Optimierte Immundiagnostik durch krankheitsbezogene Immunprofile

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1 Optimierte Immundiagnostik durch krankheitsbezogene Immunprofile Kompetenzzentrum für komplementär medizinische Diagnostik Labor Dr. Bayer im synlab MVZ Leinfelden Max-Lang-Straße 58 D Leinfelden-Echterdingen Telefon +49(0) Telefax +49(0)

2 2 Optimierte Immundiagnostik durch krankheitsbezogene Immunprofile Vor zirka dreißig Jahren wurde durch zwei bahnbrechende Entwicklungen eine umfassende Typisierung von Immunzellen durchführbar. Durch Verwendung monoklonaler Antikörper gegen Oberflächenmarker von Zellen sowie durch den Einsatz der Durchflusszytometrie wurde eine Analyse mikroskopisch nicht zu unterscheidender Lymphozytensubpopulationen möglich. Die ursprünglichen Hauptindikationen für die Erhebung solcher Immunprofile waren die Diagnose und Verlaufskontrolle chronisch lymphatischer Leukämien, die Aufdeckung von Immundefektsyndromen, die Ermittlung des Grades der Immunschwäche im Zuge einer HIV-Infektion sowie die Eruierung der Immunrekonstitution nach myeloablativer Therapie nach Knochenmark- oder Stammzelltransplantation. Seit langem weiß man, dass Veränderungen des Immunsystems auch bei weniger schweren Grunderkrankungen auftreten, was sich in Veränderungen einzelner Lymphozytensubpopulationen niederschlägt. Für eine ganze Reihe von Grunderkrankungen konnte die klinische Relevanz der Erhebung eines Immunstatus belegt werden. Diese reichen von einer Abklärung der Ursachen einer erhöhten Infektanfälligkeit über Tumorerkrankungen bis hin zu Allergien und Autoimmunerkrankungen. Ein wichtiges Feld sind auch iatrogen ausgelöste Immundefizite. Die Indikationen für die Erhebung eines Immunstatus können daher wie folgt zusammengefasst werden: rezidivierende Infekte, auch als Folge einer immunsuppressiven Behandlung Abklärung unklarer Lymphozytosen und unklarer Lymphozytopenien/Leukopenien Virusinfektionen einschließlich Monitoring bei HIV-Infektion Tumoren einschließlich der Therapiekontrolle, auch bei aggressiven Therapieformen wie Chemo- und Strahlentherapie allergische Erkrankungen chronisch entzündliche Erkrankungen einschließlich Autoimmunerkrankungen Planung und Optimierung einer individuellen Immuntherapie Therapiekontrolle im Rahmen einer Immuntherapie Überwachung des Immunstatus nach Transplantationen. Die einzelnen Zellpopulationen Lymphozyten lassen sich grob schematisiert in die drei Hauptgruppen der T-Zellen, der B-Zellen und der NK- Zellen einteilen (siehe Abbildung 1). T-Lymphozyten Die T-Lymphozyten durchlaufen einen Reifeprozess in der Thymusdrüse und sind charakterisiert durch den Oberflächen marker CD3. Sie stellen normalerweise den Abbildung 1 Hauptteil der Lymphozyten dar. T-Lymphozyten sind ein zentraler Träger der zellulären Immunabwehr gegen Viren und Pilze sowie auch gegen Tumorzellen. Die T-Lymphozyten können in eine Vielzahl von Subpopulationen aufgeteilt werden. Besonders wichtig sind: 1. T-Helferzellen: Diese tragen den Oberflächenmarker CD4 und haben im zellulären Immunsystem eine hochregulierende Wirkung. Sie sind in der Lage, antigene Strukturen zu erkennen, die von so genannten antigenpräsentierenden Zellen (z. B. Makrophagen) exprimiert werden und geben dann Zytokine (Interleukine, Interferon) ab, womit sie Effektor-Zellen wie z. B. stimulieren. Sie stimulieren auch die B-Lymphozyten zur Transformation zu Plasmazellen und damit zur Produktion von Antikörpern. 2. Suppressor-/zytotoxische T-Zellen: Diese tragen den Oberflächenmarker CD8. CD8-positive Zellen haben unterschied liche Funktionen. Sie greifen in die Regulation des Immunsystems ein und haben hier suppressorische

