Elektrochemische Mikrosensoren -Glucosesensor-

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1 Elektrochemische Mikrosensoren -Glucosesensor- Anwendung und Verfeinerung elektrochemischer Verfahren haben in der Elektroanalytik zur Entwicklung sehr empfindlicher und genauer Meßverfahren geführt. Für eine ganze Reihe verschiedener Analyte sind mittlerweile spezielle Sensoren erhältlich. Sensoren sind Meßfühler, die eine bestimmte Meßgröße erfassen können und diese in vielen Fällen in eine elektrische oder optische Größe transformieren. Das so erzeugte Signal kann nun über längere Strecken gesandt werden, so daß es möglich ist, die Erfassung des Signals und seine Auswertung räumlich getrennt voneinander durchzuführen. Sensoren können je nach Funktionsprinzip in unterschiedliche Klassen (z.b. Chemosensoren, Biosensoren) eingruppiert werden. Chemosensoren reagieren auf die Anwesenheit eines bestimmten Analyten mit einem physikalisch-chemischen Prozeß, der wiederum zur Signalwandlung in eine elektrische Größe führt. Biosensoren nutzen zur Erkennung eines Analyten einen biochemischen Prozeß. Hierbei wird eine Meßgröße erzeugt, die nachfolgend mit Hilfe eines Transducers so gewandelt wird, daß sie nachgewiesen werden kann. Die biologisch aktive Komponente befindet sich häufig direkt auf dem Transducer. Biosensoren zeichnen sich durch eine sehr spezifische Erfassung des Analyten aus. Weiterhin besitzen sie oftmals eine hohe Empfindlichkeit und eine sehr geringe Nachweisgrenze für den Analyten. Bei dem hier zu untersuchenden Glucosesensor handelt es sich um einen Biosensor, der mit Hilfe der Mikrosystemtechnik in eine sehr kompakte Form gebracht werden konnte. Basis dieses Sensors ist ein einkristalliner Silizium-Wafer, der mit Techniken der Halbleiterfertigung dreidimensional strukturiert wurde und dadurch pyramidenförmige Vertiefungen (sog. Containments) aufweist. In diese Containments werden die biologisch aktiven Komponenten eingebracht, die mit der Meßlösung in Kontakt stehen. Bei Anwesenheit von Glucose produzieren sie in einer enzymatischen Reaktion H 2 O 2, welches unter Elektronenabgabe an einer Platinelektrode zersetzt wird. Der dabei fließende Strom wird mit Hilfe eines empfindlichen Potentiostaten gemessen. Auf diese Weise ermöglicht der Glucosesensor für einen Zeitraum von mehreren Tagen die kontinuierliche Erfassung des Blutzuckergehalts von menschlichem Serum oder Blut.

2 Funktionsprinzip des Glucosesensors Der in diesem Versuch eingesetzte Biosensor nutzt die durch das Enzym Glucoseoxidase (GOD) katalysierte Umsetzung von Glucose zu Gluconolacton. Diese Reaktion, für die ein Elektronenakzeptor (Sauerstoff) erforderlich ist, erfolgt sehr spezifisch. Das dabei entstehende Wasserstoffperoxid wird bei einem Potential von +600mV (bzgl. Ag/AgCl- Referenz) an einer Platinelektrode elektrochemisch oxidiert, wodurch ein Stromfluß möglich wird. GOD β-d-glucose + O 2 + H 2 O Gluconolacton + H 2 O 2 U = +600mV: H 2 O 2 O 2 + 2H + + 2e - (1) Das Potential wird zwischen der Platinelektrode auf dem Chip und einer zweiten Elektrode, die ebenfalls mit dem Elektrolyten in Verbindung steht, eingestellt. Über ein hochempfindliches Amperemeter wird der Stromfluß registriert. Die Höhe des Stroms ist proportional zur Glucosekonzentration. Eine schematische Darstellung des Experiments zeigt Fig. 1. Fig. 1: Schematische Darstellung eines amperometrischen Experiments AE: Arbeitselektrode, RE: Referenzelektrode, U pot : angelegtes Potential Grundlagen der Elektrochemie des Glucosesensors Wird eine Metallelektrode in einen Elektrolyten getaucht, so finden an der Phasengrenze Elektrode/Elektrolyt Umordnungsvorgänge statt, bei denen Ladungsträger über die Phasengrenze verschoben werden. Bei einem Redoxsystem (z.b. eine Lösung mit Fe 2+ - und Fe 3+ -Ionen), stellt sich an einer inerten Metallelektrode (z.b. Pt) eine Gleichgewichtsgalvanispannung Φ gl ein, die gemäß der Nernst-Gleichung gegeben ist durch 2

