EBV Infektion. Diagnostik heute. Bachelorarbeit 1. fhg Zentrum für Gesundheitsberufe Tirol GmbH. FH-Bachelor-Studiengang Biomedizinische Analytik

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1 fhg Zentrum für Gesundheitsberufe Tirol GmbH FH-Bachelor-Studiengang Biomedizinische Analytik EBV Infektion Diagnostik heute Bachelorarbeit 1 VerfasserIn: Sabine Leist BetreuerIn: Dr. Maria Elisabeth Mustafa-Korninger Innsbruck, im Juli 2013

2 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung! 3 2. Material und Methoden! 4 3. Allgemeine Einleitung! Taxonomie! Aufbau und Genom! Epidemiologie! Übertragung! Pathogenese und Replikationszyklus! Reaktion des Immunsystems! Infektionsverlauf! Therapie! EBV-assoziierte Komplikationen und Erkrankungen! EBV-assoziierte maligne Erkrankungen! Diagnostik! Serologische Nachweismethoden! Erregernachweis/PCR! Immunhistologischer Nachweis! Nachweis zellulärer Immunität! Veränderungen anderer im Labor erhobener Befunde! Diskussion! Schlussfolgerung! Literatur! 23 2

3 1. Einleitung Der Einsatz molekularbiologischer Methoden für den Erregernachweis und die Verwendung von hochgereinigten oder rekombinant gewonnenen Antigenen zum Nachweis von spezifischen Immunglobulinen bei der Abklärung von Infektionserkrankungen konnte die Sensitivität und Spezifität labordiagnostischer Untersuchungen verbessern. Die infektiöse Mononukleose wird durch das humanpathogene Epstein Barr Virus (EBV) verursacht. Das Virus kann in menschlichen Zellen ein Leben lang persistieren, reaktivieren und Karzinome verursachen. Erstinfektionen können serologisch nur innerhalb eines definierten Zeitfensters eindeutig erfasst werden. Reaktivierte Infektionen, das Auftreten von Folgeerkrankungen oder die virusinduzierte Transformation von Zellen in Tumorzellen werden jedoch mit den Untersuchungstechniken, die in der Routine eingesetzt werden, nur unzulänglich erfasst. Der Erregernachweis mit molekularbiologischen Methoden eignet sich vor allem zur Bestimmung der Viruslast. Die Verwendung unterschiedlicher viraler Antigene für den Nachweis einer Infektion oder die Beurteilung des Immunstatus sollte von Alter, Anamnese, und klinischer Symptomatik der Patienten abhängig gemacht werden. Die Aussagekraft von Resultaten der Antikörperbestimmung wird durch die Verknüpfung mit anderen labordiagnostisch erhobenen Werten, wie zum Beispiel Veränderungen des peripheren Blutbildes oder eine Erhöhung der Transaminasen, verbessert. Ziel dieser Arbeit ist es, die neuesten Erkenntnisse über das Epstein Barr Virus durch eine Zusammenfassung der rezenten Literatur zu beschreiben. Dabei wird unter anderem auf Aufbau, Übertragung, Pathogenese, Replikation, Immunantwort und das onkogene Potential des Virus eingegangen. Weiters werden alle Untersuchungsmethoden, die zur Erfassung des Erregers oder zum Nachweis einer Immunantwort derzeit bekannt sind, beschrieben. Die Ergebnisse dieser Arbeit bilden die Grundlage für die retrospektive Auswertung serologischer Daten und die Entwicklung eines Algorithmus in der EBV Diagnostik. 3

4 2. Material und Methoden Ein Teil der Literatur wurde von Frau Dr. Mustafa-Korninger zur Verfügung gestellt, einiges auch aus Fachbüchern recherchiert. Im Internet wurde gezielt in der medizinischen Datenbank Pubmed und auf gesucht. Die Schlüsselwörter ergaben sich aus dem Ziel der Arbeit. Die Ergebnisse wurden anhand des Abstracts nach Relevanz selektiert. Verwendet wurde Literatur aus den Jahren 2000 bis Schlüsselwörter: ebv diagnosis, ebv infection,ebv algorithmus, ebv guidelines, epstein barr virus, life cycle ebv, replication ebv, latency ebv,ebv genome, laboratory tests ebv; 4

