der Spezifitätsübereinstimmung von Candida albicans DNA beträgt 100%. III. Diagnostische Evaluation: Die diagnostische Evaluation wurde mit 50 klinischen Proben durchgeführt. 20 Proben (No. 1-20), negative Proben; 20 Proben (No.21-40), positive Proben, die DNA von Candida albicans enthalten; 10 Proben (No ), die von Individuen erhalten wurden, die mit Trichomonas vaginalis sind. Die Bestimmung der Sensitivität wurde mit 20 klinischen Proben aus klinischem Material, das Candida albicans enthält mit einem CE-markierten Referenzkit für die Detektion von Candida albicans durchgeführt. Das Kit (Str-format) determinierte alle 20 Proben als positiv. Die Analyse durch das Referenzkit überprüfte alle 20 Proben als positiv auf Candida albicans. Die diagnostische Sensitivitätsübereinstimmung beträgt 100%. Die Bestimmung der Spezifität wurde mit 20 Proben von Spendern und 10 Proben von Patienten, die mit Trichomonas vaginalis infiziert sind und dem CE-markierten Referenzkit durchgeführt. Bei der Überprüfung der klinischen Proben der gesunden Personen mittels RealLine Candida albicans (Str-format) wurden für alle 20 Proben negative Ergebnisse belegt. Die Analyse dieser Proben mittels des Referenzkits bestätigten die Ergebnisse in allen Fällen. Bei der Überprüfung der klinischen Proben der mit Trichomonas vaginalis infizierten Patienten mit dem (Str-format), wurden für alle 10 Proben negative Ergebnisse belegt. Die Analyse dieser Proben mit dem Referenzkit bestätigten die Ergebnisse in allen Fällen. Demnach stimmen die Ergebnisse der Kits (Str-format) und dem CEmarkierten Referenzkit zu 100% überein. Die Übereinstimmung der Spezifitäts beträgt 100%. 5. WARNHINWEISE UND SICHERHEITMAßNAHMEN Nur für den In-vitro Gebrauch. Das Kit darf nur von geschulten Personen verwendet werden. Bei dem Verwenden des Kits, müssen die nationalen Sicherheitsanforderungen für das Arbeiten mit Pathogenen befolgt werden. Um Kontaminationen zu vermeiden, werden die Stufen der DNA Isolation und der PCR Test räumlich getrennt voneinander durchgeführt. Vermeiden Sie mikrobielle und Nuklease Kontaminationen der Reagenzien, wenn Sie die Aliquots aus den Gefäßen der Reagenzien entnehmen. Page/Seite 12 of/von 16

13 Tragen Sie bei der Verwendung der Proben und Reagenzien des Kits schützende Einmalhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrillen. Jeder Arbeitsplatz muss mit seinem eigenen Set an Volumen-variablen Pipetten, den notwendigen Hilfsmaterialien und Equipment ausgestattet sein. Sie dürfen nicht an andere Arbeitsplätze überführt werden. Die Verwendung von sterilen Einmalpipettenspitzen wird empfohlen. Verwenden Sie niemals die gleiche Spitze für unterschiedliche Proben. Poolen Sie Reagenzien von verschiedenen Chargen oder von verschiedenen Gefäßen der gleichen Charge nicht. Entsorgen Sie nicht verwendete Reagenzien und Abfall gemäß der Landes, Bundeslandes und Lokalen Vorschriften. Verwenden Sie das Kit nach Ablauf des Mindesthaltbarkeitsdatums nicht mehr. 6. ZUSÄTZLICHE BENÖTIGTE MATERIALIEN UND GERÄTE, DIE NICHT MITGELIEFERT WERDEN Real-time PCR Gerät, Beschrieben in Kapitel 1 Kit für die Extraktion von DNA, z. B. RealLine DNA-Extraction 3 mit Internal Control, oder andere (s.kap.1) Internal Control Reagenz (VBC8881) und Negative Control Sample oder H2O (molecular biology grade), falls ein Extraktionskit eines anderen Herstellers verwendet wird Sterilbank; Kühlschrank; Halbautomatische Einkanalpipetten mit variablem Volumen; Medizinische nicht-sterile puderfreie Einmalhandschuhe; Einmalpipettenspitzen mit aerosoler Barriere; Müllbehälter für biogefährliche Materialien. 