3 Optimierte Immundiagnostik durch krankheitsbezogene Immunprofile 3 Funktio nen, d. h. sie haben eine abregulierende Wirkung auf das Immunsystem. Dies kann besonders zur Verhinderung und Eingrenzung von Autoaggressionserkrankungen wichtig sein. Andere Untergruppen der CD8-positiven Zellen verfügen jedoch auch über zytotoxische Eigenschaften und spielen damit eine wesentliche Rolle bei der Eliminierung von virusinfizierten und Tumorzellen. Durch geeignete Marker können die CD8-positiven Zellen weiter aufgeteilt werden in solche mit suppressorischer und andere mit zytotoxischer Funktion. B-Lymphozyten B-Lymphozyten können unter Stimulierung durch Zytokine zu Plasmazellen differenzieren, die Träger der Antikörperbildung sind. B-Lymphozyten sind damit unerlässlich für die Aufrechterhaltung der humoralen Immunabwehr. Die Reifung der B-Lymphozyten findet im Knochenmark statt. Sie sind charakterisiert durch den Oberflächenmarker CD19. Die natürlichen Killer-(NK-)Zellen sind charakterisiert durch die Markerkombination CD3-/CD16+/CD56+. Sie sind zu einer durch Zellkontakt vermittelten unspezifischen Lyse von Zielzellen wie virustransformierte und Tumorzellen befähigt. Ihre Funktion ist antigenunabhängig. Immunprofil Panel 1: Basisprofil Dieses Profil hat sich seit vielen Jahren bewährt und stellt ein Basisinstrument im Rahmen der Immundiagnostik dar. Bezüglich der Suppressor/zytotoxischen T-Lymphozyten haben wir das Basisprofil an die heute überwiegend durchgeführte Phänotypisierung mit der Marker-Kombination CD3+/CD8+ (statt nur CD8+) angepasst. Damit wird verhindert, dass auch CD8-positive zu diesem Subset hinzugerechnet werden. Durch diese Änderung ergeben sich auch Veränderungen bei den Normalbereichen. Folgende Zellpopulationen werden beim Basisprofil untersucht: Zellpopulation Leukozyten Lymphozyten Monozyten Granulozyten T-Lymphozyten T-Helferzellen Suppressor-/zytotoxische T-Zellen aktivierte T-Zellen non-mhc zytotoxische T-Zellen CD4+/CD8+-Ratio B-Lymphozyten Marker CD3+ CD3+/CD4+ CD3+/CD8+ CD3+/HLA-DR+ CD3+/CD16+/CD56+ CD19+ CD3-/CD16+/CD56+ Seit der Einführung dieses Basisprofils wurde eine Vielzahl zusätzlicher Oberflächenmarker auf Immunzellen nachgewiesen und ihre Relevanz für die immunologische Diagnostik evaluiert. Es hat sich als sinnvoll erwiesen, aus der Vielfalt der sich hier ergebenden immundiagnostischen Ansatzpunkte spezielle und krankheitsbezogene Immunprofile zu entwickeln, wobei wir in Ergänzung zum Basisprofil zwei weitere Immunprofile zusammengestellt haben.

4 4 Optimierte Immundiagnostik durch krankheitsbezogene Immunprofile Immunprofil Panel 2: Infektanfälligkeit/chronische Entzündungen/ Autoimmunerkrankungen (Entzündungsprofil) In Erweiterung des Basisprofils erfolgt eine Subdifferenzierung der CD4-positiven T-Helferzellen in naive und Memory-Zellen der CD19-positiven B-Zellen in polyreaktive und Memory-B-Zellen. Zusätzlich werden die kurzzeitaktivierten T-Helferzellen sowie die regulatorischen T-Zellen bestimmt. Zellpopulation Marker Leukozyten Lymphozyten Monozyten Granulozyten T-Lymphozyten CD3+ langzeitaktivierte T-Zellen CD3+/HLA-DR+ T-Helferzellen CD3+/CD4+ kurzzeitaktivierte Helferzellen CD4+/CD69+ naive Helferzellen CD4+/CD45 RA+ Memory Helferzellen CD4+/CD45 RA Regulatorische T-Zellen (Treg) CD4+/CD25+/CD127 LO T-Suppressor-/zytotoxische T-Zellen CD8+ non-mhc zytotoxische T-Zellen CD3+/CD16+/CD56+ CD4+/CD8+-Ratio B-Lymphozyten polyreaktive B-Zellen Memory-B-Zellen CD19+ CD19+/CD5+ CD19+/CD27+ CD3-/CD16+/CD56+ Die klinische Relevanz dieser zusätzlichen Marker ist nachfolgend dargestellt. Aktivierungszustand des T-Zellsystems Die Bestimmung dieser Aktivierungsparameter dient zur Beschreibung des funktionellen Zustandes des T-Zellsystems, was durch die alleinige Feststellung von Zellzahlen nicht möglich ist. Unter einer Aktivierung bilden die T-Lymphozyten Oberflächenmarker wie CD69 oder HLA-DR aus. CD69 ist dabei ein sehr früh exprimierter Aktivierungsmarker, der bereits wenige Stunden nach einer Aktivierung der T-Zelle nachweisbar wird und somit ein frühes Stadium der T-Zellaktivierung anzeigt. Die Expression des Markers HLA-DR setzt hingegen eine längere Zeit der Aktivierung voraus, so dass solche Zellen auch als langzeitaktivierte T-Zellen bezeichnet werden. Eine Verminderung der aktivierten T-Lymphozy ten, vor allem bei niedriger Gesamt-T-Zellzahl weist auf eine Hyporesponsivität hin, wie dies häufig bei infektanfälligen Patien ten nachzuweisen ist. Patienten mit angeborenen oder erworbenen Defekten im spezifischen Immunsystem weisen hingegen oft Zeichen einer T-zellulären Überstimulation auf, wie dies z. B. bei HIV-infizierten Patienten nachzuweisen ist. Hier ist die Aktivierung der T-Lymphozyten unproduktiv und führt über eine aktivierungsinduzierte Apoptose zum Absterben der T-Zellen. Subtypisierung der Helferzellen Mittels des Einsatzes des Antikörpers gegen CD45RA können so genannte Naive Helferzellen (CD4+/CD45RA+) von Memory Helferzellen (CD4+/CD45RA-) unterschieden werden. Memory Zellen sind antigenerfahrene Zellen und dadurch in der Lage, bei einem erneuten Kontakt mit dem Antigen eine prompte und starke Gegenreaktion aufzubauen.