5 3. Allgemeine Einleitung Mit Hilfe elektronenmikroskopischer Untersuchungstechniken konnten Anthony Epstein und Yvonne Barr 1964 das Herpesvirus in kultivierten Burkitt-Lymphomzellen nachweisen [1]. Das Epstein-Barr-Virus (EBV) ist ein Erreger der infektiösen Mononukleose, die bei immunkompetenten Patienten in der Mehrzahl der Fälle inapparent verläuft. Diese Erkrankung wird auch Studentenkrankheit, Kissing Disease, Morbus Pfeiffer oder Pfeiffer sches Drüsenfieber genannt [1,2,3,4] und wurde 1968 von Werner und Gertrude Henle beschrieben. [9] 3.1 Taxonomie Das Epstein-Barr-Virus gehört zur Familie der Herpesviridae. Es wird als Humanes Herpesvirus 4 (HHV 4) bezeichnet und zählt zur Subfamilie der Gamma-Herpesviridae. Das Genus wird als Lymphocryptovirus bezeichnet. Das Wort Herpes leitet sich vom Griechischen ab: herpein - kriechen. [1] 3.2 Aufbau und Genom Das EBV ist ein doppelsträngiges DNA Virus mit einem Durchmesser von ungefähr 200 nm. Das Herpesvirus besteht aus einem isokaedrischen Kapsid, einer Hülle und dem Tegument. Das Tegument enthält regulatorische Proteine und ist der Raum zwischen Kapsid und Hülle (siehe Abb. 1). Das Kapsid besteht aus 162 Kapsomeren, die eine lineare, dicht gepackte Doppelstrang-DNA (dsdna) umgeben. Die Hülle des EBV enthält viruskodierte Proteine, die für den Zelltropismus und die Bindung an die Rezeptoren der Wirtszelle verantwortlich sind. [1] 5

6 Abb. 1: Struktur des Epstein Barr Virus. Quelle: Je nach Literatur enthält das in Abbildung 2 dargestellte Genom zwischen 164 kbp bis 186 kbp und hat repetitive und nicht-repetitive Abschnitte [1,4,9]. Bis jetzt sind 80 bis 100 virale Gene, die Proteine kodieren, beschrieben worden [1,6,9]. Das virale Genom kodiert mehrere mirnas (micrornas) [9], sowie Gene für latente Membranproteine (LMP) und für nukleäre Antigene (EBNAs) [1]. Zusätzlich enthält es zwei kurze, häufig exprimierte, nicht translatierte nukleäre RNAs, die durch die Gene, EBER 1 und EBER 2 kodiert werden [9]. Es sind zwei Subtypen des EBV beschrieben. Sie unterscheiden sich durch unterschiedliche Kodierung der nukleären Antigene. [3] 6

7 Abb. 2: Das Genom des Epstein Barr Virus. Quelle: ERM/ERM6_23/S sup Epidemiologie Einziger Wirt für das Epstein Barr Virus ist der Mensch. Primärinfektionen erfolgen üblicherweise bei Kindern und Jugendlichen. Weltweit sind über 95% aller Erwachsenen mit EBV infiziert. Subtyp 1 findet sich hauptsächlich in Europa und Südostasien, Subtyp 2 kommt gemeinsam mit Subtyp 1 in Afrika vor. Eine Infektion mit EBV kann proliferative Erkrankungen auslösen, die auch zu malignen Tumoren führen kann. [1,3,6,7,9] 7

8 3.4 Übertragung Die Übertragung von EBV erfolgt hauptsächlich über den Speichel als Kontakt- oder Tröpfcheninfektion. EBV ist hochkontagiös, die Inkubationszeit beträgt ungefähr 6 Wochen. In seltenen Fällen kann EBV bei Verabreichung von Blut, Blutprodukten und bei Organtransplantationen übertragen werden. [1] Ob eine Infektion auch durch Sexualkontakt möglich ist, ist noch nicht gesichert [2]. Gamma-Herpesviridae infizieren B-Lymphozyten und persistieren lebenslang. Es kann immer wieder zu einer Reaktivierung des Virus kommen, der während dieser Phase auch im Speichel ausgeschieden wird. [1] 3.5 Pathogenese und Replikationszyklus Das EBV infiziert die Epithelzellen und die B-Lymphozyten im Nasenrachenraum und führt zur Virusvermehrung oder Viruspersistenz in den B-Lymphozyten. Im lytischen Replikationszyklus erfolgt die Vermehrung des Virus in den B-Zellen. Die Virionen können über den Speichel wieder ausgeschieden werden. Mit Hilfe ausgewählter Proteine kann das Virus die infizierten B-Lymphozyten zur Proliferation anregen und die Differenzierung in Gedächtnis-B-Zellen bewirken. Latent infizierte B- Gedächtnis-Zellen verbreiten sich über das Gefäßsystem und können während der Erstinfektion im peripheren Blut nachgewiesen werden. Nach der Erstinfektion sinkt die Viruslast und das Virus ist in niedrigen Konzentrationen lebenslang im peripheren Blut nachweisbar. Während der Latenzphase wird kein infektiöses Virus gebildet, das Genom liegt zirkulär in Episomen im Zellkern der B-Lymphozyten vor. Es werden Latenz-assoziierte Transkripte exprimiert. Durch interne und/oder externe Stimuli kann es zu einer Reaktivierung kommen, der lytische Replikationszyklus wird initiiert und es werden erneut infektiöse Virionen gebildet. (siehe Abb. 3) 8

