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1 Teilprojekt: Microbial Source Tracking Technologiezentrum Wasser Abteilung Umweltbiotechnologie & Altlasten C. Stoll, Dr. A. Tiehm

2 Ziele Mikrobiologisches Monitoring am Standort - Mikroorganismen im Kulturverfahren - Mikroorganismen mit PCR Korrelation mit Trübung Etablierung und Optimierung von Microbial Source Tracking -Werkzeugen Zentraler Punkt des Teilprojektes ist ein mikrobiologisches Monitoring der Gallusquelle. Hierzu werden zum einen Kulturverfahren und zum anderen molekularbiologische Verfahren wie die Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt. Mit Hilfe dieser Methoden wird auch die Trübe des Rohwassers, die am Wasserwerk Hermentingen als Leitparameter genutzt wird, näher betrachtet. Bislang ist nicht geklärt, worauf die Trübe im Einzugsgebiet Gallusquelle zurückzuführen ist. Aus diesem Grund werden gezielte Studien zur Trübeassoziation von Spurenstoffen und Mikroorganismen an der Quelle durchgeführt. Hierzu werden Proben mit niedriger und hoher Trübe verglichen. Ein weiterer Aspekt des Teilprojektes ist die Etablierung und Optimierung von Werkzeugen zur Identifizierung von fäkalen Eintragsquellen ( Microbial Source Tracking ).

3 Microbial Source Tracking Methoden, die eine Unterscheidung zwischen menschlichen und tierischen fäkalen Kontaminationen sowie eine Identifizierung spezifischer Kontaminationsquellen ermöglichen. Kontaminationsquellen im Einzugsgebiet Mensch Domestizierte Tiere Wild lebende Tiere Fäkale Eintragsquellen? Fäkale Kontaminationen: E. coli Problem: Herkunft E. coli unbekannt Lösungsansatz: PCR-Untersuchungen Unter Microbial Source Tracking (MST) versteht man Methoden, die man einsetzt, um fäkale Kontaminationen anhand der mikrobiellen Flora bis zu ihrem Ursprung zurückzuverfolgen. Die derzeitige Überwachung der mikrobiologischen Wasserqualität beruht auf dem Nachweis von Indikatorbakterien wie z.b. E. coli und Enterokokken. Die angewendeten mikrobiologischen Methoden erlauben zwar den Nachweis von fäkalem Einfluss auf das Wasser, geben jedoch keinen Aufschluss über die Herkunft dieser Kontamination, d.h. ob diese menschlichen oder tierischen Ursprungs sind. Diese Wissenslücken sollen durch Microbial Source Tracking- Werkzeuge geschlossen werden. Zum Zwecke des Microbial Source Tracking können unterschiedliche Untersuchungsmethoden angewendet werden. Viele dieser Methoden basieren auf molekularbiologischen Techniken insbesonders auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

4 Warum Microbial Source Tracking? Die Quantifizierung als auch die Verursacheridentifikation fäkaler mikrobiologischer Kontaminationen ist von zunehmender Bedeutung: Zielgerichtetes Management Evaluierung von Maßnahmen wild lebende Tiere Proben domestizierte Tiere Mensch Die erarbeitete Methodik soll anschließend unter Feldbedingungen anhand des Einzugsgebietes der Gallusquelle getestet und verfeinert werden. Ziel des Projektes ist eine auf experimentellen Daten basierende Identifizierung von Kontaminationsquellen, sowie die Ableitung von Management-Empfehlungen und die Evaluierung von Maßnahmen im Einzugsgebiet. Die Ergebnisse des Projektes sind die Grundlage für zukünftige Strategien zur Abklärung des Ursprungs fäkaler Kontaminationen im Grundwasser, und sollen in Empfehlungen besonders geeigneter Methoden münden.