3 Φ gl R T = Φ + z F 0 a ln a ox red Φ 0 : Standard-Gleichgewichtsgalvanispannung R: Allgemeine Gaskonstante T: Temperatur in K F: Faraday-Konstante z: Wertigkeitsunterschied zwischen beiden Formen a ox : Aktivität der oxidierten Form a red : Aktivität der reduzierten Form Die Gleichgewichtsgalvanispannung Φ gl, die die Potentialdifferenz zwischen dem Inneren zweier angrenzender Phasen (d.h. dem Inneren der Elektrode und dem Inneren der Elektrolytlösung) beschreibt, ist separat nicht meßbar. Um das Potential der flüssigen Phase meßtechnisch zu erfassen, wäre eine weitere Ableitelektrode erforderlich, die in den Elektrolyten eintaucht. Auch bei dieser würde sich an der Phasengrenze eine Gleichgewichtsgalvanispannung einstellen. Letztendlich kann daher immer nur die Differenz zweier Galvanispannungen gemessen werden. Man muß deshalb dafür sorgen, daß sich die Galvanispannung an der Ableitelektrode möglichst nicht ändert während des Experiments und daß sie sich immer wieder reproduzierbar einstellt. Dies ist der Fall bei Bezugselektroden (z.b. Standard-Wasserstoff-Elektrode, Kalomel-Elektrode, Ag/AgCl-Elektrode). Wie aus der Nernst-Gleichung ersichtlich, hängt die Galvanispannung vom Verhältnis der Aktivitäten (und damit auch von den Konzentrationen) der oxidierten und reduzierten Form der Lösungsionen ab. Wird dem System von außen ein vom Gleichgewichtszustand abweichendes Potential aufgeprägt, so läßt sich dieses Verhältnis ändern. Bei der Amperometrie wird an die Elektrode ein konstantes Potential gelegt und der dadurch resultierende Stromfluß gemessen. Die Auswahl eines geeigneten Potentials erfolgt unter Berücksichtigung verschiedener Mechanismen, die den resultierenden Strom beeinflussen. Voraussetzung für die Wahl des Arbeitspotentials ist die Kenntnis der Strom-Spannungs- Kennlinie des Systems. Befindet sich beispielsweise eine oxidierbare Substanz im Elektrolyten, so erhält man bei langsam steigendem Elektrodenpotential eine Kennlinie gemäß Fig. 2. Fig. 2: Abhängigkeit des Elektrolysestroms vom Potential der Arbeitselektrode 3

4 Während der anfänglichen Polarisierung der Elektrode kommt es nur zu einem geringen Stromfluß, der auf nicht-faradaysche Ströme oder elektrochemische Zersetzung von Verunreinigungen zurückzuführen ist. Oberhalb eines bestimmten Potentials ist eine starke Zunahme des Stroms zu beobachten. Hier beginnt die elektrochemische Umsetzung der oxidierbaren Komponente. Handelt es sich um eine kinetisch nicht gehemmte Reaktion, steigt die Reaktionsgeschwindigkeit mit wachsendem Elektrodenpotential deutlich an, so daß auch der Strom zunimmt. Trotz weiterer Erhöhung des Potentials erreicht der Strom allerdings schließlich einen Sättigungswert. Die Reaktion verläuft nun so schnell, daß eine starke Verarmung des elektroaktiven Stoffs an der Elektrodenoberfläche eintritt. Der Strom wird jetzt hauptsächlich von dem Transport des elektroaktiven Stoffs vom Volumen des Elektrolyten zur Elektrodenoberfläche bestimmt und wird vom Potential nur noch unwesentlich beeinflußt. Der Massentransport zur Elektrode kann in drei Anteile unterteilt werden: 1. Migration: Wanderung von Ionen aufgrund eines elektrischen Feldes (Anionen wandern zum