9 Abb. 3: Schematischer Ablauf einer EBV-Infektion und der Persistenz. Quelle: journals.cambridge.org/fulltext_content/erm/erm6_23/s sup004.htm Lytische Replikation Das virale Membranprotein Glykoprotein 350 (gp350) adsorbiert an den zellulären Komplement-Rezeptor CD21 (Cluster of Differentiation 21). Moleküle des Humanen Leukozyten Antigens (HLA) Klasse II fungieren als Korezeptoren und binden an das virale Membranprotein Glykoprotein 42 (gp42). [1] Neuere Daten beschreiben auch eine Bindung von gp350 an den Adhäsions- und Phagozytenrezeptor CD35 [8]. Epithelzellen tragen keinen CD21 Rezeptor und EBV wird mit Hilfe von Integrinen an die Zellmembran gebunden. Das Viruskapsid wird durch Endozytose in das Zytoplasma freigesetzt. Entlang der Mikrotubuli gelangt das Virus zu den Kernporen des Zellkerns. Die lineare DNA wird durch Kernporen in den Zellkern eingeschleust und durch Fusion der freien Enden zirkulär. Mit Hilfe der zellulären RNA-Polymerase II und den transkriptionsaktivierenden Tegumentproteinen werden Immediate-Early-Gene transkribiert, die die Transkription von Early- und Late-Proteinen steuern. Im Zytoplasma werden die produzierten mrnas translatiert und die betreffenden Proteine in den Zellkern zurück transportiert. 9

10 Dadurch wird die Genexpression von sehr frühen zu frühen Proteinen umgeschaltet. Early-Proteine (EA, Early Antigen) werden transkribiert, zu diesen gehört die virale DNA-Polymerase. Die virale DNA wird repliziert und Late-Proteine (VCA, Virus Capsid Antigen) transkribiert. Bei den Late-Proteinen handelt es sich hauptsächlich um virale Strukturproteine für den Aufbau des Kapsids und der Hülle. Die im Zellkern gebildeten neuen Kapside sprossen durch die Kernmembran und erhalten ihre erste Hülle. Diese Hülle geht vermutlich durch die Fusion mit der äußeren Kernmembran wieder verloren. Es lagern sich über 15 Tegumentproteine an das freigesetzte Nukleokapsid an. Durch einen zweiten Knospungsprozess in den Vesikeln des Trans-Golgi-Apparates erhält das Virus seine endgültige Hülle. Ein entsteht ein vollständiges, umhülltes Herpesviruspartikel, das sich in einem zellulären Vesikel befindet und über den Sekretionsweg freigesetzt wird. Die Virionen werden durch den Speichel wieder ausgeschieden oder können Zellen infizieren. [1] Latenz Man vermutet, dass in latent infizierten B-Lymphozyten das EBV Genom als extrachromosomale Minichromosomen, den Episomen, vorliegt. Eine Persistenz des EBV in infizierten naiven B-Zellen ist aufgrund der kurzen Lebensdauer der Lymphozyten nicht möglich. Um in diesen B-Lymphozyten länger persistieren zu können, induziert das EBV mit Hilfe Ausprägung bestimmter Gene die Proliferation der B-Zellen. Im Gegensatz zu der lytischen Replikation verwendet EBV für die episomalen Replikation die chromosomale DNA-Polymerase der Wirtszelle. Mit Hilfe des Latenzprogramms 3 (siehe Tabelle 1) kommt es durch die Ausprägung der nukleären Antigene (EBNA) und der latenten Membranproteine (LMP) zur Transkription zellulärer Gene und zur Proliferation der infizierten B-Zelle. [9] Diese B- Lymphozyten wandern in die Keimzentren der Lymphfollikel. Für die weitere Proliferation und Selektion der EBV-infizierten B-Zellen im Keimzentrum beginnt EBV mit dem Latenzprogramm 2 (siehe Tabelle 1). Im Lymphfollikel werden in diesen Zellen nur noch die viralen Proteine EBNA-1, LMP-1 und LMP-2A gebildet. LMP-1 imitiert kostimulierende Signale für die B-Zell-Proliferation, die normalerweise vom CD40-Rezeptor ausgehen. LMP-2A imitiert Signale, die physiologischerweise von membranständigen Antikörpern ausgehen. Mit Hilfe dieser Proteine täuscht EBV den infizierten B-Zellen Antigenkontakt vor, um weiter zu proliferieren und als Gedächtnis- B-Zellen differenzieren. Durch deren lange Lebensdauer kann EBV hier eine 10

