Praktikum. Biologie für Mediziner/innen. WiSe 2013/2014. Praktikumsteil. Lichtmikroskopie. Erreger der Malaria

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1 Praktikum Biologie für Mediziner/innen WiSe 2013/2014 Praktikumsteil Lichtmikroskopie Erreger der Malaria Leitung Dr. Kathrin Bolte

2 Teil I: Lichtmikroskopie Das Lichtmikroskop ist immer noch ein wichtiges Hilfsmittel zur Erschließung des Mikrokosmos und hat, durch die Entwicklung neuer Techniken und den Einzug des Computers in die mikroskopische Analyse, eine Renaissance erlebt. Wer moderne Lichtmikroskope optimal nutzen will, muss über die Grundlagen des Aufbaus, die Funktion und den richtigen Gebrauch informiert sein. Aus diesem Grund soll der Aufbau eines einfachen Kursmikroskops und sein Strahlengang besprochen werden. Optische Grundlagen: Wenn man einen Gegenstand genau betrachten will, muss man ihn so nah wie möglich an das Auge heranbringen, da ein großer Sehwinkel zu einer guten Auflösung führt. Zwei dicht nebeneinander liegende getrennte Punkte können dann noch vom Auge aufgelöst werden, wenn der Sehwinkel mindestens eine Bogenminute beträgt. Die Grenze ist allerdings durch die Akkomodationsfähigkeit des Auges gegeben, die minimal bei einem Objektabstand (Betrachtungsabstand) von ca. 10 cm, in Normalfall bei ca. 25 cm liegt. Die Größe des Sehwinkels a nimmt mit Annäherung an das Auge zu; der normale Betrachtungsabstand liegt bei ca. 25 cm. Da die Auflösung des Auges begrenzt ist, müssen wir Hilfsmittel anwenden, um diese Barriere zu überwinden. Gängige Vergrößerungsgeräte sind einfache Lupen oder auch Projektoren (Beamer, Diaprojektoren), deren Optik, vereinfacht dargestellt, aus einem Sammellinsensystem besteht. Lupe und Projektor Befindet sich der abzubildende Gegenstand zwischen der Hauptebene und dem Brennpunkt einer Sammellinse, so wirkt sie als Lupe. Der Gegenstand wird seitenrichtig vergrößert abgebildet; er lässt sich jedoch nicht auf einem Bildschirm abbilden, sodass man von einem virtuellen (scheinbaren) Bild, im Gegensatz zu einem reellen (wirklichen), spricht. Da bei einer Lupe nicht ohne weiteres zur Messung des Abbildungsmaßstabes Abstände bestimmt werden können, rechnet man mit Winkeln (Sehwinkel). Wenn der Gegenstand immer näher an den Brennpunkt herangeführt wird, entfernt sich das Bild immer weiter von der Linse, die Vergrößerung nimmt zu, wobei der Sehwinkel gleich bleibt. Dies bedeutet, dass Abbildungsmaßstab und Vergrößerung völlig verschiedene Begriffe sind. Die Vergrößerung hängt von der Sehweite ab, die man mit 25 cm definiert; d.h. dass das Objekt 25 cm vom Auge entfernt ist. Demnach beträgt die Vergrößerung einer Lupe: V = 25 (cm) / f (cm) f = Brennweite Bei Projektoren befindet sich der Gegenstand (z. B. ein Dia) zwischen der einfachen und doppelten Brennweite der Sammellinse. Es entsteht ein seitenverkehrtes reelles vergrößertes Bild. Dieses ist auf einem Bildschirm abbilden.

3 Das Lichtmikroskop Optisches System Lichtmikroskope sind Kombinationsgeräte aus einem Projektorteil und einem Lupenteil. Betrachten wir den Strahlengang eines typischen Lichtmikroskops: Im Unterteil des Stativs, befindet sich die meist in der Helligkeit elektronisch regelbare Lichtquelle, deren Licht durch den sogenannten Kondensor unter dem Objekttisch, auf das Präparat zentriert wird. Das Präparat (Gegenstand) wird durch das Objektiv, ein Projektorlinsensystem, vergrößert abgebildet; es entsteht im Tubus ein reelles Zwischenbild. Der Abbildungsmaßstab (= Vergrößerungsmaßstab) ist jeweils auf den Objektiven angegeben (z. B. 25:1). Das Zwischenbild wird durch das wie eine Lupe wirkende Okular nachvergrößert, wobei die Nachvergrößerung von der Okularvergrößerung (z.b. 10x) abhängt. Die Gesamtvergrößerung (VM) entspricht dem Produkt aus Maßstabszahl des Objektives (MZ) und der Vergrößerung des Okulars(VO): VM=MZ X VO a) b) 1: Okulare 2: Binokularer Tubus 3: Mikroskopstativ 4: Rändelschraube für Tubusarretierung 5: Beleuchtungsstärkeregler 6: Ein-/Ausschalter mit integrierter Kontrollampe 7: Fokussiertrieb Feinverstellung (beidseitig) 8: Fokussiertrieb Grobverstellung (beidseitig) 9: Triebknopf für Verstellung des Kreuztisches in x-richtung 10: Triebknopf für Verstellung des Kreuztisches in y-richtung 11: Leuchtfeldblende 12: Kondensorträger 13: Hebel für Aperturblendeneinstellung 14: Kondensor 15: Zentrierschraube für Kondensor (beidseitig) 16: Kreuztisch für Objekthalter 17: Objektiv 18: Objektivrevolver 4fach oder 5fach Abbildung 1: a) Vergrößerung eines Objekts durch Sammellinsen, b) Aufbau des Lichtmikroskops