Pluspol, Kationen zum Minuspol) 2. Diffusion: Wanderung von Teilchen aufgrund eines Konzentrationsunterschieds 3. Konvektion: Wanderung von Teilchen durch Strömung in der Flüssigkeit (thermische Strömungen, Rühren) Migrationseffekte werden üblicherweise durch Zugabe eines fachen Überschusses eines elektroinaktiven Stoffes (z.b. KCl) unterbunden, der den Grundelektrolyten darstellt. Die Diffusion wird durch den elektrochemischen Umsatz ermöglicht. Durch die Elektrolyse nimmt die Konzentration der elektroaktiven Spezies an der Elektrodenoberfläche ab, so daß ein Konzentrationsgradient zwischen der Oberfläche der Elektrode und dem Inneren der Elektrolytlösung entsteht. Hierdurch wird eine Diffusionsbewegung in Richtung Elektrode ausgelöst. Oberhalb eines bestimmten Elektrodenpotentials ist die Reaktionsgeschwindigkeit und der damit verbundene Stoffumsatz so groß, daß die Konzentration der elektroaktiven Substanz direkt an der Elektrodenoberfläche nahezu Null ist. Damit ist der maximal mögliche Konzentrationsgradient erreicht. Der Elektrolysestrom wird oberhalb dieses Potentials nur noch durch den Transport bestimmt (Diffusionsgrenzstrom). Der Stofftransport (Teilchenzahl N pro Zeiteinheit) bei einer Elektrodenfläche A, Diffusionskoeffizient D und Analytkonzentration c beträgt bei Diffusion in nur einer Richtung x dn c = D A dt x (1. Ficksches Gesetz) Der Diffusionsgrenzstrom I grenz beträgt Igrenz z F D A = c δ 4

5 Der Strom ist somit direkt proportional zur Konzentration. Durch Rühren läßt sich die Dicke der Diffusionsschicht δ verringern, wodurch der gemessene Strom zunimmt. Bei der amperometrischen Messung wird das Arbeitspotential so gewählt, daß der Strom, der durch den elektrochemischen Umsatz des Analyten hervorgerufen wird, seinen Sättigungswert erreicht (s. Fig. 2). In diesem Fall zeichnet sich die Amperometrie durch einen linearen Zusammenhang zwischen Meßsignal und Analytkonzentration aus. Hierbei muß beachtet werden, daß die Wahl des Arbeitspotentials auch die Selektivität der Messung beeinflussen kann. Sind zusätzlich zum eigentlichen Analyten noch Substanzen in der Lösung, die bei dem gewählten Arbeitspotential ebenfalls elektrochemisch umgesetzt werden können, so tragen auch sie zum Gesamtstrom bei. Der Stromfluß durch die zu untersuchende Elektrode (Arbeitselektrode), die Elektrolytlösung und die Gegenelektrode führt wie bei einem Widerstand zu Spannungsabfällen an beiden Elektroden sowie im Elektrolyten. Während der Elektrolytwiderstand als ohmscher Widerstand betrachtet werden kann (d.h. sein Widerstand hängt nicht von der Höhe des Stroms ab) verhalten sich die Widerstände an den Phasengrenzen Elektrode/Elektrolyt wie nichtlineare Widerstände, d.h. sie sind von der Größe des Stroms abhängig. Um bei einer amperometrischen Messung möglichst unbeeinflusst von stromabhängigen Prozessen an der Gegenelektrode zu sein, wird häufig mit einer Dreielektrodenanordnung gearbeitet. Diese besteht aus Arbeits-, Gegen- und Referenzelektrode. Die analytisch interessierende Reaktion läuft weiterhin an der Arbeitselektrode ab, wobei das Potential mit einer hochohmigen Referenzelektrode kontrolliert wird. Die niederohmige Gegenelektrode dient lediglich als Stromkontakt. Alle Abweichungen vom vorgewählten Sollwert der Arbeitsspannung werden durch einen Potentiostaten automatisch korrigiert. Eine schematische Darstellung eines solchen Experiments zeigt Fig. 3. Fig. 3: Amperometrisches Experiment mit Potentiostat AE: Arbeitselektrode, GE: Gegenelektrode, RE: Referenzelektrode, U pot : angelegtes Potential 5