11 lebenslange Persistenz etablieren. Zur Erhaltung des viralen Genoms wird nur noch EBNA-1 exprimiert. [9] Tabelle 1: Latenzprogramme in latent infizierten B-Zellen [9] Expressionsprofil Latenz 0 Latenz 1 Latenz 2 Latenz 3 virale Proteine LMP-2A EBNA1, EBERs EBNA1, LMP1, LMP2A LMP1, LMP2A, EBNA-LP, EBNA2, EBNA3A/B/C Infizierte B-Zellen werden üblicherweise durch die Signalwirkung der T-Zellen eliminiert. Durch die beschriebenen Latenzprogramme entgehen die infizierten B- Zellen der Immunantwort und können als EBV-positive Gedächtnis-B-Zellen weiter bestehen. [1] Reaktivierung Gelegentlich muss EBV in latent infizierten Zellen reaktivieren, um neue Viruspartikel zu bilden und einen neuen Wirt zu infizieren. Reife B-Zellen des Keimzentrums differenzieren zur Antikörperproduktion, bzw. reaktivieren Gedächtnis-B-Zellen durch Kontakt mit einem Antigen zu Plasmazellen. Durch die beteiligten Signalwege kommt es zu einer Reaktivierung des Virus. Der produktive Replikationszyklus wird aktiviert und neue Virionen werden gebildet. In der Mukosa finden sich Plasmazellen, die auf den Schleimhautoberflächen Immunglobuline sezernieren. Auf diesem Weg können die Virionen im Nasenrachenraum sezerniert und über den Speichel übertragen werden. [9] Virämie Bei Patienten mit Primärinfektion kann man 2 Wochen nach Infektionsbeginn EBV im peripheren Blut nachweisen. Der Höhepunkt der Viruslast ist nach Auftreten der ersten klinischen Symptome überschritten (siehe Abbildung 4). Nach einigen Wochen bis Monaten liegt die Viruslast bei immunkompetenten Patienten im peripheren Blut zwischen 1 bis 50 copies EBV DNA/1 Mio Leukozyten. Bei manchen Patienten kann es innerhalb eines Jahres nach Infektion zu einem nochmaligen Anstieg der Viruslast 11

12 im peripheren Blut kommen. Bei Patienten mit EBV-assoziierten Tumorerkrankungen steigt die Viruslast noch vor Auftreten der klinischen Symptomatik (siehe Abbildung 4). Ein Therapieerfolg zeigt sich auch durch das Sinken der Viruslast. [10] Jedoch schließt eine negative EBV-PCR im Plasma das Vorhandensein eines EBVassoziierten Tumors nicht aus [1]. Hochrisikopatienten wie Patienten nach Organtransplantation werden mittels quantitativer PCR Methoden überwacht, um EBV frühzeitig zu detektieren [10]. Abb. 4: Verlauf der Viruslast im Blut. Quelle: PMC /figure/fig2/ 3.6 Reaktion des Immunsystems Angeborene Immunantwort Bei Infektion regt das EBV die Synthese von Interferon, inflammatorischen Zytokinen wie Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α) und Interleukin-6 (IL-6) an. Interferon γ verursacht Fieber, Abgeschlagenheit und Kopfschmerzen. IL-10 fungiert als Gegenspieler von Interferon γ und vermindert die zytopathologischen Effekte. NK- Zellen dürften die Entstehung chronischer viraler EBV Infektionen verhindern. Diese werden während der Infektion vermehrt gebildet. Die Höhe der Vermehrung korreliert mit der Schwere der Erkrankung. [11] Erworbene humorale Immunantwort Sieben Tage nach Beginn der klinischen Symptomatik können bei der Mehrzahl der Patienten IgM Antikörper gegen das Viruskapsidantigen VCA nachgewiesen werden. Zeitgleich beginnt die Bildung von IgG Antikörpern, die gegen das Kapsidantigen 12

13 gerichtet sind und lebenslang nachweisbar sind. Nach ungefähr 3 Monaten können IgG Antikörper gegen das nukleäre Antigen EBNA nachgewiesen werden, das in allen EBV-infizierten Zellen exprimiert wird. Abbildung 5 zeigt den Verlauf der Antikörperbildung gegen die EBV-Antigene sowie die Viruslast. Einige Patienten verlieren diese Antikörper wieder bzw. bilden sie nie. [1,3] Antikörper gegen Early Antigene (EA) des EBV sind für die Abklärung einer Infektion nicht geeignet. Sie werden zur Bestätigung EBV-induzierter Tumore eingesetzt. Der Nachweis anderer spezifisch gegen Virusproteinstrukturen gerichteter Antikörper wird derzeit noch erforscht. Erworbene zelluläre Immunantwort Eine akute EBV-Infektion wir durch spezifische zytotoxische T-Zellen eingedämmt. Am Beginn der Infektion und während der lytischen Replikation wird die zelluläre Immunantwort vorwiegend durch CD8 positive T-Zellen gesteuert. Labordiagnostisch findet sich eine massive Vermehrung der CD8 positiven T-Zellen, die auch als Downey Zellen beschrieben werden. CD4 und CD8 positive T-Zellen, die spezifisch einige der Latenz 3-Proteine erkennen, halten die durch EBV angeregte B-Zell- Proliferation unter Kontrolle. Sie induzieren auch die Umschaltung von Latenzprogramm 3 auf 2. [9] 13