5 Optimierte Immundiagnostik durch krankheitsbezogene Immunprofile 5 Naive Zellen bilden hingegen die immunologische Reserve. Sie wird benötigt, um bei einem immunologi schen Challenge eine Erstantwort aufbauen zu können. Beide Zelltypen sollten in ausgewogener Relation vorliegen. Ein Anstieg des Verhältnisses von Memory zu Naiven Zellen ist ein sensitives Zeichen für eine persistierende Immunaktivierung, vor allem dann, wenn die Erhöhung auf einer Expansion von Memory Zellen basiert. Solche erhöhten Verhältnisse von Memory zu Naiven Zellen trifft man bei folgenden Grunderkrankungen an: Virusinfektionen (HIV, CMV, VZV und HSV) Tumorerkrankungen Autoimmunerkrankungen im Übertrainingszustand eines Sportlers bei CFS im hohen Alter. Ein rasches Ansteigen des Memory:Naiven-Verhältnisses kann bei Patienten mit MS auf einen bevorstehenden Schub hinweisen. Eine Verminderung des Verhältnisses von Memory zu Naiven Zellen kann z. B. beim Allergiker, aber auch bei Patienten mit metabolischen Störungen wie Diabetes mellitus angetroffen werden. Subtypisierung der B-Lymphozyten Im Rahmen der Subtypisierung von B-Lymphozyten werden folgende beiden Subpopulationen bestimmt: a) CD5-positive B-Lymphozyten. Hierbei handelt es sich um polyreaktive B-Zellen (so genannte B1-Zellen), die niedrig-affine, polyreaktive Antikörper der IgM-Klasse bilden. Erhöhte Anteile dieser Zellpopulation finden sich z.b. bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen. Auch chronisch-lymphatische Leukämien sind häufig durch diesen B-Zelltyp charakterisiert. b) CD27-positive B-Lymphozyten. Dabei handelt es sich um so genannte Memory B-Zellen, also B-Lymphozyten, die als Gedächtniszellen vorliegen und bei einem erneuten Kontakt mit einem bereits bekannten Erreger eine effiziente und schnelle Immunantwort auslösen können. Defizite der Memory B-Zellen können z.b. bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen sowie bei CVID nachgewiesen werden. Regulatorische T-Lymphozyten bei Autoimmunerkrankungen Die regulatorischen T-Zellen (Treg) sind durch die Markerkombination CD4+/CD25+/CD127low gekennzeichnet. Es handelt sich also um eine Untergruppe der T-Helferzellen, wobei der Anteil dieser Zellpopulation an den T-Helferzellen normalerweise bei 5 10 % liegt. Regulatorische T-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Limitierung immunpathologischer Reaktionen im Zusammenhang mit Allergien, Autoimmunerkrankungen und Transplantationen. Sie wirken suppressorisch auf die T-Zelleffektor-Antworten und sind damit ein wesentlicher Bestandteil der Gegenregulation nach erfolgter Immunaktivierung. Bei einem erfolgreichen Behandlungsverlauf von Autoimmunerkrankungen steigen die regulatorischen T-Zellen häufig an. Immunprofil Panel 3: Tumorerkrankungen (Onkoprofil) Zusätzliche Marker haben die Einschätzung der Immunitätslage eines Tumorpatienten einschließlich der Prognose deutlich verbessert und dienen zur Überwachung einer immunstimulierenden Therapie. Neben den bereits erwähnten regulatorischen T-Zellen (Treg) gehört dazu eine Beurteilung der Thymusreserve, eine Differenzierung der CD8-positiven Zellen in solche mit suppressorischer/regulativer beziehungsweise zytotoxischer Funktion und die Beurteilung des Aktivierungsgrades der Killerzellen. Unter Heranziehung dieser Marker haben wir ein spezielles Onkoprofil erstellt:

6 6 Optimierte Immundiagnostik durch krankheitsbezogene Immunprofile Zellpopulation Marker Leukozyten Lymphozyten Monozyten Granulozyten T-Lymphozyten CD3+ kurzzeitaktivierte T-Zellen CD3+/CD69+ langzeitaktivierte T-Zellen CD3+/HLA-DR+ T-Helferzellen CD3+/CD4+ naive Helferzellen CD4+/CD45RA+ Memory Helferzellen CD4+/CD45RA- Regulatorische T-Zellen (Treg) CD4+/CD25+/CD127 LO Recent thymus emigrants (Thymusreserve) CD4+/CD45RA+/CD31+ T-Suppressor-/zytotoxische T-Zellen CD3+/CD8+ MHC-zytotoxische CD8-pos. Zellen CD8+/CD28+ suppressorische CD8-pos. Zellen CD8+/CD28- non-mhc zytotoxische T-Zellen CD3+/CD16+/CD56+ B-Lymphozyten CD19+ aktivierte Killerzellen CD3-/CD16+/CD56+ CD56+/HLA-DR+ Regulatorische T-Lymphozyten: kritische Rolle bei Tumorerkrankungen Die Bedeutung der regulatorischen T-Lymphozyten bei Autoimmunerkrankungen haben wir bereits besprochen. Allerdings spielen diese Zellen eine doppeldeutige Rolle, da regulatorische T-Zellen auch Immunreaktionen gegen Tumor antigene limitieren beziehungsweise supprimieren können. Dabei spielt auch die Anreicherung regulatorischer T-Zellen im Tumorgewebe eine wichtige Rolle. Eine Akkumulierung von regulatorischen T-Zellen im Tumorgewebe geht mit einer verminderten Überlebensrate einher. Möglicherweise fördern regulatorische T-Zellen das Tumorwachstum. Bei allen immunmodulierenden Maßnahmen bei Tumorpatienten stellen die regulatorischen T-Zellen einen wichtigen Verlaufsmarker dar, da deren Absinken unter der Therapie, beziehungsweise zumindest die Verhinderung eines weiteren Ansteigens als prognostisch günstig anzusehen ist. Eine weitere Erhöhung von Treg unter immunstimulierender Therapie ist als ungünstig anzusehen. Abbildung 2: Von der antigenen Belastung (Infektion, Tumor) bis zur kontrollierten Immun antwort. In der stark vereinfachten Übersicht wird ein Bruchstück des Erregers bzw. des Tumors von antigenpräsentierenden Zellen den T-Helferzellen gezeigt, woraufhin diese über verschiedene Cocktails von Botenstoffen (Zytokinen) unterschiedliche Effektorzellen anregen, was zum einen eine Antikörperbildung und zum anderen eine Rekrutierung von zytotoxischen Effektorzellen in Gang setzt. Von Makrophagen frei gesetzte Mediatoren sowie vom Mikromilieu ausgehende Stoffe des Gewebs- und Tumorzerfalls können Suppressorzellen anschalten und so den Immunaktivierungsprozess beenden.