6 Aufbau des Glucosesensors Bei Biosensoren befindet sich die biologisch aktive Komponente häufig direkt auf dem Transducer. Ein in Planartechnik hergestellter einfacher Glucosesensor ist in Fig. 4 schematisch dargestellt. immobilisiertes Enzym aktive Sensoroberfläche elektr. Anschluß Platin-Elektrode Träger Fig. 4: Aufbau eines planaren Biosensors Für die Messung wird der gesamte Sensor mit dem immobilisierten Enzym direkt in den zu analysierenden Elektrolyten eingetaucht. Erzeugtes H 2 O 2 wird an der Platinelektrode elektrochemisch umgesetzt. Die relativ große Fläche, mit der das immobilisierte Enzym mit dem Elektrolyten in Kontakt steht, führt einerseits zu einem recht großen Signal bei Vorhandensein des entsprechenden Analyten. Andererseits kann sich wegen der großen Kontaktfläche eine Aktivitätsabnahme des Enzymreservoirs aufgrund von Auswaschungseffekten störend bemerkbar machen. Die Langzeitstabilität eines solchen Sensors ist außerdem häufig durch die ungenügende Haftung des immobilisierten Enzyms auf der Elektrode begrenzt. Enzym immobilisiert in einer Matrix Verkapselung Platinelektrode elektr. Anschluß 300 µm Silizium-Chip SiO 2 Aktive Sensoroberfläche = 130 µm Fig. 5: Querschnitt durch einen Glucosesensor mit Containment Biosensoren, die in Containmenttechnologie hergestellt werden, zeichnen sich sowohl durch eine bessere Haftung der Enzymmatrix als auch durch geringere Auswaschungseffekte aus. Bei ihnen wird das Enzym mit Hilfe eines photosensitiven Polymers auf der Platinelektrode innerhalb des Containments immobilisiert und nachfolgend mit einer Silikonschicht verkapselt, so daß es fest in dem Hohlraum eingeschlossen ist. Durch eine kleine Öffnung des Containments stehen das Enzym und die Elektrode mit der Meßlösung in Kontakt. Ionen der 6

7 Meßlösung können in die Enzymmatrix hineindiffundieren, welche bei Anwesenheit des Analyten H 2 O 2 erzeugt. Dieses wird an der Platinelektrode elektrochemisch umgesetzt. Einen Querschnitt des fertigen Glucosesensors mit der Anordnung der Platinelektrode und dem immobilisierten Enzym zeigt die Fig. 5. Da die Höhe des gemessenen Stroms sowohl durch die Konzentration der Glucose als auch durch die vorhandene Sauerstoffmenge beeinflußt wird (s. Gl. 1), ist sicherzustellen, daß der Umsatz der Glucose nicht durch eine zu geringe Sauerstoffkonzentration limitiert wird. Die Verkapselung der aktiven Schicht im Containment erfolgt daher vorzugsweise durch eine sauerstoffpermeable Membran. Das Ansprechverhalten des Sensors und die Signalintensität werden sowohl durch die Kinetik der enzymatischen Reaktion als auch durch Transportprozesse innerhalb der Polymermembran beeinflusst. Bei kinetisch kontrollierten Prozessen ist die enzymatische Reaktion nicht schnell genug, alle in Richtung Enzym diffundierenden Glucosemoleküle umzuwandeln. Die umgesetzte Menge hängt dann nur von der Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion ab und wird durch den Massentransport nicht beeinflusst. Da der Strom in diesem Fall abhängig von der Menge und der Aktivität des Enzyms (und damit auch von Alterungsprozessen) ist, wird der kinetisch kontrollierte Bereich beim Glucosesensor in der Regel vermieden. Stattdessen wird der Sensor im diffusionskontrollierten Bereich betrieben. Hierbei wird die gesamte Glucose, die zum Enzym diffundiert, auch umgesetzt. Die Diffusionskontrolle wird erreicht durch den Einsatz von Membranen mit geringer Permeabilität für Glucose bei gleichzeitig vorhandener hoher Enzymkonzentration. Durch die Diffusionskontrolle erzielt man ein stabiles Sensorsignal, selbst wenn sich die Aktivität