14 Abb. 5: Verlauf der EBV-spezifischen Antikörper und der Viruslast im Blut. Quelle: Infektionsverlauf Eine Erstinfektion im Kleinkindalter wird häufig nicht diagnostiziert, da sie meist symptomlos verläuft. Bei immunkompetenten Jugendlichen und Erwachsenen kann es zum Erscheinungsbild der infektiösen Mononukleose kommen. Die Erkrankung beginnt mit unspezifischen Symptomen wie Fieber, Halsschmerzen, Tonsillitis und Schwellung der Halslymphknoten. In 80 % der Fälle kommt es zu Erhöhung der Transaminasen, in Einzelfällen zu ausgeprägter Leber- und Milzbeteiligung. Charakteristisch ist die Vermehrung mononukleärer lymphatischer Zellen im peripheren Blut. Bei diesen mononukleären Zellen handelt es sich um aktivierte CD 8 positive T-Zellen. Die charakteristischen klinischen Symptome sind Ausdruck der massiven Immunantwort und der schnell expandierenden EBV-spezifischen T-Zellen. Da im Kindesalter diese Immunreaktion weniger ausgeprägt ist, wird die Erkrankung häufig nicht diagnostiziert. [9] Innerhalb von 2-6 Wochen heilt die Erkrankung in den meisten Fällen komplikationslos aus [1]. 14

15 3.8 Therapie Die Therapie beschränkt sich auf die Behandlung der Symptome [1,2,3,6,9]. Bei Haarleukoplakie (weiße Beläge am Zungenrand) kommt Aciclovir zur Anwendung [6,9]. Die Virusausscheidung kann durch antivirale Substanzen reduziert werden, verkürzt aber nicht die Dauer der Erkrankung [1]. Bei immunsupprimierten Patienten nach Transplantation werden in manchen Fällen der Einsatz des humanen monoklonalen Anti-CD20-Antikörper (Rituximab) oder die Gabe von CD8 positiven T- Zellen beschrieben [11]. Eine Impfung ist derzeit in Entwicklung [9]. 3.9 EBV-assoziierte Komplikationen und Erkrankungen Typisch ist in etwa % ein Arzneimittelexanthem nach Antibiotikagabe. In seltenen Fällen kann es zu neurologischen Symptomen wie z. B. Meningoenzephalitis, Radikulitis und in schweren Fällen zu Pneumonie, Anämie und Thrombozytopenie kommen. [1] Chronisch aktive EBV-Infektion (CAEBV) In sehr seltenen Fällen kommt es zur lebensbedrohlichen, chronisch aktiven EBV- Infektion (CAEBV). Diese tritt fast nur bei Kindern auf, die zuerst häufig wiederkehrende mononukleoseartige Symptome zeigen und innerhalb weniger Jahre Lymphome bilden. Auffällig ist eine hohe Viruslast im peripheren Blut und der hohe Titer gegen Kapsid- und Early-Antigene [9]. Zytotoxische T-Zellen und NK-Zellen kommen vermehrt vor, können jedoch die immer wiederkehrende Virusreplikation nicht verhindern. Die Sterblichkeit nach 4 Jahren liegt bei 40 %. [1] X-linked lymphoproliferative Erkrankung (XLP) Bei Trägern des rezessiv vererbten Defektes am XLP-Gen führt eine Infektion mit EBV zu einer defekten Aktivierung der zellulären Immunantwort. Durch eine Mutation in der Signalübertragung der T-Zellen kommt es zu massiver polyklonaler Vermehrung infizierter B-Zellen. Bei über 50 % der Erkrankten kommt es zu einer fulminant verlaufenden infektiösen Mononukleose mit hoher Letalitätsrate. Bei Überlebenden treten oft Lymphome und/oder eine Hypogammaglobulinämie auf. [1] 15