7. VORBEREITUNG DER ZU ANALYSIERENDEN PROBEN UND REAGENZIEN Jede Proben-Gruppe für die eine DNA-Isolation durchgeführt wird, muss eine Positivkontrolle (PC) aus diesem Kit und eine Negativkontrolle (NC), eine Komponente des DNA Extraktions Kits, enthalten. Wir empfehlen die interne Kontrolle (IC), Positivkontrolle (PC) und Negativkontrolle (NC) im Extraktionsschritt auch mit aufzureinigen. Bei der Verwendung eines Extraktionskits eines anderen Herstellers, als die in Kapitel 1 beschriebenen, geben Sie je 20 µl der IC jeder Probe zu, Für die NC verwenden Sie 100µl der Negative Control Sample oder H 2 O (molecular biology grade). Für die PC verwenden Sie 70 µl der Negative Control Sample oder H 2 O (molecular biology grade) und 30 µl der Positive Control Sample. Page/Seite 13 of/von 16

14 7.1 Vorbereitung der Proben Bereiten Sie die Proben für den Assay durch die Verwendung der Extraktionskits RealLine DNA - Express, RealLine DNA - Extraction 1, RealLine DNA - Extraction 2, RealLine DNA - Extraction 3 oder RealLine Extraction 100 gemäß dem Anleitungshandbuch vor. Wenn die Proben der isolierten DNA vor dem Assay eingefroren wurden, sollten diese aufgetaut und für mindestens 30 Minuten bei Temperaturen zwischen 18 bis 25 C belassen werden. Die isolierte DNA kann bei 2 bis 8 C bis zu 2 Tagen gelagert werden. Nach dem Öffnen sollte die Positivkontrolle für die gesamte Zeitspanne der Haltbarkeitsdauer von 1 Monat bei 2 bis 8 C gelagert werden Vorbereitungen der Reagenzien Vor dem Test wird das Kit aus dem Kühlschrank genommen und der Ready Master Mix (RMM) in der geschlossenen Verpackung für mindestens 30 Minuten bei C belassen. Danach wird die Verpackung geöffnet und die notwendige Anzahl an Tubes in Stripes mit RMM (einschließlich der vorbereiteten Proben und Kontrollen: 1 NC und 1 PC) mit einem Messer herausgeschnitten. Die herausgeschnittenen Tubes werden mit der Abdeckfolie aneinander geklebt. Die übrigen Stripes werden sofort wieder in den Folienbeutel zurückgelegt, die Luft herausgedrückt und der Beutel mit dem Clip dicht verschlossen. Nach dem Öffnen sollte der RMM bei 2 bis 8 C gelagert werden und innerhalb von 3 Monaten aufgebraucht werden. 8. DURCHFÜHRUNG 8.1. Beschriftung der Tubes mit RMM für jede Probe und Kontrolle. Achtung! Die Beschriftung sollte an der lateralen Seite der Tubes erfolgen Zugabe von 50 µl der entsprechenden isolierten DNA-Lösung in jedes Tube durch die Verwendung einer separaten Pipettenspitze mit Filter. Das Pellet nicht berühren! Die Tubes werden dicht mit den Deckeln oder dem transparenten PCR-Film verschlossen Platzierung der Tubes im Real-Time PCR System Programmierung des PCR Systems. Schritt 1: 50 С, 2 min; Schritt 2: 95 С, 2 min; Schritt 3: 94 C, 10 sek 60 C*, 20 sek 50 Zyklen * Bestimmung der Fluoreszenz bei 60 C. Page/Seite 14 of/von 16

