Direkter ex vivo Nachweis autoreaktiver T- Helferzellen bei Patienten mit progressiver systemischer Sklerose (PSS)

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1 Aus der Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie der Medizinischen Fakultät Charité Universitätsmedizin Berlin DISSERTATION Direkter ex vivo Nachweis autoreaktiver T- Helferzellen bei Patienten mit progressiver systemischer Sklerose (PSS) zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr. med.) vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité Universitätsmedizin Berlin von Hans Martin Rothe aus Bautzen

2 Rothe, Hans Martin: Direkter ex vivo Nachweis autoreaktiver T- Helferzellen bei Patienten mit progressiver systemischer Sklerose (PSS) / Hans Martin Rothe. Als Ms. gedr.. Berlin : dissertation.de Verlag im Internet GmbH, 2008 Zugl.: Charité Universitätsmedizin Berlin, Diss., 2008 ISBN Gutachter: 1. Prof. Dr. med. M. Worm 2. Prof. Dr. med. N. Hunzelmann 3. Prof. Dr. J. Sieper Datum der Promotion: Bibliografische Information der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über < abrufbar. dissertation.de Verlag im Internet GmbH 2008 Alle Rechte, auch das des auszugsweisen Nachdruckes, der auszugsweisen oder vollständigen Wiedergabe, der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen, auf Datenträgern oder im Internet und der Übersetzung, vorbehalten. Es wird ausschließlich chlorfrei gebleichtes Papier (TCF) nach DIN-ISO 9706 verwendet. Printed in Germany. dissertation.de - Verlag im Internet GmbH Pestalozzistraße Berlin URL:

3 Inhaltsverzeichnis III I. Einleitung... 1 I.1. Das gesunde Immunsystem... 1 I.1.1. Gliederung des Immunsystems... 1 I.1.2. Antigene führen zur Aktivierung von T- Zellen... 2 I.1.3. Antigene führen zur Aktivierung der B- Zellen und Produktion von Antikörpern. 3 I.1.4. Differenzierung von naiven CD4 + T- Zellen zu Effektor- oder Gedächtniszellen.. 3 I.1.5. TH1 / TH2 Dichotomie... 4 I.1.6. Die Differenzierungsantigene (CD- Moleküle)... 5 I CD I CD I CD45 Isoformen... 6 I CD I CD I.1.7. Zytokine... 9 I.1.8. T- Zelltoleranz I.2. Sklerodermie I.2.1. Epidemiologie und Klinik I.2.2. Die Pathologie der Sklerodermie I Pathophysiologische Bedeutung der Apoptose I Die Sklerodermie zeigt HLA Assoziationen I.2.3. Therapie der PSS I.2.4. Sklerodermie eine T- Zell vermittelte Autoimmunerkrankung? I.2.5. Die Autoantigene Scl-70 und CENP-B I Das Autoantigen SCL-70 = Topoisomerase I I Das Autoantigen Centromeric Protein B (CENP-B) I.3. Herleitung der Aufgabenstellung II. Materialien und Methoden II.1. Allgemein verwendete Materialien und Geräte II.2. Patienten und gesunde Spender II.3. Zellpräparation II.3.1. Bestimmung von Zellzahlen II.3.2. Isolierung von PBMC aus peripherem Blut II.3.3. In vitro Stimulation von Vollblut II Stimulation II Eingesetzte Antigene II Erythrozytenlyse und Fixieren der Zellen II.4. Fluoreszenzeigenschaften von Zellen und deren methodische Nutzung II.4.1. Fluoreszenz II.4.2. Immunfluoreszenzfärbung von Zellen II Extrazelluläre Färbung auf PBMC II Extra- und intrazelluläre Färbung von fixierten und permeabilisierten Zellen II Verwendete Antikörper und Farbstoffe II Das Prinzip der Durchflusszytometrie II.4.3. Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS) II.5. Magnetische Zellsortierung (MACS) II.6. Analyse der Lymphozytenverteilung II.7. Identifizierung autoreaktiver TH- Zellen II.8. Isolierung antigenspezifischer CD TH- Zellen II.8.1. Stimulation... 31