16 PTLD (Post-Transplantations-Lymphoproliferative Erkrankung) Immunsuppression bei transplantierten Patienten sowie bei HIV-Erkrankung können infolge der Verminderung von T-Zellen zu unkontrollierter EBV-Replikation führen, die eine massive Vermehrung von B-Zellen, eine Vermehrung von Plasmazellen oder die Bildung von Lymphomen verursacht. Kinder nach Organ-, Knochenmark- oder Stammzelltransplantation sind besonders gefährdet. [9] 3.10 EBV-assoziierte maligne Erkrankungen EBV ist nach WHO in der höchsten Karzinogenklasse (I) eingestuft [1,9]. Burkitt-Lymphom Das Burkitt-Lymphom ist ein aggressiver Tumor, bei dem klinisch drei Varianten unterschieden werden. Das endemische Burkitt-Lymphom tritt gehäuft bei Kindern in Äquatorialafrika auf. Malaria erhöht vermutlich das Risiko für eine Erkrankung. In der Literatur wird beschrieben, dass in % der Fälle von Burkitt-Lymphomen (maligne B-Zell-Lymphome [1]) EBV nachweisbar ist. [1,6] Das sporadische Burkitt-Lymphom findet man weltweit bei Kindern und jungen Erwachsenen. Das mit Immundefizienz assoziierte Burkitt-Lymphom findet man gehäuft bei an HIV Erkrankten. Allen gemeinsam ist eine reziproke Translokation zwischen dem Chromosom 8 und dem Chromosom 14 (t8;14) oder dem Chromosom 22 (t8;22). Diese Chromosomen kodieren die schweren und leichten Ketten der Immunglobuline. Chromosom 8 ist Träger des c-myc-onkogens und reguliert die Genexpression. Durch Translokation steuern die DNA-Kontrollsequenzen der Immunglobulin-Leicht- bzw. Schwerketten die c-myc-expression. Die Zellteilungsrate und die Apoptoseneigung der proliferierenden Zellen werden erhöht. In latent EBVinfizierten B-Zellen vermitteln einige virale Proteine einen Schutz vor Apoptose und B-Zellen, in der eine c-myc-translokation stattgefunden hat, können ungehindert proliferieren. Spontane Burkitt-Lymphome entstehen aus der Folge der Translokation ohne Hilfe vom EBV und sind viel seltener. [9] Nasopharynxkarzinom Hierbei handelt es sich um einen malignen, undifferenzierten Tumor der Epithelzellen des Naso- und Oropharynx [1]. Das Nasopharynxkarzinom kommt endemisch in der 16

17 chinesischen Bevölkerung Südostasiens und auch an der Nordküste Afrikas und in Grönland vor [9] und ist zu fast 100 % mit EBV assoziiert [1]. Die epithelialen Tumorzellen enthalten EBV-DNA in latenter Form. Sie exprimieren EBV-Proteine, wie z. B. LMP-1, die onkogenes Potential haben. Die geografische Verteilung lässt eine Beteiligung weiterer Umweltkarzinogene vermuten. [9] Hodgkin-Lymphom EBV-positive Reed-Sternberg-Zellen finden sich in etwa bei der Hälfte der Hodgkin- Lymphome. Diese exprimieren oft Proteine, die während des Latenzprogramms 2 aktiv sind. Reed-Sternberg-Zellen entstehen vermutlich aus defekten B-Zellen, die eliminiert werden sollten, aber durch kostimulierende Signale latenter Membranproteine immortalisiert wurden Jahre nach einer symptomatischen infektiösen Mononukleose steigen die Fälle von EBV-positiven Hodgkin-Lymphomen signifikant häufiger an. [9] Magenkarzinom Bei <10 % der Magenkarzinome findet man EBV-infizierte epitheliale Tumorzellen. [9] NK-/T-Zell-Lymphome In T-Zell-Lymphomen ist sehr selten EBV nachweisbar. [9] 17