15 8.5. Auswahl des Detektionskanals für die Amplifizierung: Sammlung der Real-Time PCR Daten durch den FAM Kanal für die Detektion der Amplifikation von IC DNA. Sammlung der der Real-Time PCR Daten durch den ROX Kanal für die Detektion der Amplifikation von Candida albicans DNA Programmierung der Positionen für die Tubes mit Proben, sowie der Positiv- und Negativkontrollen gemäß dem Anleitungshandbuch des verwendeten PCR Systems Durchführung des Programms. 9. DATENANALYSE UND INTERPRETATION Bei der Verwendung von iq 5 icycler und CFX 96 (Bio-Rad, USA) oder ähnlichen Real-Time PCR Systemen, wird die Analyse gemäß dem beigelegten Anleitungshandbuch durchgeführt Für die PC sollte das Programm detektieren: Anstieg des IC DNA Amplifikationssignals (Kanal: FAM ) und Determinierung des Grenzwert Zyklus IC Ct; Anstieg des Candida albicans Amplifikationssignals (Kanal ROX ) und Determinierung des Ct Wertes; 9.2. Für die NC sollte das Programm die Erhöhung des Amplifikationssignals der IC DNA im Kanal FAM detektieren und den Grenzwert Zyklus IC Ct determinieren. Es darf keine erhöhte Fluoreszenz bei ROX auftreten (keine Candida albicans DNA Amplifikation). Wenn der Ct Wert der NC durch den ROX Kanal kleiner oder gleich 40 ist, deutet dies auf das Vorhandensein von Kontaminationen hin (siehe Paragraph 9.7.) Das Programm sollte für jede Probe Erhöhungen des Amplifikationssignals der IC DNA (Kanal FAM ) detektieren und den IC Ct determinieren Die Berechnung des (IC Ct) av erfolgt als Durchschnittswert des IC Ct aller analysierten Proben (einschließlich PC und NC). IC Ct Werte die sich vom (IC Ct) av mehr als 2 Zyklen unterscheiden sollten nicht berücksichtigt werden. Nach dem Screening werden die (IC Ct) av für alle verbleibenden Werte zurückberechnet Eine Probe wird als negativ betrachtet (keine Candida albicans DNA) wenn der Ct Wert im ROX Kanal für eine Probe größer als 40 ist oder nicht determiniert wird. Wenn der IC Ct Wert solcher Proben sich vom (IC Ct) av mehr als 2 Zyklen unterscheiden, wird das Ergebnis als zweifelhaft betrachtet. Eine erneute Analyse der Proben, ausgehend von der DNA Isolation ist notwendig. Page/Seite 15 of/von 16

16 9.6. Eine Probe wird als positiv betrachtet (enthält Candida albicans DNA) wenn der Ct Wert im ROX Kanal für eine Probe kleiner oder gleich 40 ist Im Falle von Kontaminationen werden alle positiven Ergebnisse dieses PCR-Laufs als zweifelhaft betrachtet. Es sind Maßnahmen nötig, um die Quellen der Kontaminationen zu identifizieren und zu eliminieren sowie eine Wiederholung der Analyse aller Proben des Laufs, die als positiv identifiziert wurden. Proben mit negativem Ergebnis innerhalb des Laufs sollten als negativ betrachtet werden. 10. LAGERUNG UND TRANSPORT Lagerung des Kits bei (2-8) C in der Herstellungsverpackung. Der Transport bei 25 C für bis zu 10 Tagen ist möglich. Kit nicht einfrieren! Poolen Sie Reagenzien von verschiedenen Chargen oder von verschiedenen Gefäßen der gleichen Charge nicht. Befolgen Sie das Anleitungshandbuch für zuverlässige Ergebnisse. Falls die innere Verpackung beschädigt ist, bitte wenden Sie sich an BIORON Diagnostics GmbH. Lagerung und Haltbarkeit der Lösungen und Komponenten des Kits nach dem ersten Öffnen der Verpackungen: Positivkontrolle: 1 Monat bei 2 bis 8 C. Ready Master Mix (RMM): 3 Monate bei 2 bis 8 C. Page/Seite 16 of/von 16