Diagnose Brustkrebs im Urin. Elmar Stickeler Klinik für Gynäkologie und Geburtsmedizin Uniklinik RWTH Aachen
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- Sarah Hummel
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1 Diagnose Brustkrebs im Urin Elmar Stickeler Klinik für Gynäkologie und Geburtsmedizin Uniklinik RWTH Aachen
2 mirnas als Signaturen für Malignome micro RNAs Definition und biologische Funktionen kurze, hoch konservierte, nicht kodierende RNAs hochspezifische, post-transkriptionale Genregulation, insbes. Gen-Silencing Mechanismus: - mirna-bindung an 3 -UTR der mrna von Zielgenen - partielle Komplementarität Translationshemmung - vollständige Komplementarität Degradation der Ziel-mRNA Mack, Nature Biotechnology 2007
3 mirnas als Signaturen für Malignome mirnas Biogenese - genomisch kodiert - Transkription durch RNA-Polymerase II + III - Primär-miRNA (pri-mirna) nt, prozessiert in Komplex aus DROSHA (RNAse II) + dsrna-bindeprotein DGCR8 (Pasha) nt precursor mirna (pre-mirna) hairpin - Cytoplasma Dicer RNAse III Maturation in nt ds-mirna - Interaktion Dicer und dsrna-bindeprotein TRBP Entwindung zu SSmiRNA - Aufnahme mature mirna in RNP-Komplex (mirnp) RISC Aktion an Ziel-mRNA RISC = RNA induced silencing complex thefutureofthings.com
4 mirnas als Signaturen für Malignome mirna - Expressionsmuster - gewebsspezifisch, in Abhängigkeit von Entwicklung und Physiologie - Lokalisation: innerhalb oder außerhalb proteinkodierender Genregionen - mirnas mit eigenen Promotoren - wenige mirnas in Clustern zur gemeinsamen Transkription mirna-expressionsprofile : KLASSIFIZIERUNG von malignen Tumoren PRÄDIKTION und PROGNOSE Vergleich Normal- und Tumor globale Veränderungen Expression (selektierte mirnas heatmap, t-test-score)
5 mirnas als Signaturen für Malignome Alterationen der mirna Prozessierung in Tumorzellen Tumorzellen: Downregul./Verlust Tumorsuppressor-miRNAs Akkumulation onkogener mirnas Upregulation onkogener mirnas: genomische Amplifikation, aktivierende Mutationen, Verlust epigenetischen Silencings transkriptionaler Repression Downregulation verminderte mirna-biogenese inaktivierende Mutationen reduzierte Expression Faktoren des mirna-processing (DROSHA) XPO5-Mutation (kein mirna-export) RISC = RNA induced silencing complex
6 mirnas als Signaturen für Malignome mirna und Tumor-assoziierte Signalwege (a) mirnas als Tumorsuppressoren oder Oncogene (b) Regulation von tumorassoziierten Zielgenen (c) Zusammenwirken zweier mirnas mit tumorrelevanten Effekten veränderter Genexpression (d) MYC-Onkogen reprimiert Tumorsuppressor-miRNAs oder aktiviert onkogene mirnas mit konsekutiver Beeinflussung verschiedener Signalwege (e) p53 als Regulator diverser Tumorsuppressor-miRNAs, MDM2 reguliert durch mirna-aktivierte feedworward loops. Onkogene mirnas reprimieren p53.
7 mirnas als Signaturen für Malignome mirnas mit tumorbiologischer Relevanz
8 mirnas als Signaturen für Malignome mirnas und Mammakarzinom
9 mirnas als Signaturen für Malignome mirna-expressionsmuster und Tumorprogression - stadienabhängige Alterationen - stadienabhängige Up- und Down-regulation div. mirnas switch bei let-7d, mir-210, mir- 221 von Down- zu Up-regulation (DCIS)
10 mirnas als Signaturen für Malignome Tumorbiologische Bedeutung der mirna beim Mammakarzinom
11 mirnas als Signaturen für Malignome Subtypen-spezifische mirna Expressionsmuster beim Mammakarzinom Intrinsic Subtypes Normalgewebe DCIS ER+/HER2- ER+/HER2+ HER2+/ER- Triple negativ (TNBC) Brustkrebszelllinien (Hirschfeld...Stickeler, submitted)
12 Zirkulierende mirna Sezernierung von mirna Molekülen zirkulierende mirnas Extrazelluläre mirna sehr heterogen: Verpackt in Apoptosebodies Shedding in Exosomen HDL Partikel vesikel-frei Komplex mit Ago Prot. (Argonaut 2)
13 Zirkulierende mirna microvesikel-assoziierte mirnas nur kleiner Teil der extrazellulären micrornas 1,2 n (ca. 10%) 90% aller mirnas im Plasma zirkulieren vesicle-frei in Ago-Protein- Bindung 1,2 mirnas nachweisbar in aufgereinigten HDL Fraktionen in Plasma aber Anteil an der extrazellulären Gesamt mirna ist unklar 1,2 Hohe Stabilität der mirna Moleküle, selbst unter extremen Bedingungen (Temperatur, ph, bis zu 10 x Einfrier/Auftauzyklen) Turchinovich A et al. Nucleic Acids Res Sep 1; 39(16): Cortec MA et al. Recent Results Cancer Res. 2012; 195: / _13.