4 IV Inhaltsverzeichnis II.8.2. Sortierung II.8.3. Herstellung von nicht teilungsfähigen PBMC II.8.4. Kultivierung der sortierten antigenspezifischen TH- Zellen II.8.5. Erneute Antigenstimulation nach 2 Wochen II.8.6. Restimulation und Analyse der Spezifität der expandierten TH- Zellen II.8.7. CFDA Markierung II.8.8. Einfrieren von Zellen II.9. Auswertungen II.9.1. Auswertung der durchflusszytometrischen Daten II Setzen der Analyseregionen II Setzen der Analyseregionen für die Oberflächenanalysen: II.9.2. Statistische Auswertung III. Ergebnisse III.1. Vergleich der Lymphozytenverteilung von PSS- Patienten und Normalpersonen III.1.1. Die Verteilung verschiedener T- Lymphozytenpopulationen III Das Verhältnis von CD4 + zu CD8 + T- Lymphozyten bei Patienten und NP III Die Verteilung von naiven und Gedächtnis- CD4 + T- Lymphozyten III Die Verteilung der Subpopulationen innerhalb der CD8 + T- Lymphozyten III.1.2. Verteilung verschiedener B- Lymphozytenpopulationen III Verteilung von CD19 + B- Lymphozyten III Verteilung naiver- (IgD + /CD27 - ), Gedächtnis- B- Zellen (IgD - /CD27 + ) und CD20 - /CD27 ++ Plasmablasten III.1.3. Verteilung der NK- Lymphozyten III.2. TH- Zellreaktivitäten auf Modellantigene III.2.1. Antigen spezifische Stimulationen mit CMV, EBV und TT III Extrazelluläre Ausprägung von CD69 nach Stimulation mit CMV, EBV und TT III Koexpression von CD69 / IFNγ nach Stimulation mit CMV, EBV und TT III Koexpression von CD69 / TNFα nach Stimulation mit CMV, EBV und TT III Koexpression von CD69 / IFNγ / TNFα nach Stimulation mit CMV, EBV und TT III Zusammenfassung III.3. Detektion autoreaktiver TH- Lymphozyten III.3.1. Definition einer spezifischen TH- Zellreaktion III.3.2. IFNγ produzierende autoreaktive TH- Zellen III.3.3. TNFα produzierende autoreaktive T- Zellen III.3.4. IFNγ und TNFα produzierende autoreaktive T-Zellen III.3.5. Abhängigkeit der Reaktivitäten von der Therapie III.4. Generierung Antigen spezifischer TH- Zelllinien III.4.1. Generierung einer Tetanustoxoid spezifischen TH Zelllinie III Auswahl des Blutspenders III Aussaat der Zellen und Kultur III Entwicklung der Zellzahlen III Spezifitätsprüfung der Zelllinie III.4.2. Generierung einer CENP-B spezifischen TH- Zelllinie III Auswahl des Spenders III Stimulation, Sortierung und Aussaat der Zellen III Restimulation und Spezifitätsprüfung nach 4 Wochen Kultur IV. Diskussion... 67