18 4. Diagnostik Auch eine klinisch eindeutige Symptomatik der infektiösen Mononukleose muss labordiagnostisch bestätigt werden, da bei 5-10 % der Patienten eine andere Erkrankung vorliegen kann. Differentialdiagnostisch sind eine HIV-Primärinfektion sowie Infektionen mit Cytomegalievirus, humanem Herpesvirus 6, Adenovirus, Rötelvirus, Mumpsvirus, Influenza A und B Virus und Toxoplasmose gondii auszuschließen. [1] Tabelle 2 zeigt eine Übersicht über die derzeit vorhandenen Methoden. Tabelle 2: Diagnostische Nachweismethoden. Quelle: PMC497621/table/t1/ Serology Method Analyte, antigen, or substrate Comment IFA Cell lines like P3HR-1 and Raji Classical method; gold standard; highly specific; staging of EBV infections possible with a single serum sample Complement fixation reaction EIA, ELISA, or chemoluminescence with coated beads Blot techniques (Western blot analysis or line blot assays) IgG avidity determination, IFA, and/or ELISA or Western blot analysis Heterophile antibody agglutination Virus isolation Nucleic acid detection Lysate of EBV-transformed cell lines Lysate of EBV-transformed cell lines; EBV lysates; combination of lysates and recombinant proteins; recombinant proteins; synthetic peptides Lysate of EBV-transformed cell lines; EBV lysates; recombinant proteins; combination of lysates and recombinant proteins Titration of antibodies in the absence and presence of increasing amounts of urea or other chaotropic reagents Paul-Bunnell antigens; bovine erythrocytes Lymphoblastoid cell lines from patient lymphocytes Less sensitive, less specific; not widely used; staging of EBV infections not possible with a single serum sample Rapid, highly sensitive, suitable for automation; synthetic peptides as antigens less sensitive and less specific (due to cryptic epitopes in native molecules); with a single serum sample Highly specific; mostly a confirmatory method; staging of EBV infections possible with a single serum sample Rather special method used for confirmation of indeterminate results (Table 2) (antibodies in an acute EBV infecti on are of low avidity) Less sensitive, less specific; 10-50% of children <4 years of age do not produce heterophile antibodies Performed only in special laboratories; long-lasting test (up to 4-8 weeks) PCR Lymphocytes, plasma, serum, cerebrospinal fluid, tissue In situ hybridization, in situ PCR Tumor tissue; paraffin-embedded sections Method of choice if EBV-associated meningoencepahlitis (from cerebrospinal fluid) is suspected; used to detect virus load and reactivation Used to detect EBV-associated tumors Virus antigens, immunhistochemistry and immunocytology Tumor tissue; paraffin-embedded sections Used to detect EBV-associated tumors 18

19 4.1 Serologische Nachweismethoden Paul-Bunnel-Test Das Testprinzip beruht auf der Beobachtung der amerikanischen Ärzte John Rodmann Paul und Walls Willard Bunnel, dass heterophile Antikörper von Patienten mit infektiöser Mononukleose mit Pferde- und Rinder-Erythrozyten agglutinieren. Kinder unter 4 Jahren bilden häufig noch keine heterophilen Antikörper. In diesen Fällen ist der Test falsch negativ. [4] Nachweis spezifischer Immunglobuline Durch die Bildung spezifischer Immunglobuline kann die EBV-Infektion labordiagnostisch nachgewiesen werden. Für das Routinescreening werden ELISA (enzyme linked immuno assay) und CLIA (Chemilumineszenz-Immuno-Assay) verwendet. Zur Abklärung einer EBV-Infektion werden Antikörper gegen Viruskapsidantigene und nukleäre Virusproteine bestimmt. Bei ausgesuchten Fragestellungen, wie z. B. beim Nasopharynxkarzinom, werden auch die Bestimmung der Antikörper gegen Early Proteine (EA) und IgA-Antikörper gegen VCA eingesetzt. [3] Immunoblots eignen sich zur Bestätigung einer Infektion und um eine genauere Aussage über das Infektionsstadium zu treffen [4]. 4.2 Erregernachweis/PCR Für den quantitativen Nachweis von EBV werden real time PCR Methoden eingesetzt. Als Material können Vollblut, Serum, Plasma oder auch Leukozyten verwendet werden [3]. Die Primersequenzen müssen hochkonservierte Regionen des Virus erfassen. Bei kommerziell erhältlichen Tests werden unterschiedliche Primersequenzen und unterschiedliche Maßeinheiten verwendet, sodass die Testergebnisse nicht vergleichbar sind. Durch die hohe Sensitivität und Spezifität eignet sich der Erregernachweis zum Nachweis sowie für die Therapieüberwachung immun-supprimierter Patienten und bei EBV assoziierten Tumorerkrankungen. [10] 4.3 Immunhistologischer Nachweis Diese Methode wird verwendet, um EBV-assoziierte maligne Erkrankungen zu erkennen. [4] 19

20 4.4 Nachweis zellulärer Immunität Bei transplantieren Patienten mit PLTD ist der Nachweis der zellulären Immunität von Bedeutung. Hier werden Methoden wie Elispot, Multimertechnik oder intrazelluläre Zytokinfärbung angewandt. Diese sind aber noch nicht für die Routinediagnostik etabliert. [3] 4.5 Veränderungen anderer im Labor erhobener Befunde Blutbild Im Rahmen der Infektion kommt es zur Vermehrung CD8 positiver Lymphozyten, die im Differentialblutbild atypischen Lymphozyten entsprechen. Diese reaktiven Lymphozyten werden auch Downey Zellen genannt. [11] Transaminasen 80% der Patienten weisen am Beginn und während der Infektion erhöhte Werte bei der Bestimmung der Transaminasen, insbesondere der Alaninaminotransferase (ALAT) auf. [11] 20