7 Optimierte Immundiagnostik durch krankheitsbezogene Immunprofile 7 Differenzierung der CD8-positiven Suppressor-/zytotoxischen T-Lymphozyten CD8-positive T-Lymphozyten wurden früher allgemein als Suppressorzellen bezeichnet. Dies ist falsch, da diese Zellen sowohl suppressorische/regulative wie auch zytotoxische Funktionen haben können. Dies lässt sich differenzieren über den Marker CD28. CD8-positive, aber CD28-negative Lymphozyten haben suppressorisch/regulative Eigenschaften und einen modulierenden Einfluss auf die T- und B-Zellfunktionen. Sie wirken überschießenden Immunreaktionen entgegen. T-Lymphozyten, die hingegen CD8 und CD28 positiv sind, spielen eine wichtige Rolle bei der antiviralen und der antitumoralen Abwehr. Dabei kann eine unklare Erhöhung dieser Zellpopulation bereits eine immunologische Auseinandersetzung mit virusinfizierten beziehungsweise aberranten Zellen widerspiegeln. Bei immunstimulierenden Therapien wird es das Ziel sein, den Anteil an zytotoxischen, also CD28-positiven Zellen zu erhöhen. Ein solcher Anstieg signalisiert ein Ansprechen des Immunsystems auf die immunmodulierende Therapie. Beurteilung der Thymusreserve Im Laufe des Lebens kommt es zu einem kontinuierlichen Rückgang der Größe der Thymusdrüse beziehungsweise zu einem Ersatz des funktionsfähigen Thymus durch Fettgewebe. Die Thymusdrüse ist die Schule der T-Lymphozyten. Die Beurteilung der Funktion der Thymusdrüse beziehungsweise der so genannten Thymusreserve erfolgt über den Marker CD31, der von naiven T-Helferzellen exprimiert wird. CD31 wird dabei von solchen Zellen exprimiert, die erst kürzlich die Thymusdrüse verlassen haben und man spricht hier von recent thymic emigrants. Der Anteil dieser Zellen ist damit ein Maß für die verbliebene Thymusrestfunktion. Bei eingeschränkter Thymusfunktion kommt es zu einer verminderten Bildung omnipotenter naiver T-Lymphozyten. Die Abschätzung der Thymusfunktion ist von besonderer Bedeutung bei Chemound Strahlentherapie, zur Abklärung unklarer persistierender Lymphozytopenien und stellt einen Therapiemarker für die Indikation einer Behandlung mit Thymuspeptiden dar. Killerzellaktivierung Die funktionelle Aktivität des Killerzellsystems kann nicht allein anhand ihrer Zellzahl abgeschätzt werden. Da Killerzellen nach Aktivierung eine deutlich erhöhte Koexpression des HLA-DR-Markers zeigen, gibt die Zahl solcher Zellen einen Einblick in ihren funktionellen Zustand. Erfasst werden über diesen Marker alle Killerzellen, die CD56 exprimieren und damit sowohl als auch MHC-unrestringierte zytotoxische T-Lymphozyten. Die Bestimmung dieses Markers erlaubt daher eine Einschätzung der Zytotoxizitätsfunktionen der Killerzellen, kann jedoch einen NK-Zell-Zytotoxizitätstest nicht, oder zumindest nicht gänzlich, ersetzen. Fazit: Die hier dargestellten Immunprofile erleichtern eine gezielte, krankheitsbezogene Immundiagnostik. Sie dienen der Erkennung von Immundysbalancen, sind unerlässlich für die weitere diagnostische Abklärung bei einer Vielzahl von Grunderkrankungen (Infektanfälligkeit, chronisch-entzündliche Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Tumor erkrankungen), geben wichtige Hinweise zur Prog nose, z.b. bei Autoimmun- und Tumorerkrankungen, sind für eine individuell optimierte Immuntherapie unabdingbar und für die Beurteilung einer jeglichen immunmodulatorischen Therapie erforderlich. In Anhängigkeit vom Ergebnis der immundiagnostischen Untersuchungen ergeben sich unterschiedliche Ansätze für die Immuntherapie, wie aus Abbildung 3 hervorgeht. Immunbiologisches Merkmal T-Zellen B-Zellen Helferzellen CD-8-(TS)-Zellen T-Zell-Aktivierung Killer-Zell-Aktivierung Immunmodulatorischer Ansatz Thymus, Zink Bronchovaxom, Ribomunyl, Splenuvocal Thymus, NAC, Thuja-Extrakt Isoprinosine, Copaxone, Zink Echinacea, Eleukokk, Artemisinin, Vitamin A Mistel, Biobran, Selen, Regacan, DHEA Mistel, Biobran, Herba Abrotani Abbildung 3

8 Kompetenzzentrum für komplementärmedizinische Diagnostik Diagnostic Center of Complementary Medicine Mineralstoffe Spurenelemente Schwermetalle Vitamine Fettsäureprofil Aminosäureprofil Säure-Basen-Haushalt kardiovaskuläre Risikofaktoren Hormone/ Neurotransmitter Immundiagnostik Nahrungsmittelunverträglichkeiten Candida-/ Schimmelpilz-Serologie Stuhldiagnostik

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