Immunologie. 6 Schritte zum richtigen Antikörper

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2 Bei über 5000 Produkten fällt die Wahl des richtigen Sekundärantikörpers nicht immer leicht. Dieser eitfaden soll Ihnen bei der Suche helfen! Besonders einfach wird die Auswahl der Sekundärantikörper auf unserer Web-Site. Durch das Anklicken der entsprechenden Produkteigenschaften in Dropdownmenüs gelangen Sie schnell zu den für Sie in Frage kommenden Produkten. Infos hierzu finden Sie in den mit WWW gekennzeichneten Informationskästen! Sie haben trotztdem noch Fragen? Wir beraten Sie gerne per oder telefonisch: Tel: Schritt: Gegen welche Spezies soll der Antikörper gerichtet sein? Dieses ist die Spezies, aus der der Primärantikörper stammt. Es stehen folgende Spezies zur Auswahl: amster, armenisch amster, syrisch uman und Kaninchen Katze Maus Meerschweinchen Pferd Ratte Rind Schaf Schwein Ziege Antikörper gegen amster IgG Nahezu alle monoklonalen Antikörper aus amster stammen von Maus-armenischer-amster-ybridoma. Die von diesen ybridoma produzierten IgG sind also armenische und nicht syrische IgG. Die meisten kommerziell erhältlichen polyklonalen anti-amster IgG Antikörper sind gegen syrischer amster-igg gerichtet und detektieren monoklonale Antikörper aus armenischem amster daher nicht so wirkungsvoll wie anti-armenischer amster IgG. Antikörper aus Schaf und Ziege: Zwischen IgG des Schafs und der Ziege besteht weitgehend omologie, so dass gegen Ziege generierte Sekundärantikörper auch für die Detektion von Primärantikörpern aus dem Schaf verwendet werden können. Umgekehrt eignen sich anti-schaf Reagenzien auch für den Nachweis von Primärantikörpern aus der Ziege. gehen Sie auf klicken Sie auf das Auswahlicon Sekund rantikörper Sekundärantikörper und Konjugate. Wählen Sie die Anti Spezies im Dropdownmenü.

3 2. Schritt: Aus welcher Wirtsspezies soll der Antikörper stammen? Erfahrungsgemäß sind Antikörper aus der Ziege oder dem Esel für den Nachweis von Primärantikörpern der meisten Spezies geeignet. Weitere Angaben entnehmen Sie bitte der Tabelle. Bei indirekten Mehrfachmarkierungen mit unkonjugierten Primärantikörpern sollten alle Sekundärantikörper-Konjugate möglichst aus derselben Wirtsspezies stammen, damit Kreuzreaktionen der Sekundärantikörper untereinander vermieden werden. Immunpräzipitation Sollen Antigen-Antikörper-Komplexe von anderen Komponenten mittels Protein A-Agarose getrennt werden, werden vorzugsweise Kaninchen-Antikörper eingesetzt. Diese binden besser an Protein A als Antikörper aus Ziege oder anderen Spezies. IgG aus Ziege, Schaf und Esel, aber auch aus Kaninchen binden gut an Protein G. Stark präadsorbierte Antikörper (siehe Schritt 5) aus dem Esel sind zwar spezifischer als die weniger adsorbierten aus anderen Wirtsspezies, können aber aus diesem Grund auch weniger sensitiv sein! Wählen Sie Aus Spezies im Dropdownmenü. Es stehen folgende Spezies zur Auswahl: Esel Kaninchen Maus Ratte Rind Schaf Ziege Anti-Spezies Aus-Spezies Esel Kaninchen Maus Ratte Schaf Ziege Meerschweinchen + + amster (arm.) + amster (syr.) + + uhn + + uman und + Kaninchen Katze + Maus Pferd + Ratte Rind + Schaf + + Schwein + Ziege Die Tabelle zeigt, welche Sekundärantikörper zum Nachweis welcher Primärantikörper geeignet sind.

