Stand der Immunphänotypisierung von Leukozyten

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1 Stand der Immunphänotypisierung von Leukozyten Konsequenzen für die Ringversuche C. Thomas Nebe Universitätsklinikum Mannheim

2 Vorkenntnisse Hämatopoese Knochenmark Akute Leukämien Akute Leukämien Lymphknoten Thymus Knochenmark Reifungsgrad Lymphome Blut Linienzugehörigkeit

3 Vorkenntnisse

4 Immunphänotypisierung: Welche Zellen? Lymphozyten Neutrophile Eosinophile Monozyten Dendritische Zellen Basophile Thrombozyten Erythrozyten Blasten

5 Wanderungsverhalten Erys Neutros Lymphs

6

7 Einflussgrössen

8 Welche Krankheiten? Primäre Immundefekte SCID Di George Bruton CVID WAS CGD CHS Hiob LAD Sekundäre Immundefekte Viren!!! (HIV, EBV, CMV...) Sepsis Medikamente Immunsuppressiva Chemotherapie Antibiotika Bestrahlung Ernährung

9 Virusinfektion

10 ... und ihre Folgen

11 The Power of the Immune System P = Leistung U = Spannung (Zellfunktion) I = Stromstärke (Zellzahl) Untersucht wird bisher aber nur die Zellzahl!

12 Welche Krankheiten? Akute Leukämien C-ALL B-ALL T-ALL Seltene Formen AUL (biphänotypisch) AML M0 AML M4/5 AML M6 AML M7 (Multiples Myelom) M. Hodgkin Lymphome (NHL) B-NHL CLL (> 90% der Proben) Mantelzell-Lymphom (MZL) Prolymphozytenleukämie (B- PLL) Haarzellen-Leukämie (HZL) Immunozytom (LPIZ) T-NHL Sezary-Syndrom (Myc. Fung.) Prolymphozyten-Leukämie (T- PLL) LGL-Leukämie NK-Zellen LGL-Leukämie

13 Welche Indikationen? Differentialzellbild Korrekte Zuordnung (CD14 / Monozyten) Angeborene Immundefekte (selten) Lymphozyten Granulozyten (CGD, LAD...) Erworbene Immundefekte (häufig) Konzentration (CD4 / µl) Funktionszustand (HLA-DR-Expressionsdichte auf Monozyten) Autoantikörper gegen Zelloberflächen Unfixierte (!!) Thrombozyten (ITP), Neutrophile, Lymphozyten

14 Welche Indikationen? Leukosen: Reaktiv, dysplastisch oder maligne? Akute Leukämien (ALL vs AML, ALL-Typ, AML-M0, M7) Leukämische Lymphome (CLL ja/nein, MZL, HZL, FL Chronisch myeloproliferative Erkrankungen (j/n, Blasten) Myelodysplasie (ja/nein, Blastenanteil) PNH (GPI-Defizienz) DD Hämolytische Anämie DD Aplastische Anämie Progenitorzellen (CD34) Leukapheresezeitpunkt Apherisat

15 Welche Konsequenzen? Angeborene Immundefekte (selten) Stammzell-Transplantation Erworbene Immundefekte (häufig) Steuerung der Immunsuppression Leukosen Leukämie: Auswahl der Chemotherapie Resterkrankung Lymphom: Lokal: Bestrahlung, Systemisch: Chemotherapie Resterkrankung (anti-cd20), Steuerung der Immunsuppression (Fludarabin) CMPE: Blastenschub? Therapieänderung Myelodysplasie: Blasten? Supportiv oder Chemotherapie PNH Beobachtung oder Transplantation Autoantikörper Immunsuppression

16 Welche Informationen? Expression eines Antigens Anwesenheit (z.b. PNH, HLA-B27) Expressionsmuster (Kombination von Antigenen bei Leukämien) Expressionsdichte eines Antigens Verminderte Expression HLA-DR auf Monozyten (Immunparalyse) z.b. CD5, CD7 bei T-NHL, CD22 bei B-NHL z.b. CD71, CD11b/CD16, Laktoferrin bei MDS Überexpression CD10, CD34, TdT, MPox bei akuten Leukämien CD19 u.a. bei Haarzellenleukämie HLA-DR auf Monozyten (Virusinfektion) Zellkonzentration T-Helfer-Zellen (CD4 / µl) Progenitorzellen (CD34 / µl)

17 Immunphänotypisierung B-Zelle T-Zelle TCR CD3 -FITC TCR CD3 -FITC CD4 -PE Orangefluoreszenz T-Helfer-Zelle 10 1 CD4+ CD3+4+ CD3+ MHC II-Rezeptor CD4 -PE Anwesenheit e. Antigens CD3 -FITC Grünfluoreszenz Häufigkeit [n] nein ja Fluoreszenzintensität [rel.e.]