5 Inhaltsverzeichnis V IV.1. Prinzipielles zur Auswahl der Untersuchungsparameter IV.2. Therapieeffekte und Patientenauswahl IV.3. Oberflächenanalysen IV.3.1. Oberflächenanalysen von T- Zellen IV.3.2. Oberflächenanalysen von B- Zellen IV.3.3. Oberflächenanalysen von NK- Zellen IV.4. Identifizierung antigenreaktiver TH- Zellen mittels intrazellulärer Färbung der exprimierten Zytokine - methodische Kritik IV.4.1. Intrazelluläre Zytokinexpression nach Modellantigenstimulation IV.4.2. Nachweis autoreaktiver T- Zellen mittels intrazellulärer Zytokinfärbung methodische Kritik IV.4.3. Autoreaktive TH- Zellen sind bei PSS- Patienten und bei Normalpersonen nachweisbar IV.5. Sortierung von lebenden CD154 + TH- Zellen IV.5.1. Methodenkritik an Sortierung und Kultur IV.5.2. Generierung der CENP-B spezifischen Zelllinie V. Zusammenfassung VI. Abkürzungsverzeichnis VII. Referenzen VIII. Danksagung IX. Erklärung X. Lebenslauf... 98

6

7 V. Zusammenfassung 81 V. Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals direkt autoreaktive T-Helferzellen bei Sklerodermiepatienten aber auch bei Normalpersonen aus Vollblut nachgewiesen. Die Patienten wurden entsprechend des Nachweises von Antikörpern gegen CENP-B und Scl-70 (Topo-I) in 2 Gruppen eingeteilt. Nach Antigenstimulation wurde mittels durchflusszytometrischer Methoden Aktivierungsmarker und die Zytokinproduktion direkt auf Einzelzellniveau untersucht. Hierbei wurden die Parameter CD69, IFNγ und TNFα gemessen. Die Methode zur Isolierung von CD antigenspezifischen TH-Zellen wurde im Verlauf der Arbeit entwickelt und mit dieser wurde eine TT spezifische TH-Zelllinie generiert. Erstmals wurden auch direkt CENP-B spezifische CD154 + TH-Zellen isoliert und kultiviert. Der Nachweis der Antigenspezifität nach Restimulation gelang jedoch im Rahmen der Arbeit noch nicht. Im zweiten Teil der Untersuchungen wurden die Reaktivitäten von NP und Patienten auf die sog. Recallantigene CMV, EBV und Tetanustoxoid geprüft. Die Reaktivitäten auf die Virusantigene waren in allen 3 untersuchten Kollektiven in der Tendenz erwartungsgemäß stärker als auf den TT-Stimulus. In den Detailbetrachtungen fanden sich Hinweise auf unterschiedliche Reaktivitäten zwischen den Gruppen. Eindeutige Schlüsse ließen sich aus den vorliegenden Daten nicht ableiten, jedoch spricht einiges dafür, dass CMV und EBV bei der Ausbildung einer Autoimmunreaktion bei PSS- Patienten eine Rolle spielen könnten. Eine allgemeine Veränderung der TH-Zellreaktivitäten ließ sich bei den PSS- Patienten im Vergleich zu den NP nicht eindeutig feststellen. In einem dritten Untersuchungsteil wurde die Verteilung verschiedener Lymphozytensubpoulationen anhand von Oberflächenmarkern analysiert. Die Experimente erbrachten weit gehend Ergebnisse, wie sie von verschiedenen Autoren vorbeschrieben waren. Eine Verminderung der NK-Zellpopulationen und die veränderte CD4/CD8 Ratio waren bereits bekannt. Die B-Zellhomöstase scheint bei der Sklerodermie hingegen im Wesentlichen unbeeinträchtigt. Es finden sich weder in den vorliegenden Daten noch in der Literatur hierzu aussagekräftige Hinweise.

8 82 V. Zusammenfassung Moderne Durchflusszytometrie ermöglicht es, Zellen direkt ex vivo nachzuweisen und funktionell zu charakterisieren. Sie ist eine wichtige Methode, um die immunologischen Prozesse bei Erkrankungen, wie hier am Beispiel der Sklerodermie gezeigt wurde, darzustellen. Ein Teil der in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Ergebnisse führten zur Entwicklung einer Methode mit deren Hilfe antigenspezifische T-Zellen anhand ihrer CD154- Expression isoliert und kultiviert werden können. Diese Methode wurde in der Folge patentiert und von Frentsch et al veröffentlicht.

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