4 3. Schritt: Gesamtmolekül (+), F(ab') 2 - oder Fab-Fragment? Achtung diese Auswahlmöglichkeit bezieht sich nicht auf die Spezifität des Sekundärantikörpers, sondern nur auf dessen Form! Ein Immunglobulin besteht aus je zwei identischen leichten ( ight) bzw. schweren ( eavy) Polypeptidketten, die ein Y bilden, d.h. spiegelsymmetrisch angeordnet sind. Der untere Bereich des Y wird aus den unteren Bereichen der - Ketten gebildet und als Fc-Fragment (fragment crystallizable) bezeichnet. Die beiden Arme, die jeweils aus dem oberen Teil der -Kette und einer -Kette gebildet werden, heißen Fab- Fragment (antigen binding fragment). Einsatz von Fab-Fragmenten Fab-Fragmente werden zur Blockierung und Doppelmarkierung von Primärantikörpern aus derselben Spezies oder als Blockierungsreagentien in der Immunhistochemie eingesetzt, bei denen das Zielgewebe und der Primärantikörper aus derselben Spezies stammen. Proteolytische Vorbehandlung mit Papain führt zur Spaltung in zwei monovalente Fab- Fragmente und das Fc-Fragment, während die proteolytische Behandlung mit Pepsin zur Spaltung in ein verkürztes Fc-Fragment und ein bivalentes F(ab') 2 -Fragment führt. Wählen Sie die IgG-Form im Dropdownmenü. Diese Angabe bezieht sich auf die aus Spezies! Es stehen folgende Möglichkeiten zur Auswahl: Antiseren gegen IgG-Gesamtmoleküle (anti- IgG (+)) werden vor allem für den Einsatz als Brückenantikörper bei der PAP- und APAAP-Methode empfohlen. Das IgG, Gesamtmolekül ist die am häufigsten verwendete Produktform und für die meisten Anwendungen am besten geeignet. F(ab') 2 -Fragmente werden verwendet, wenn verhindert werden soll, dass der Sekundärantikörper an Fc-Rezeptoren auf Zelloberflächen bindet, um so eine intergrundfärbung zu vermeiden. Sie haben bessere Diffusionseigenschaften, da sie kleiner als Gesamtmoleküle sind und können sie nicht über den Fc-Teil aggregieren. Beide Eigenschaften können für spezielle Anwendungen von Vorteil sein. Fab-Fragmente werden nur für sehr spezielle Anwendungen eingesetzt (s. Kasten). IgG limitierter Pepsin-Verdau Abbildung: Gesamtmolekül (+), F(ab')2- oder Fab-Fragment F(ab ) 2 kleinere Fragmente Fc-Rezeptorinteraktion mit Primärantikörpen Ein Primärantikörper, der in der Regel ein Gesamtmolekül ist, kann ebenfalls an Fc-Rezeptoren binden, so dass das Blocken mit Normalserum aus derselben Wirtsspezies wie der Sekundärantikörper stammt, nicht immer erfolgreich ist. weiterer Pepsin-Verdau Fab IgG Fab Fc 4 Papain-Verdau

5 4. Schritt: Welche Spezifität - anti-(+), anti-fc oder anti-f(ab') 2? Fünf Immunglobulinklassen lassen sich in Säugern unterscheiden (IgG, IgA, IgM, IgE und IgD). Die Unterschiede zwischen diesen Klassen befinden sich im Bereich der -Ketten. Bei ühnern werden die IgG-ähnlichen Antikörper aus historischen Gründen als IgY bezeichnet. Darüber hinaus werden IgG und IgA noch in vier bzw. zwei Subklassen eingeteilt, die untereinander geringere Unterschiede in der -Kette aufweisen als dies zwischen den auptklassen der Fall ist. anti-igg F(ab') 2 -Fragment: Diese Antikörper werden durch Immunisierung mit aufgereinigtem F(ab') 2 -Fragment des Gesamt-IgG gewonnen. Da der Anteil an schwerer Kette des F(ab') 2 -Fragments nur sehr schwach immunogen wirkt, erhält man auf diese Weise Antikörper, die, abhängig vom Grad ihrer Präadsorption (siehe Schritt 6), zu mehr als 60% gegen die leichte Kette gerichtet sind. Anti-F(ab') 2 -Fragment Antikörper werden zusätzlich gegen IgG Fc-Fragment präadsorbiert und reagieren deshalb nur mit dem Fab-Teil des IgG. Unterschiede sowohl zwischen den aupt- als auch den Subklassen treten ausschließlich im Bereich der -Ketten auf. Im Bereich der -Ketten gibt es zwei Varianten (κ und λ). Dabei überwiegt die κ--kette im Normalserum stark. Für die meisten Anwendungen im Bereich Western-Blot, Immunhistochemie und Durchflusszytometrie eignen sich Antikörper die gegen IgG (+) gerichtet sind. anti-igg (+): Die Tierspezies (z.b. Ziege), in der das Antiserum gewonnen werden soll ( Wirt ), wird mit aufgereinigtem IgG-Gesamtmolekül (+) (z.b. aus Maus) immunisiert. Das so gewonnene Antiserum enthält Antikörper, die sowohl gegen die leichte als auch gegen die schwere Kette des IgG-Moleküls gerichtet sind. Dieses Antiserum reagiert sowohl mit den F(ab') 2 -Anteilen als auch mit dem Fc-Anteil des IgG. Anti-IgG reagiert deshalb auch sehr gut mit anderen Immunglobulinklassen (IgM, IgA, IgE), da diese dieselben leichten Ketten (κ und λ) haben. Anti-IgG (+) Antikörper, die nicht präadsorbiert sind (siehe Schritt 6), besitzen ca. 40% - 60% Reaktivität mit leichten Ketten. Bei hoch adsorbierten anti-igg (+) Antikörpern kann diese wesentlich geringer ausfallen. So bindet z.b. Katalog-Nr XXX-147 nur zu 9% - 30% an leichte Ketten. anti-igg + IgM (+): In einer Mischung von anti-igg + IgM (+) variiert die Reaktivität mit leichten Ketten von 30% bis 45%. Die anti-igm- Gesamtreaktivität (einschließlich gegen leichte Ketten) in der Mischung liegt ca. zwischen 55% - 70%. Wählen Sie die Spezifität im Dropdownmenü. ier definieren Sie, gegen was der Antikörper gerichtet sein soll! Wichtig: In der Produktgruppe Sekundärantikörper und Konjugate finden Sie aus Gründen der internen Protuktsortierung nur (polyklonale) Antikörper der Firma Jackson Immunoresarch. Weitere (monoklonale) Antikörper, die ebenfalls als Sekundärantikörper einsetzbar sind, finden Sie in der Produktgruppe: Isotyp-spezifische Antikörper & Konjugate Mit diesen Immunreagenzien lassen sich alle lg-klassen und Subklassen (IgM, IgG1-4, IgA, etc.) gleichmäßig nachweisen. Diese Antikörper sind also optimal geeignet, wenn alle Ig-Klassen unabhängig von der Subklasse nachgewiesen werden sollen oder wenn nicht sicher ist, welcher Klasse der Primärantikörper angehört. Da das jeweilige Antiserum (z.b. aus der Ziege) überwiegend gegen leichte Ketten des κ-typs gerichtet ist, ist die Sensitivität von anti-f(ab') 2 -Fragment Antikörpern bei der Erkennung von Primärantikörpern, die leichte Ketten vom λ-typ tragen, eingeschränkt. Anti-IgG (Fc) oder anti-igg (+) Antikörper können hier eine höhere Sensitivität bieten. 5