5 Markerorganismen Bakterien: E. coli P. aeruginosa, Campylobacter sp. und Legionella sp. Bacteroides sp. Viren: Bakteriophage MS2 und phix174 Humaner Adeno-, Noro- und Polyomavirus Eukaryotische Zellen mitochondriale DNA Allg. Nachweis einer Kontamination Erweitertes Rohwassermonitoring Sequenzunterschiede in Abhängigkeit der Kontaminationsquelle Allg. Nachweis einer Kontamination Marker für humane Kontamination Sequenzunterschiede in Abhängigkeit der Kontaminationsquelle Antibiotikaresistenzgene Sulfonamid-Resistenzgene: Trimethoprim-Resistenzgene: Makrolid-Resistenzgene: Tetracyclin-Resistenzgene: β-lactam-resistenzgene: Aminoglykosid-Resistenzgene: sul1, sul2 dfra1, dfra12 ermb tet(a), tet(b), tet(c), tet(m) bla SHV, bla PSE-1 ant(3 )-Ia, aada Mustervergleich möglicher Kontaminationsquellen Fingerprint-Methoden Denaturierende Gradientengel-Elektrophorese An erster Stelle der Arbeiten am TZW stand eine umfangreiche Literaturrecherche zum Thema Microbial Source Tracking (MST). In dieser Recherche wurde besonderes Augenmerk auf vielversprechende Marker sowie deren Nachweisverfahren gelegt. Vielversprechende genetische Marker für MST- Anwendungen sind u.a. wirtsspezifische Bacteroides 16S rrna-genabschnitte, Bereiche der eukaryotischen mitochondrialen DNA (mtdna) sowie spezifische Sequenzen von humanpathogenen Mikroorganismen wie z.b. dem Polyomavirus. Bei Bakterien der Gattung Bacteroides handelt es sich um obligate anaerobe Organismen, die die dominierende Spezies in der Bakterienflora des Intestinaltraktes darstellen. Im Dickdarm findet man mehr als Bacteroides- Keime pro Gramm Stuhl. Aus diesem Grund sind Bakterien der Gattung Bacteroides hervorragend zum Nachweis von fäkalen Kontaminationen geeignet. Außerdem gibt es eine erhebliche genetische Diversität zwischen den verschiedenen Bacteroides-Bakterien. Aufgrund dieser Diversität konnten wirtsspezifische Markersequenzen, die eine Unterscheidung der Herkunft der fäkalen Kontamination ermöglichen, identifiziert werden. Alle aufgezählten Marker können mit Hilfe von real-time PCR-Verfahren nachgewiesen und quantifiziert werden. Dieser Nachweis hat den Vorteil, dass keine Kultivierung der Organismen notwendig ist. Außerdem können viele Proben relativ schnell und kostengünstig untersucht werden.

6 Untersuchungsschema Ablauf der Untersuchungen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kultureller Nachweis Wasserprobe Nachweis von E.coli mittels Colilert Zielsequenz DNA 5 3 Erhitzen zur Strangtrennung 5 3 Anlagerung der Primer Primer Synthese der komplementären Stränge durch DNA-Polymerase Zyklen Anreicherung der Bakterien mittels Membranfiltration Bakterien auf Membranfilter DNA-Extraktion DNA-Extrakt Ansetzen der qpcr qpcr Auswertung der qpcr PCR- Nachweis Die Untersuchungen des Rohwassers der Gallusquelle laufen nach folgendem Schema ab: Ein Teil des Volumens wird für den kulturellen Nachweis von coliformen Bakterien, E. coli und Enterokokken eingesetzt. Parallel wird ein zweiter Teil der Probe über Membranfiltration angereichert. Der Filter mit der Biomasse wird in die DNA-Extraktion eingesetzt. Anschließend wird die Qualität der extrahierten DNA mit Hilfe einer PCR, die sich gegen 16S rdna-sequenzen aller Eubakterien richtet, überprüft. Anschließend werden weitere PCR- Untersuchungen durchgeführt. Die PCR ist eine in vitro Technik, mit der gezielt DNA-Abschnitte, die von zwei bekannten DNA-Sequenzen flankiert werden, vervielfältigt werden können (Saiki et al., 1985). Sie stellt ein zyklisches Verfahren dar, bei dem die Anzahl der DNA- Kopien in jeder Runde verdoppelt wird. Bei Zugabe entsprechender Fluorochrome zu der PCR-Reaktion kann der Amplifikationserfolg über die Messung von laserinduzierten Fluoreszenzsignalen in Echtzeit ermittelt werden (real-time PCR). Die Stärke der beim Amplifikationsprozess entstehenden Fluoreszenz ist dabei proportional zur gebildeten DNA-Menge. Der Einsatz der real-time PCR erlaubt eine schnelle und unter Einsatz von DNA-Standards auch quantitative Analyse von Mikroorganismen.