oder die Konzentration des Enzyms verändern sollten. Die Glucosebestimmung auf Basis der H 2 O 2 -Produktion besitzt wegen des geringen Grundstroms eine recht hohe Empfindlichkeit. Hierdurch zeichnet sich der Sensor gegenüber anderen Sensoren aus, die eine Glucosebestimmung über die Messung des Sauerstoffverbrauchs vornehmen. Allerdings können durch die Mitanzeige weiterer oxidierbarer Substanzen, die in biologischen Lösungen in unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen können, Fehler bei der Glucosebestimmung auftreten. Störend können sich z.b. Ascorbinsäure, Harnsäure, Bilirubin als auch Medikamentenrückstände wie Paracetamol bemerkbar machen. Durch geeignete Maßnahmen (Differenzmessung, Diffusionsbarrieren für hochmolekulare Verbindungen, zusätzliche Reaktorelektroden) läßt sich die Beeinflussung durch diese Substanzen jedoch deutlich reduzieren. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit des Meßverfahrens ist der meßtechnisch nutzbare Bereich meist auf wenige Dekaden eingeschränkt. Mit zunehmender Glucosekonzentration verändert sich der Einfluß von Transportphänomen und Reaktionsabläufen innerhalb des Containments, so daß das Meßsignal schließlich einem Sättigungswert zustrebt. Um den linearen Meßbereich zu vergrößern, kann jedoch eine Membran zwischen Glucoselösung und enzymatisch aktiver Substanz plaziert werden, wodurch man eine Verringerung der Stoffmenge erreicht, die in das Containment diffundiert. Gemäß 1. Fickschen Gesetz führt eine Verkleinerung des Diffusionskoeffizienten dazu, daß der meßtechnische Sättigungswert (d.h. die maximal umsetzbare Anzahl von Glucosemolekülen pro Zeiteinheit) erst bei einem höheren Konzentrationsgradienten (d.h. höherer Glucosekonzentration) erreicht wird. 7

8 Herstellung der Sensoren Sämtliche Vorgänge zur Herstellung der Chips erfolgen im Reinraum, um gleichmäßige Klimabedingungen bei den verschiedenen Prozeßschritten zu gewährleisten und eine Kontamination der Chips mit Staubpartikeln zu vermeiden. Die einkristallinen Siliziumscheiben (Wafer) werden in mehreren Prozeßschritten zunächst oxidiert und nach Aufbringen eines lichtempfindlichen Lacks photolithographisch strukturiert. Belichteter Photolack und das darunter liegende Siliziumoxid werden anschließend entfernt, so daß man durch anisotropes Ätzen des nun freiliegenden einkristallinen Siliziums die Containments erzeugen kann. In nachfolgenden Schritten erfolgt dann die Metallisierung der Containments und das Aufbringen der Anschlußleitungen und Kontaktflächen. Abschließend wird der Wafer zersägt, so daß die einzelnen Chips zur Verfügung stehen. In weiteren Schritten muß nun das Enzym Glucoseoxidase auf der Platinelektrode immobilisiert werden. Hierzu wird ein Gemisch aus Glucoseoxidase und Polyvinylalkohol (PVA) in die Containments eingefüllt und anschließend durch Einfluß von UV-Licht eine Vernetzung der PVA-Moleküle ausgelöst. Die Glucoseoxidase befindet sich danach gleichmäßig verteilt in einer Matrix aus festem PVA und ist somit im Containment ortsfest eingeschlossen. Der so präparierte Chip kann nun in eine spezielle Halterung eingebaut werden, die die elektrische Kontaktierung der unterschiedlichen Elektroden wie auch den Anschluß an das Fluidiksystem ermöglicht. Die zu analysierende Flüssigkeit wird dem Sensor mittels Rollenpumpe mit einer definierten Geschwindigkeit zugeführt. Experimentelles Im Experiment sollen charakteristische Eigenschaften des Glucosesensors bestimmt werden. Es soll die Signalabhängigkeit von der Glucosekonzentration und die Beeinflussung des Signals durch