18 Reifung und Antigenexpression Neutrophile B-Zellen Antigendichte Häufigkeit [n] Fluoreszenzintensität [rel.e.]

19 Immunologische Kriterien der Abnormalität Antigenmuster Aberrante Expression Überexpression Asynchrone Expression Fehlende Expression

20 Leukämie- diagnostik: Ein Zusammenfügen von Mosaiksteinen

21 Zählen, aber wie? Triple-,, Dual- oder Single-Platform? 3 CD4/µl = CD4 x %Ly x WBC 2 CD4/µl = %CD4 x WBC 1 CD4/µl WBC: 3 Neubauerkammer 2 Hämaautomat 1 Beads & Flow

22 Einflussgrössen Durchflußzytometer (Threshold, Kompensation) Waschen (RPM Kühlzentrifuge, Absaugen) Antikörper (HLDA-Workshop, Konjugat) Lysereagenz (NH 4 Cl, Essig-, Ameisensäure) Hämatologiegerät (dual platform) Zählpartikel (single platform, Mischen, Pipette) Qualität der MTLA (Ausbildung A) Qualität des Befunders (Aus- und Weiterbildung B)

23 Laborbefundung: Zahlen oder Interpretation? Bericht A CD1 0% CD2 75% CD3 70% CD4 40% CD5 75% CD8 30% CD10 0% CD14 5% CD16 85% CD19 10% CD38 8% CD56 5% CD103 0% CD2005 0,002% oder Bericht B Fragestellung Lymphozytose, cervikale LK, NHL? Untersuchungsmaterial Kleines Blutbild (WBC, RBC, Indices, PLT) Differentialblutbild (Neu, Eo, Baso, Mono, Ly) Immunphänotypisierung (T-, B, NK, CD4, CD8, CD4/8, kappa/lambda) Funktionstests (entfällt) Morphologie (Foto) (Deutliche Vermehrung viraler Reizformen) Beurteilung (Antwort) Reaktives Bild einer Virusinfektion, kein Hinweis auf NHL

24 Analytischer Prozess Anforderung Diagnose, Behandlung, klinische Fragestellung Blutentnahme Antikoagulans, Tageszeit, körperliche Belastung Transport Zeit, Temperatur Probe Auswahl korrekter Testansatz, Gerinnsel, Vitalität? Mischen, Pipettieren, Zellisolierung, Lyse&Waschen Reagenzien Antikörper (Klon), Konjugation Messung Kalibration, Prozentwerte, Absolutwerte Lage der Punktwolken, Fluoreszenzintensität Datenanalyse Light Scatter Gating, Marker/Regionen schwache/helle Populationen (techn. Validation) Befundbericht Nachdifferenzierung Referenzbereiche Plausibilität (medizinische Validation) Interpretation Ringversuch Akkreditierung

25 Interne Qualitätskontrolle Kontrollmaterial (Inter-Assay-Präzisionskontrolle) Blinde Mehrfachmessung eines Patienten Levy-Jennings Frischblut bekannter Spender Gerätevergleich (Doppelmessung) Vorwertvergleich Vergleich DiffBB (Mikroskop, Hämatologiegerät)

26 Welches RV-Material? Latexpartikel Stabilisiertes Kontrollblut Fixiertes Humanblut Lyophilisierte Zellen Natives Humanblut (EDTA) Spender Patienten Modifiziertes Humanblut (Abreicherung, Zellinien) Ausstriche Fotografien Datenträger

27 Ringversuche: Wie detailiert? Leukozyten Lymphozyten T-, B-, NK-Zellen CD4, CD8 CD4+CD45RA, CD45RO CD4+45RA+62L+ CD4+45RO+ CMV+ Befundinterpretation?

28 Kosten Immunphänotypisierung Je Antigen 10 CD4 / CD8 20 T, B, NK, CD4/8 70 NHL-Panel 200 Akute Leukämie 350 Rechtfertigt die Aussagekraft die Kosten? Kostenanalyse Blutausstrich Reagenzien 1 1,00 1,00 MTA-Zeit 0,1 60,00 6,00 Akad-Zeit 0,25 75,00 18,75 Transport - 25,75 Erlös 0,40 Gewinn - 25,35 Kostenanalyse Lymphozytentypisierung Antikörper: 7 5,00 35,00 MTA-Zeit 0,5 60,00 30,00 Akad-Zeit 0,25 75,00 18,75 Transport 25,00 108,75 Erlös 70,00 Gewinn - 38,75 Kostenanalyse KM-Zytologie Reagenzien 1 5,00 5,00 MTA-Zeit 0,5 60,00 30,00 Akad-Zeit 0,5 75,00 37,50 Transport - 72,50 Erlös 30,60 Gewinn - 41,90 Kostenanalyse Leukämietypisierung Antikörper: 35 5,00 175,00 MTA-Zeit 2 60,00 120,00 Akad-Zeit 0,5 75,00 37,50 Transport 25,00 357,50 Erlös 35 12,80 448,00 Gewinn 90,50 14 Jahre Thomas Nebe ca Patienten ca Typisierungen ca. 3,5 Mio

29 Kosten Ringversuch Vortypisierung Spender 500 Frische Spende 150 An- bzw. Abreicherung 2000 Abfüllung, Verpacken 500 Expressversand 15 Kühlbehälter 30 Rechtfertigt die Aussagekraft den Aufwand? (geschätze Kosten)

30 Quo vadis? Technisch Mehrfarben Automatisierte Clusteranalyse Automatisierung (CD4-, CD34-Zählung) Inhaltlich Funktionsuntersuchungen Zytokinsekretion Apoptose Degranulation Chemotaxis / Phagozytose / oxidativer Burst Antigenspezifität der T-Zellen

31 Fazit Immunphänotypisierung Entscheiden Sie selbst: Die Immunphänotypisierung von Immundefekten und hämatologischen Neoplasien ist... A)... eine komplexe Spezialdiagnostik mit manueller Probenvorbereitung, Messung und Expertenbefundung oder B)... eine automatisierte Zählung von CD4-Zellen bei HIV- Infektion oder CD34-Zellen bei Stammzelltransplantation. Ringversuch: Abfrage von Zahlen oder Befunden?