Etablierung, Validierung und Standardisierung neuer durchflusszytometrischer Methoden

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1 Etablierung, Validierung und Standardisierung neuer durchflusszytometrischer Methoden Gregor Rothe Bremer Zentrum für Laboratoriumsmedizin GmbH & LADR GmbH MVZ

2 Methodische Grundlagen Signalwandler FSC FL nm FL nm FL nm SSC 488 nm PMT Laser 488 nm Zellen

3 Prinzip der korrelierten Zellanalyse Laser P r o b e PMT 2 PMT 1 Histogramm - eindimensional Fluoreszenz 2 Fluoreszenz Fl1-/Fl2+ Fl1-/Fl2- Dot Plot - zweidimensional Fl1+/Fl2+ Fl1+/Fl Fluoreszenz Fluoreszenz 1

4 Durchflusszytometrische Werkzeuge Materialien Peripheres Blut Knochenmark Bronchoalveolarlavage Liquor (vereinzelte) Lymphknoten Aszites etc. Färbungen Immunphänotypisierung CD-Marker Intrazelluläre Antigene Biochemische Färbungen RNA / DNA Enzyme

5 Grundlegende Methoden der Zytometrie Konzentrationsbestimmung von nur immunologisch erfassbaren Zellen (z.b. CD4/CD8 T-Zellen, CD34 Vorläuferzellen) Charakterisierung mikroskopisch nicht sicher einzuordnender Zellen (Linie, Reifung, Klonalität, Zählung unter Therapie) Erfassung krankheitsspezifischer Abnormitäten (T-Zellaktivierung, Anergie von Monozyten, Dysplasien, Funktionsstörungen)

6 Strategien zur Erweiterung des diagnostischen Repertoires Zertifzierte Tests Klinisch etablierte Methoden Klinische Forschung CD4+ T-Zellen ( Immunstatus ) CD34+ Vorläuferzellen HLA-B27 Restleukozyten in Blutprodukten CD38 auf T-Zellen HLA-DR auf Monozyten Integration in analytischen Prozess Leukämischer Blastenschub Minimale Resterkrankung Prämaligne Erkrankungen Angeborene Immundefekte CVID Cross-Match-Analytik Antigen-spezifische T-Zellen Multizentrische Validation von Assays Dendritische Zellen Allo- und Autoantikörper Basophilenaktivierung Prothrombotische Syndrome Transplantationsmonitoring Multi-Drug-Resistance Publikation von Protokollen Akkreditierung Konsensusbildung Optimierung und Proof of Principle

7 Klinisch getriebene Herausforderungen Zirkulierende endotheliale Progenitorzellen als Korrelate kardiovaskulärer Ereignisse Werner N et al., N Engl J Med 2005;353: Kinetik und Viabiliät zirkulierender Endothelzellen als prognostische Prediktoren bei Mammakarzinomen unter antiangiogener Therapei Mancuso P et al., Blood 2006;108: Therapie-assoziierte Veränderungen bei minimaler Resterkrankung nach kindlichen akuten lymphatischen Leukämien Gaipa G et al., Leukemia 2005;19:49-56 Komplexe Expressionsmuster als Korrelate der Myelodysplasie bei ungeklärten Zytopenien Kussick SJ et al., Am J Clin Pathol 2005;124: Diagnostische Charakterisierung von CD34+ Zellen bei niedriggradigen Myelodysplasien Ogata K et al., Blood 2006;108:

8 Klinische Validierung der Wirksamkeit diagnostischer Tests Hernandez JS et al. Arch Pathol Lab Med 2003

9 Probleme der klinischen Methodenetablierung an aktuellen Beispielen Charakterisierung prämaligner Veränderungen Myelodysplasie Klonale B-Zellproliferationen Klonale Gammopathien Basophilenaktivierung in der Allergiediagnostik Zirkulierende endotheliale Progenitorzellen Kardiovaskuläre Erkrankungen Inflammation Neovaskularisation bei Tumoren