14 Exosomen als potentielle organspezifische Marker der mirna Exosomen-spezifische Marker: CD9 1, CD63 1 und Syntaxin- 1 Brustkrebs zell-spezifische Marker: - CD44 2, EGFR 3, EpCAM 4, HER2 5,6 - Vimentin 7 und FSP 7 für Stromazellen (Fibroblasten) 1 Zhang et al. Am J Pathol Jan; 184(1): Ricardo et al. J Clin Pathol Nov;64(11): Davis NM et al. Oncotarget 2014 Jul 15;5(13): Beije N et al. Cancer Treat Rev Feb;41(2): Slamon DJ et al. Science. 1987;235(4785): Burstein HJ. The New England Journal of Medicine. 2005;353(16): Sugimoto H et al. Cancer Biol Ther Dec;5(12): Epub 2006 Dec 5
15 Evidenz blutbasierter mirnas Überwiegende Daten Expressionsmustern im Mammakarzinom von Tumorgewebe oder Zelllinien Zunehmende Evidenz für eine Rolle zirkulierender mirna im Serum/ Plasma in frühen Mammakarzinomen als innovative non-invasive Biomarker 1-8 Wenige Daten zu exosomalen mirnas als potentielle diagnostische blut-basierte Biomarker in Mammakarzinomen 9 1 Redova M et al. Future oncology 9, Cortez MA et al. Progres dans les recherches sur le cancer 195, Heneghan H M et al. Oncologist 15, (2010) 4 Heneghan H M et al. Ann Surg 251, (2010) 5 Kodahl A R et al. Mol Oncol (2014) 6 Madhavan D et al. Front Genet 4, 116 (2013) 7 Sun Y et al. PloS one 7, e47003 (2012) 8 Mar-Aguilar F et. Al. Methods in molecular biology 1165, (2014) 9 Eichelser C et al. Oncotarget 5, (2014)
16 Zirkulierende mirnas in anderen Körperflüssigkeiten: Urin Young-Kook et al. Chonnam Med J Aug; 51(2): 51 57
17 Rationale für Studie Zirkulierende micrornas in Blut und Urin sind potentielle innovative non-invasive Biomarker Hohe Stabilität macht zirkulierende micrornas zu potentiell hochsensitiven diagnostischen und prädiktiven/prognostischen Markern beim Mammakarzinom Testung in der klinischen Routine als Tool zur (sub)klinischen Mammakarzinomfrüherkennung Tool zur Risikostratifizierung und damit Optimierung des individuellen Behandlungskonzeptes in der Adjuvanz
18 Diagnose Brustkrebs im Urin 24 BC Pat. vs. 24 gesunde Kontrollen Panel mit 9 micrornas: mir-21, mir-34a, mir-125b, mir- 155, mir-195, mir-200b, mir-200c, mir-375, mir-451 Proof of principle: zuverlässig detektierbare Mammakarzinom assoziierte mirnas im Urin
19
20 Signifikant erniedrigte mir-21 (p < 0.001), mir- 125b (p < 0.001) und mir-451 (p = 0.004) Level im Urin von Karzinompat. Signifikant erhöhte mir-155 Level im Urin von Karzinompat. (p < 0.001) Identifikation von vier spezifisch veränderten micrornas (mir-21, mir-125b, mir-451, mir-155) im Urin von Pat. mit frühem Mammakarzinom
21 Panel with 9 mirnas Panel with the 4 significantly altered mirnas Logistic Regression mit allen mirnas mit Score als diagnostischem Marker. Diagnost. Genauigkeit analysiert durch ROC (receiver operating characteristic curve) and AUC
22 Exzellente AUC für kombinierten Score aus allen neun mirnas sehr hohe Sensitivität von (95%-CI [0.812; 1.000]) sehr hohe Spezifität von (95%-CI [0.686; 0.978]) Hohe diagnostische Genauigkeit des urin-basierten microrna-panels zur Diskriminierung von Pat. mit MaCa und gesunden Frauen
23 Geplante Multicenter-Studie: Nicht-randomisiert, diagnostisch, einfachblind, multizentrisch - Validierungsstudie: Identifizierte microrna Signaturen in multizentrischer Kohorte - Primärer Endpunkt: Klassifizierung in Fall (Mammakarzinom) oder Kontrolle (kein Mammakarzinom) (PPV, NPV, ROC) - Sekundärer Endpunkt: Identifikation von Mammakarzinom Subtypen- spezifischer microrna Signaturen
24 Zusammenfassung Datenlage zeigt gute Evidenz für den Nachweis zirkulierender mirna im Blut als Biomarker beim Mammakarzinom Herkunft und biologischen Funktion der extrazellulären mirnas im Focus der translationalen Forschung Im Urin detektierbare mirnas sind potentielle Biomarker die non-invasiv untersucht werden können Hohe Stabilität der zirkulierenden mirnas und reproduzierbare, hoch spezifische und sensitive Detektion sprechen für Einsatz als potentielle diagnostische und prädiktive/prognostische Marker beim Mammakarzinom
25 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit
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