7 Erste Ergebnisse Primersystem spezifisch für: Marker Abwasser Hühnerkot Pferdedung Rindergülle Negativkontrolle Marker Abwasser Hühnerkot Pferdedung Rindergülle Negativkontrolle Primersystem spezifisch für: E. COLI BACTEROIDES unspezifisch unspezifisch Mensch Huhn unspezifisch unspezifisch Mensch Huhn MITOCHONIDRIALE DNA EUBAKTERIEN Pferd Pferd Rind Rind Mit ausgewählten Primersystemen wurden erste Untersuchungen durchgeführt. Hierzu wurde die DNA aus vier möglichen Kontaminationsquellen (Abwasser, Hühnerkot, Pferdedung, Rindergülle) extrahiert und in verschiedene PCR- Untersuchungen eingesetzt. Die Abbildung zeigt Ausschnitte aus mehreren Agarosegelen, auf denen PCR-Ansätze mit verschiedenen Primersystemen elektrophoretisch aufgetrennt wurden. Die verwendeten Primer führten bei den erwarteten Proben zu Produkten der richtigen Länge. Z.B. Human-spezifische mtdna- und Bacteroides-Marker wurden nur in der Abwasserprobe und Huhnspezifische Marker nur in der Hühnerkotprobe nachgewiesen. Die bisherigen Ergebnisse lassen die ausgewählten Primersysteme grundsätzlich für einen spezifischen, molekularbiologischen Nachweis von fäkalen Markern geeignet erscheinen.

8 Kultureller Nachweis Colilert Enterolert Quelle: Neben der PCR-Analytik ist im Rahmen des Projektes auch ein kultureller Nachweis von Indikatororganismen, wie coliformen Bakterien, E. coli und Enterokokken, vorgesehen. Dieser Nachweis erfolgt mit etablierten Testsystemen, die auch in der Routine-Überwachung eingesetzt werden.

9 Mikrobiologische Untersuchungen 1E+03 Trübe Coliforme E. coli Keime / 100 ml 1E+02 1E+01 Enterkokken 1E / 16:15 Uhr / 08:40 Uhr / 11:30 Uhr Mit Hilfe dieser Nachweissysteme wurden Rohwasserproben von der Gallusquelle untersucht. Die Entnahme der ersten drei Proben fand während der Schneeschmelze im Februar 2012 statt. Zum Zeitpunkt der Probenahme lag eine erhöhte Trübung des Rohwassers vor. Dies spiegelt sich auch in den Keimzahlen wieder. Die erhöhte Trübung geht mit einem Anstieg der mikrobiellen Belastung einher. Zu den späteren Zeitpunkten war die Anzahl der coliformen Bakterien deutlich geringer, und Enterokokken bzw. E. coli konnten nicht bzw. einmalig nachgewiesen werden.

10 Zwischenfazit PCR-Nachweis erfolgreich durchgeführt PCR-Ansatz mit Bacteroides und mtdna erfolgversprechend

11 Ausblick Untersuchung weiterer Wasserproben aus dem Einzugsgebiet Vollständige Etablierung und Optimierung der PCR-Verfahren Herstellen von qpcr-standards Ermittlung von optimalen PCR-Bedingungen Untersuchung von Proben möglicher Kontaminationsquellen (Fäkalien, Gülle, Abwasser,..) zur Ermittlung der Sensitivität und Spezifität der ausgewählten Primersysteme Abgleich mit der chemischen Analytik Empfehlungen zum Management

12 Dank den Kollegen für Ihre Hilfe... den Projektpartner für die Zusammenarbeit... dem BMBF für die finanzielle Förderung

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