21 5. Diskussion Pathogenese, Replikation, Immunantwort und das onkogene Potential des Epstein Barr Virus sind eingehend beschrieben. Der Einsatz molekularer Techniken ermöglicht es, bei gezielten Fragestellungen den Erreger und die Viruslast zu erfassen. Diese Techniken können aber nicht zwischen Viruslatenz, lytischer Replikation oder Reaktivierung des Virus unterscheiden. Auch die Transformation der infizierten Zellen in Tumorzellen kann nur durch aufwändige Testmethoden nachgewiesen werden, die für die Routinediagnostik nicht geeignet sind. Ebenso kann das Versagen der zellulären Immunantwort nur durch aufwändige Testmethoden erfasst werden. ELISA- oder CLIA-Methoden können Immunglobuline nur gegen bestimmte Virusproteine nachweisen, die Resultate können eine Diagnose einer akuten Infektion unterstützen, sind jedoch für die Abklärung EBV-assoziierter Folgeerkrankungen nicht ausreichend. 21

22 6. Schlussfolgerung Differentialdiagnostisch kann die infektiöse Mononukleose durch die Bestimmung spezifisch gebildeter Immunglobuline nachgewiesen werden. Für die Routinediagnostik wird derzeit die Bestimmung der Antikörper gegen VCA-IgG, VCA-IgM und EBNA-1-IgG empfohlen. Die zeitlich unterschiedliche Expression der viralen Antigene und die damit verbundene Antikörperbildung ermöglichen es, nicht immer alle Antikörper zu bestimmen, um eine Aussage treffen zu können. Unter Berücksichtigung des Alters des Patienten kann ein Nachweis von Antikörpern gegen das virale nukleäre Antigen (EBNA) genügen, um eine vorangegangene Infektion zu beweisen. Der Einsatz IgG- und IgM-spezifischer Antikörper gegen Viruskapsid-antigene sollte danach stufenweise erfolgen. Die Automatisierung und die kurze Analysenzeit unterstützt ein stufenweises Vorgehen. Für die Entscheidungsfindung können die Ergebnisse der Blutbildanalyse und der Bestimmung der leber-spezifischen Transaminasen mit einbezogen werden. Für immunsupprimierte Patienten und Gravide, sowie bei Verdacht auf Reaktivierung und dem Ausschluss eines EBVassoziierten Tumors sollte ein Erregernachweis durchgeführt werden. Eine stufenweise Diagnostik zur Abklärung einer infektiösen Mononukleose soll einen effizienten Einsatz der Antikörperbestimmungen bei gleicher diagnostischer Aussage sowie eine kostengünstigere Alternative darstellen. Dies soll in einer weiterführenden Arbeit überprüft werden. 22

23 7. Literatur [1]# Dörr, Hans W./Gerlich Wolfram H.: Medizinische Virologie. Stuttgart/New York: Georg Thieme, 2009, 2., komplett überarbeitete und erweiterte Auflage [2]# Hofmann, Friedrich/Tiller Friedich W.: Praktische Infektiologie. Heidelberg/ München/Landsberg/Frechen/Hamburg: ecomed Medizin, 2012, 3. überarbeitete und erweiterte Auflage [3]# Neumeister, Birgit et al.: Mikrobiologische Diagnostik. Stuttgart/New York: Georg Thieme, 2009, 2., vollständig überarbeitete Auflage [4]# Hess, Ralf D.: Routine Epstein-Barr Virus Diagnostics from the Laboratory Perspective: Still Challenging after 35 Years. In: Journal of Clinical Microbiology, 42(8), 2004, [5]# Thomas, Lothar: Labor und Diagnose. Frankfurt/Main: TH-Books Verlagsgesellschaft mbh, 2012, 8. Auflage, Band 2 [6]# Cohen, Jeffrey I.: Epstein-Barr Virus Infection. In: The New England Journal of Medicine Volume 343, Number 7, 2000, [7]# Stevens, Servi J.C. et al (2002).: Comparison of quantitative competitive PCR with LightCycler-based PCR for measuring Epstein-Barr virus DNA load in clinical specimens. In: Journal of Clinical Microbiology, 40(11), 2002, [8]# Ogembo, Javier G. et al (2013).: Human Complement Receptor Type 1/CD35 is an Epstein-Barr Virus Receptor. Author Manuscript [9]# Suerbaum, Sebastian et al.: Medizinische Mikrobiologie und Infektiologie. Berlin/Heidelberg/New York: Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2012, 7. Auflage [10]# Gulley, Margaret L./Tang, Weihua: Laboratory Assays for Epstein-Barr Virus- Related Disease. In: Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 10, No. 4, 2008, [11] Odumade, Oludare A./Hogquist, Kristin A./Balfour Jr., Henry H.: Progress and Problems in Understanding and Managing Primary Epstein-Barr Virus Infections. In: Clinical Microbiology Reviews, Vol. 24, No. 1, Jan. 2011,