4 Stoffanreicherung in den Vakuolen von Zwiebelzellen nach dem Ionenfallenprinzip Theorie Die Neutralrotmoleküle sind lipophil und können deshalb Membranen durchdringen. Im sauren Milieu der Vakuole bindet das lipophile Neutralrot Wasserstoff-Ionen (H + ) und verliert somit als Neutralrot-Kation seinen lipophilen Charakter. Da die Vakuolenmembran für hydrophile Substanzen nicht durchlässig ist, wird das Neutralrot-Kation in der Ionenfalle der Vakuole gefangen. Es wandern bis zur Einstellung des Konzentrationsgleichgewichtes Moleküle in die Vakuole ein. Mit diesem Versuch lässt sich die Vakuole und ihre Größe recht anschaulich darstellen. Es ist zu erkennen, dass, im Gegensatz zu tierischen Zellen, die Vakuole einen großen Teil der pflanzlichen Zelle einnimmt. Der Versuch verdeutlicht auch den Stofftransport über Membransysteme. Es muss jedoch betont werden, dass normalerweise die meisten Substanzen aktiv durch spezifische Carriersysteme über Membranschranken transportiert werden. Praktischer Teil Handwerkszeug Pinzette, Zeichenmaterialien I. Einstellung der Köhlerschen Beleuchtung 1. Objektiv 10x einschwenken 2. Kondensor auf Hellfeldposition (kein Kontrastelement im Strahlengang), evtl. Kondensorfrontlinse einschwenken 3. bekanntes Präparat fokussieren 4. Leuchtfeldblende schließen bei guter Zentrierung des Kondensors wird das Präparat nur noch aus der Mitte des Sehfelds heraus beleuchtet 5. Kondensor auf- bzw. abwärts drehen, bis scharfe Kanten der Leuchtfeldblende abgebildet werden. 6. Leuchtfeldblende durch Zentrierschrauben am Kondensor in das Bildzentrum bringen 7. Leuchtfeldblende bis knapp über den Sehfeldrand öffnen 8. Anpassung der Aperturblende des Kondensors bis sich hinsichtlich Auflösung und Kontrasteindruck der optimale Bildcharakter einstellt