eine Änderung der Betriebsparameter untersucht werden. Weitere Versuche sollen zeigen, wie spezifisch der Glucosenachweis ist und ob Störsubstanzen das Signal verfälschen können. Sensorpräparation Bevor zwei Chips für den Einsatz als Glucosesensoren konfiguriert werden, müssen die Abmessungen der Containmentöffnungen bestimmt werden, die mit dem Fließkanal in Verbindung stehen. Bei einem späteren Vergleich der Meßkurven müssen die Kontaktflächen bekannt sein, da die Größe der Öffnung das gemessene Signal stark beeinflußt. Die Bestimmung der Abmessungen erfolgt mittels Lichtmikroskop und Okularmikrometer. Im nächsten Schritt werden die Chips als Glucosesensoren konfiguriert. Das Befüllen der Containments mit einem Dispenser erfolgt dabei unter dem Stereomikroskop. 1. Stelle den Dispenser auf einen Druck von 1-2 bar ein und wähle als Zeit des Befüllvorgangs ca. 1 s. Hierdurch wird gewährleistet, daß eine konstante Menge des Membrancocktails in verschiedene Containments eingefüllt werden kann. 8

9 2. Fülle die Containments bis zum oberen Rand mit der diffusionshemmenden Membran aus photosensitivem Polyvinylalkohol und lasse die Flüssigkeit anschließend eintrocknen. 3. Das Komponentengemisch aus Glucoseoxidase und Polyvinylalkohol wird ebenso eingefüllt und sofort im Anschluß unter UV-Bestrahlung ausgehärtet. 4. Verkapsele die befüllten Containments mit Silikon und lagere die Chips anschließend für eine Stunde in einer feuchten Atmosphäre. Danach werden sie in eine Konservierungslösung gelegt. 5. Nach 24 Stunden ist der Sensor einsatzfähig. Elektrochemische Charakterisierung 1. Erstelle gepufferte Glucoselösungen mit einer Konzentration von 1, 2, 4, 6, 10, 15, 20, 30, 40, 50mM Glucose. 2. Charakterisiere die Platinelektrode eines Testchips mit Hilfe eines Voltamogramms. Bestimme zunächst das Signal in der Pufferlösung und anschließend in einer Pufferlösung, die 2mM H 2 O 2 enthält. Ermittle daraus einen geeigneten Arbeitspunkt für die amperometrische Bestimmung von H 2 O 2 3. Montiere einen fertigen Glucosechip in der vorgesehenen Halterung und lege eine Spannung von +600mV an die Arbeitselektrode. Bestimme mit der Pufferlösung die Fördermenge der Rollenpumpe für drei verschiedene Rotationsgeschwindigkeiten. 4. Bestimme das Signal des Glucosesensors bei einer Durchflußrate von 5µl/min für unterschiedlich konzentrierte Glucoselösungen (1, 2, 4, 6, 10, 15, 20, 30, 40, 50mM). 5. Ändere die Durchflußrate während des Experiments von 1µl/min auf 5µl/min und 10µl/min und bestimme das jeweilige Signal für Glucoselösungen mit 2 und 10mM Glucose. 6. Untersuche die Abhängigkeit der Sensorkennlinie von der Pufferkapazität 7. Untersuche, wie spezifisch der Nachweis von Glucose ist. Führe eine Messung mit Fructoselösung durch (U=+600mV, 5µl/min, 50mM). Kontrolliere den Sensor mit 10mM Glucoselösung. 8. Untersuche den Einfluß von Störsubstanzen auf die Glucosemessung. Bestimme zunächst das Signal bei 10mM Glucose und addiere während der Messung 1mM Ascorbinsäure. 9. Bestimme die Kennlinie des selbst konfigurierten Sensors (U=+600mV, Durchflußrate: 5µl/min, Glucosekonzentration: 1, 2, 4, 6, 10, 15, 20, 30, 40, 50mM Literatur M. Lambrechts, W. Sansen, Biosensors: Microelectrochemical Devices, Institute of Physics Publishing, Bristol, Philadelphia, New York, (1992) F. Scheller, F. Schubert, Biosensoren, Birkhäuser Verlag, Basel, (1989) C.H. Hamann, W. Vielstich, Elektrochemie I und II, Verlag Chemie, Weinheim (1981) R. Steinkuhl et al., Biosensors & Bioelectronics 11, 187, (1996) J. Perdomo et al., Biosensors & Bioelectronics 14, 27, (1999) 9