6 Fortsetzung: Welche Spezifität - anti-(+), anti-fc oder anti-f(ab') 2 anti-igg, Fc-Fragment: Die Immunisierung (z.b. der Ziege) mit aufgereinigtem IgG Fc-Fragment (z.b. aus der Maus) führt zu Antikörpern, die hochspezifisch die schwere Kette des IgG-Moleküls detektieren. Da die Unterschiede der verschiedenen Immunglobulinklassen im Bereich der schweren Kette liegen, lassen sich hier sehr gut IgG, nicht aber IgM, IgA und IgE nachweisen. Diese Fc- Fragment-spezifischen Antikörper werden zusätzlich gegen F(ab') 2 -Fragmente präadsorbiert. In einigen Fällen wird zudem eine mögliche Kreuzreaktion gegen IgM und IgA (anti-uman) oder nur gegen IgM (anti-maus, anti-ratte) durch weitere Präadsorption(en) minimiert. Diese Antikörper (anti-uman, anti-maus, anti-ratte) sind durch Fcγ gekennzeichnet. Sie weisen weniger als 1% Restaktivität gegen leichte Ketten oder IgM bzw. IgA auf. Vorsicht: Anti-IgG (Fc) Antikörper reagieren nicht mit allen IgG Subklassen gleich gut wie anti-igg, F(ab') 2 -Fragmentspezifische Antikörper. Wegen des geringen Prozentsatzes an Antikörpern gegen die seltenen IgG-Subklassen (IgG3 und IgG4) sollten zum Nachweis dieser Subklassen besser anti-igg (+) oder anti-igg F(ab') 2 -Antiseren verwendet werden. Schritt 5: Welche Konjugation? Die Wahl der Konjugate hängt von der eingesetzten Methode und der gewünschten Art der Detektion ab (enzymatisch, verstärkt, direkt, etc.). Insbesondere bei den Fluoreszenzfarbstoffen ist darauf zu achten, dass die notwendigen Anregungsquellen und Filter zur Verfügung stehen. Auf der nächsten Seite finden Sie drei Tabellen mit Basisinformationen, die Ihnen die Auswahl der richtigen Konjugation erleichtern soll. Für fluoreszenzbasierte Methoden in der Immunhisto- und Zytochemie empfehlen wir Ihnen, generell photostabile Farbstoffe wie Carbocyanine (z. B. Cy2, Cy3) traditionellen Farbstoffen (z. B. FITC, TRITC) vorzuziehen. Für einen Nachweis der Maus IgG-Subklassen mit annähernd gleicher Sensitivität empfehlen wir den Ziege anti-maus IgG (Subklassen 1, 2a, 2b und 3) Fcγ-Fragmentspezifischen Antikörper (Katalog-Nr. 115-XXX-164), der eine ausgeglichenere Reaktivität gegenüber diesen Subklassen besitzt. anti-igm (µ-kette), anti-igm Fc 5µ : Zur erstellung von IgM-spezifischen Antikörpern wird die Wirtsspezies (z.b. Ziege) mit aufgereinigtem IgM (Maus und Ratte) oder Trypsin-verdautem, gereinigten IgM Fc 5µ (uman) immunisiert. Nach affinitätschromatographischer Reinigung werden die anti-maus und anti-ratte IgM (µ-kette)- spezifischen Antikörper gegen IgG adsorbiert. Die anti-uman IgM Fc 5µ werden gegen IgG und IgA adsorbiert. Die anti-igmspezifischen Antikörper weisen in der Regel weniger als 1% Restaktivität gegen IgG oder leichte Ketten auf. Wählen Sie Konjugation im Dropdownmenü. Starten Sie die Suche durch anklicken des Suchen-Buttons: Sie erhalten eine Trefferliste mit allen Produkten die Ihre Kriterien erfüllen. Aus der iste können Sie sich ein Produkt mit passender Adsorption aussuchen (s. Schritt 6, Seite 8) 6