5 II. Präparation und mikroskopische Betrachtung der Epidermis von Zwiebeln Eine Zwiebel wird geviertelt, der untere Teil, der sogenannte Zwiebelkuchen, und der obere trockene Teil abgeschnitten und die Schuppen getrennt. Die innere Seite einer Schuppe (konkave Oberseite) wird mit der Rasierklinge oder einem scharfen Skalpell in kleine Rechtecke angeschnitten. Mit der Pinzette wird vorsichtig von einer Ecke her die matt aussehende Epidermis abgezogen und in einen Tropfen Wasser auf einen Objektträger gebracht. Man kippt ein Deckglas darauf, damit keine Luftblasen entstehen. Überschüssiges Wasser wird mit dem Filtrierpapier von der Seite abgesaugt. Stellen Sie das Präparat bei schwacher Vergrößerung ein und zeichnen und beschriften Sie: a) das charakteristische Zellmuster der Epidermis. b) bei hoher Vergrößerung eine Zelle im Detail. Der Zellkern ist deutlich zu erkennen, das Cytoplasma vor allem an den Zellenden; bei hoher Vergrößerung und zugezogener Kondensorblende ist auch die Plasmaströmung zu beobachten. Die Vakuole als Ionenfalle Es wird ein neues Epidermispräparat hergestellt, das Epidermishäutchen in einen Tropfen Neutralrot-Lösung auf den Objektträger gebracht und mit einem Deckglas abgedeckt. Alternativ kann in das schon vorhandene Präparat von der Seite Neutralrot-Lösung eingesaugt werden, indem man einen Tropfen Neutralrot-Lösung unmittelbar neben das Deckglas pipettiert und von der anderen Seite mit einem Filtrierpapierstreifen einsaugt. Die Zwiebelepidermis wird unter dem Mikroskop untersucht. Nach Minuten färben sich allmählich die Vakuolen rot und die begrenzenden Vakuolenmembranen sind deutlich zu erkennen. Dabei ist zu beachten, dass die Neutralrotlösung vielfach eine gewisse Vakuolenkontraktion verursacht. Man entfernt überschüssigen Farbstoff durch Spülen mit Wasser (seitl. Einsaugen). Der Versuch zeigt, dass der Farbstoff durch Zellwand, Zellmembran und Vakuolenmembran in die Vakuole eingedrungen und dort angereichert ist. Plasmolyse Durch Plasmolyse kann bewiesen werden, dass die Zellen noch leben. Aus diesem Grund wird ein Tropfen 1M Kaliumnitratlösung (KNO3) unmittelbar neben das Deckglas gesetzt und die Lösung mit einem Filterpapierstreifen durch das Präparat gesaugt. Durch Wasserentzug wird die Plasmolyse der Zellen (Konvexplasmolyse) induziert, die Vakuolen färben sich dadurch noch stärker an. Durch die Plasmolyse und die hervorgerufene Ablösung der Cytoplasmamembran von den festen Zellwänden, sind Plasmamembranen und das Cytoplasma als heller Saum und die Vakuolenmembran als Begrenzungen gut zu erkennen.

6 Materialien Herstellung der Neutralrot-Lösung: 0,1 g Neutralrot ad 1000 ml Leitungswasser Nach Lösen des Farbstoffes ev. filtrieren. Diese Stammlösung wird unmittelbar vor Gebrauch 1:10 mit Leitungswasser verdünnt. 1M KNO3 Lösung Teil II: Erreger der Malaria Theorie Bedeutung: Malaria ist die bei weitem wichtigste tropische parasitische Krankheit. Wenn man einmal von der Tuberkulose absieht, tötet sie mehr Menschen als alle anderen übertragbaren Krankheiten. Erreger der Malaria beim Menschen sind: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae und Plasmodium ovale. Der wichtigste und letalste Erreger ist Plasmodium falciparum. Heute leben ca. 3,3 Milliarden Menschen in Malariagebieten in Afrika, Asien und Süd/Mittelamerika, dies sind 40 % der Weltbevölkerung. Laut WHO gab es 2012 ca. 219 Mio klinische Fälle; die Todesrate liegt bei mehr als Menschen pro Jahr, wobei der Krankheit vor allem Kinder und Jugendliche in Staaten und Gegenden zum Opfer fallen, in denen keine oder nur eine geringe medizinische und staatliche Infrastruktur besteht (Afrika, südlich der Sahara). Alle 45 Sekunden stirbt ein Kind an Malaria. Risikogruppen sind auch schwangere Frauen, Touristen, Fernreisende aus Europa, Amerika, die nicht immun sind (sog. Airport Malaria), und Arbeiter, die in verseuchte Gebiete geschickt werden. Symptome: Die Symptome beinhalten Fieberanfälle, die oft in bestimmten Rhythmen auftreten und vom Entwicklungszyklus der Erreger abhängen (Tabelle 1). Tabelle 1: Charakteristika der humanpathogenen Plasmodien-Spezies Species Malaria-Art Inkubationszeit Fieberanfälle andere Symptome Mortalität P. vivax M. tertiana 8-16 Tage alle 48 Schüttelfrost, - P. ovale M. tertiana ca. 15 Tage Stunden alle 48 Mattigkeit, Leber-und Milzschwellungen, +/- Stunden Schlafsucht P. malariae M. quartana Tage alle 72 Nierenschädigungen +/- Stunden P. falciparum M. tropica 7-12 Tage unregelmäßig Kapillarverstopfung, insbesondere im Gehirn +