10 Aberrante Expressionensdichten bei AML

11 Definition aberranter Phänotypen bei Myelodysplastischen Syndromen Van de Loosdrecht AA et al., Blood 2008

12 MDS-Score und Klinik Van de Loosdrecht AA et al., Blood 2008

13 Analyse von Reifung und Klonalität bei B-Zellen

14 MARGINAL ZONE CD19, CD20, CD22, CD79, sig, FMC7, bcl-2 (CD5, CD10, CD23, bcl-6 neg) NODAL MALT CLL CD19, CD20, CD23, sig+/-, CD5 (CD79 CD10, CD22, FMC7 neg) HCL CD19, CD20, CD22, sig++, CD11c, CD25, CD103 (CD5, CD10, CD23 neg) T LYMPHOMAS SEZARY CD3, CD2, CD5, CD4, CD7+/-(CD8 neg) LARGE CELLS ANAP LASTIC CD2, CD4, CD3+/-, CD30 PERIPHERAL CD2, CD3, CD5, CD4 ANGIOCENTRIC CD2, CD5, CD4 ou CD8, CD56 INTESTINAL CD3, CD7, CD103 BURKITT CD19, CD20, CD22, CD79, sig, CD10, DR, bcl-6 (CD5, CD23, Tdt neg) MANTLE ZONE CD19, CD20, CD22, CD79, CD5, CD43, bcl-1 (CD10, CD23 neg) FOLLICULAR CD19, CD20, CD22, CD79, sig, CD10 (CD5, CD23, CD43 neg) INTESTINAL OR LUNG MALT Follicular, mantle zone, marginal zone SLVL Circulating marginal zone cells CENTROBLASTIC or IMMUNOBLASTIC Large cell Lymphomas CD19, CD20,CD79, CD22++, CD79, CD10+/- (CD5 neg) Bene MC et al., ELN 2005 WALDENSTROM CD19, CD20, CD22, CD79 cig, FMC7 (CD5, CD10, CD23 neg) MYELOMA cig, CD56, CD45, CD38, CD138 (CD19, CD20, CD22 neg)

15 Prävalenz CLL-artiger monoklonaler B-Zell-Lymphozytosen Marti G et al., Br J Haematol 2007

16 Monoclonale B-Lymphozytose und Progression zu B-CLL Rawstron AC et al., NEJM 2008

17 Molekulare Pathogenese des Multiplen Myeloms Sirohi B and Powles R, Lancet 2004

18 Zytoplasmatische Klonaliätsanalyse bei Plasmazellen

19 Rawstron AC et al., Blood 2002

20 Aberrante Plasmazellen und Prognose bei MGUS und SMM Perez-Persona E et al., Blood 2007

21 Neoplastische Plasmazellen im KM bei Immunfixations-negativen Patienten Davies FE et al., Best Pract Res Clin Haematol 2002

22 Basophilenfunktion und IgE-vermittelte Immunantwort Kawakami T et al., Nat Rev Immunol 2002

23 Expression von CD63 und CD203c in der Analyse der Basophilenaktivierung Ebo DG et al., Clin Cytometry 2008

24 Diskordanz von Basophilenaktivierungstests deweck AL et al., Int Arch Allerg Immunol 2008

25 Monitoring der Desensibilisierung bei Wespengiftallergie Ebo DG et al., Clin Cytometry 2008

26 Sensitivität und Spezifität von Basophilenaktivierungstests Ebo DG et al., Clin Cytometry 2008

27 Endotheliale Progenitorzellen und postnatale Neovaskularisation Kawamoto A & Losordo DW, TCM 2008

28 Klinik zirkulierender endothelialer Progenitorzellen Reduziert bei aktiver rheumatoider Arthritis (Grisar J et al., Circulation 2005) Erhöht bei Sepsis und Korrelation zum Überleben (Rafat N et al., Circulation 2007) Gesteigert bei progredienten soliden Tumoren (Beerepoot LV et al., Ann Oncol 2004) Negative Korrelation zu kardiovaskulären Ereignissen bei KHK (Werner N et al., N Engl J Med 2005)

29 Antigene zur Erfassung zirkulierender endothelialer Zellen Strijbos MH et al., Br J Cancer 2008

30 Methodenvergleich zur Quantifizierung von CEC im peripheren Blut Van Craenenbroeck EMF et al., J Immunol Methods 2008

31 Methodenvergleich zur Quantifizierung von CEC im peripheren Blut Van Craenenbroeck EMF et al., J Immunol Methods 2008

32 Multidimensionale Gating-Strategien für die Detektion von CEC Jacques N et al., J Immunol Methods 2008

33 Zelluläre Diagnostik - Chancen und Limitationen - Privilegierter Bereich der Diagnostik In Haus -Adaptation von neuen Targets durch weit offene Analyseplattformen Vergütung des Messprinzips unabhängig vom diagnostischen Beitrag Regulativ und kommerziell bedrohter Bereich Akkreditierung fordert dokumentierten klinischen Nutzen IVD-Richtlinien fordern Assayvalidierung für hausübergreifenden Testeinsatz Indikationsspektrum im Umbruch begriffen Die gesteigerte Sensitivität der Erkennung pathologischer Veränderung definiert Herausforderungen an die Klinik Komplexe Methoden erfordern verstärkte Anstrengung an die Standardisierung, Validierung und Effektivitätsbeurteilung von Testsytemen

34 Professionalisierung der Zellulären Diagnostik Labororganisation Strukturierte Testimplementation Akkreditierung Befundinformation Nachvollziehbare Befundung Transparenz Präanalytik Probenidentifikation Stabilisierung Testformate Biophysikalische Kalibration Objektive Datenextraktion Prozessierung Prozesssicherheit Dokumentation