7 Behandlung: Bewährt haben sich als Anti-Malaria-Mittel Chinoline, z.b. Chloroquin. Es treten inzwischen Resistenzen auf, die neue Mittel erforderten, z.b. Amodiaquin, Artemisininderivate oder die Gabe von Kombinationspräparaten; an einer Malaria- Schutzimpfung wird intensiv gearbeitet. Die Plasmodien Plasmodien gehören zum Stamm der Apicomplexa (Ordnung Haemosporidia), die nach ihrem wichtigsten Merkmal, dem Apikalkomplex am vorderen Zellpol, benannt sind. Wesentliche Bestandteile des Apikalkomplexes sind ein Conoid, von einem Polring ausgehende Mikrotubuli, flaschenförmige Rhoptrien und Mikronemen. Rhoptrien sind wohl enzymgefüllte Organellen, die die Penetration der Wirtszelle (Erythrocyten) ermöglichen. Plasmodien enthalten eine komplexe reduzierte Plastide, die den Rest einer degenerierten Rotalge darstellt. E muss sich zeigen, ob diese Eigenschaft einen Ansatzpunkt zur Therapie bietet. Lebenszyklus Der Lebenszyklus von Plasmodium ist komplex (Abbildung 1). Die Protisten führen einen Wirtswechsel zwischen einem Wirbellosen (Anopheles ssp.)- und dem Menschen durch, wobei sexuelle Vermehrung in der Mücke und asexuelle Vermehrung im Menschen stattfindet. Entwicklung im Menschen: Saugt eine infizierte Anopheles-Mücke (nur Weibchen) Blut, so gelangen mit dem Speichel sog. Sporozoiten in die Blutbahn. Sie befallen dann das Leberparenchym, indem sie durch rezeptorvermittelte Endocytose in die Zellen eindringen. Der Apikalkomplex verschwindet, die Sporozoiten werden zu Trophozoiten. Sie ernähren sich vom Cytoplasma der Wirtszelle und vermehren sich durch multiple Teilungen, Schizogenie genannt. Es entstehen Merozoiten, die nach Lyse der Leberzellen ins Blut gelangen und dort die Erythrocyten durch eine Art erzwungene Endocytose befallen (Erythrocyten besitzen alleine keine Fähigkeit zur Endocytose). Der Parasit lebt in den Erythrocyten in einer parasitophoren Vakuole und kommt so mit dem Cytoplasma des Erythrocyten nicht in Kontakt. Die Merozoiten verwandeln sich in Trophozoite und vermehren sich wiederum durch Schizogonie. Wenn die Erythrocyten platzen, werden die Merozoiten freigesetzt und können neue Erythrocyten infizieren. Einige Merozoiten können sich in Erythrocyten zu Makrogamonten und Mikrogamonten entwickeln. Plasmodium ernährt sich von Hämoglobin, wobei Häm in der Nahrungsvakuole zu Hämozoin polymerisiert wird. Die Anhäufung von Hämozoin ist an braunen Bereichen zu erkennen. Chinoline, die in der Nahrungsvakuole angereichert werden, verhindern die Polymerisation von Häm, das in monomerer Form auf den Parasiten toxisch wirkt.

8 Entwicklung in Anopheles ssp.: Wenn Mikro- und Makrogamonten nach einem Stich aus dem Blut des Menschen in den Verdauungstrakt von Anopheles ssp. gelangen, werden sie freigesetzt. Nach Verschmelzung und Oocytenbildung infizieren sie das ganze Insekt und auch die Speicheldrüsen. Von hier werden sie bei einem Stich wieder auf den Menschen übertragen. Abbildung 2: Entwicklungskreislauf von Plasmodien Praktischer Teil Es werden Blutausstrichpräparate verteilt, die Erythrocyten enthalten, die mit Plasmodium falciparum infiziert sind. Gewaschene Erythrocyten der Blutgruppe A wurden in RPMI-Medium/10 % Human-Plasma im Verhältnis 50:1 mit Plasmodium falciparum infiziert. Die Suspension wurde auf Deckgläser ausgestrichen und ca Minuten mit Giemsa gefärbt, Giemsa enthält Eosin, das saure Substanzen anfärbt und Methylenblau, das auf basische Substanzen anspricht. Die Präparate wurden luftgetrocknet, wobei das Human- Plasma der Suspension die Erythrocyten auf dem Objektträger festklebt. Es folgte ein kurzes Methanolbad zur Fixierung.

9 Aufgabe: die Präparate werden im Mikroskop untersucht a) Schätzen Sie durch Zählen grob die Parasitämie in % infizierter Erythrocyten. b) Versuchen Sie folgende Stadien zu unterscheiden und zeichnen Sie die Stadien: - junge ringförmige Trophozoite; Einzelinfektion, Mehrfachinfektion - Trophozoite in Siegelringform, marginaler Form, mit 1 oder 2 Chromatin- Flecken - fast reife Trophozoite mit Pigment im Cytoplasma - reife Trophozoite mit geklumptem Hämozoin-Pigment - Schizontenbildung, reife Schizonten

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