7 Fortsetzung: Welche Konjugation? Tabelle 1: Anwendungen und empfohlende Verdünnungen für Antikörper und Konjugate Konjugat EISA Western Blot Unkonjugiert µg/ml isto-/ Zytochemie Durchflusszytometrie Cy2 und andere Fluorophore 1:50 1:200 1:50 1:200 Cy3 und Cy5 1:100 1:800 1:100 1:800 Phycoerythrin (1:50 1:200) 1:50 1:200 APC (Allophycocyanin) 1:50 1:200 Peroxidase (RPO) 1: : : : (non-ec) 1:500 1: : : (EC) Alkalische Phosphatase 1: : : : :500 1:5.000 Biotin-SP für den Nachweis mit fluorochromiertem Streptavidin 1:200 1: :200 1:1.000 mit Enzym-konjugiertem Streptavidin 1: : : : :500 1: nm Gold 1:20 1:200 6, 12 nm Gold 1:20 1:40 18 nm Gold 1:10 1:20 Tabelle 2: Anregungs- Emmisionsmaxima für Fluorochrome Fluorochrome Anregung(nm)** Emission(nm) ** Farbe AMCA Aminomethylcoumarin-Acetat blau FITC* Fluorescein-Isothiocyanat gelb-grün Cy2 Carbocyanin gelb-grün Cy3 Indocarbocyanin rot TRITC Tetramethyl-Rhodamin rot R-PE Phycoerythrin* 488/ orange-rot Rhod. Red-X Rhodamin Red-X rot Texas Red Rhodaminderivat rot Cy5 Indodicarbocyanin tief-/infrarot APC Allophycocyanin tief-/infrarot Tabelle 3: Enzyme und Substrate Enzym Substrat Produktfarbe Alkalische Phosphatase BCIP/NBT dunkelblau-violett Fast Red Neufuchsin RPO DAB braun AEC TMB rot (intensivrot) rosarot (fuchsinrot) rotbraun dunkelblau 7

8 6. Schritt: Welche (Prä)-Adsorption Prinzipiell können Antikörper einer bestimmten Spezies mit Serumproteinen vieler anderer Spezies mehr oder weniger stark kreuzreagieren. Deshalb werden Antikörper teilweise gegen Serumproteine einer oder mehrerer Fremdspezies präadsorbiert, wodurch eine Kreuzreaktivität mit Molekülen dieser Spezies weitgehend ausgeschlossen werden kann (Kreuzreaktivität < 1%). Die deutsche Bezeichnung adsorbiert gegen:... wird im englischen Sprachraum dabei als minimal crossreactivity (minx) bezeichnet. Dies wird empfohlen, wenn die mögliche Anwesenheit von Immunglobulinen anderer Spezies im Versuchsansatz zu Kreuzreaktionen führen kann. Beispiel: Sie wollen ein Protein mit einem Kaninchenserum im Western Blot nachweisen. Als Detektionsreagenz setzen Sie EC ein. Sie wählen: IgG-Form: IgG, Gesamtmolekül Aus Spezies: Ziege Anti Spezies: Kaninchen Konjugation: RPO Die Suche führt zu einer Produktliste, in der Sie die gewünschte Adsorption wählen können und weitere Möglichkeiten haben! Falls mehrere Präadsorptionen angeboten werden, sollte berücksichtigt werden, dass Antikörper, die gegen zu nahe verwandte Spezies adsorbiert wurden, z.t. eine stark reduzierte Epitoperkennung aufweisen und deshalb einige monoklonale Antikörper nur noch schwach erkennen. Dies gilt insbesondere für anti-maus IgG (adsorbiert gegen Ratte), anti-ratte IgG (adsorbiert gegen Maus) oder anti-(arm.)amster IgG (adsorbiert gegen Maus, Ratte). Präadsorbierte Antikörper reagieren möglicherweise mit einigen IgG-Subklassen v. a. IgG2b, IgG2c und IgG3) nicht gut. Dies gilt besonders für die Subklassen, die weitestgehend homolog mit der Spezies sind, gegen die präadsorbiert wurde, d.h. insbesondere bei nahe verwandten Spezies. So sollte beispielsweise anti-maus IgG, das gegen Ratten-IgG präadsorbiert wurde, nur eingesetzt werden, wenn ein Primärantikörper aus der Maus a) in Rattengewebe, welches Ratten- Immunglobuline enthält oder b) in anderen Geweben neben einem Primärantikörper aus der Ratte nachgewiesen werden soll. Rinderserumalbumin (BSA) und Trockenmilch aus Rind enthalten meist Verunreinigungen boviner Immunglobuline, welche mit anti-rind, anti-ziege, anti-pferd und anti-schaf IgG Antikörpern reagieren. Daher kann die Verwendung von BSA Durch Anklicken der Katalognummer kommen Sie zu einer Seite mit weiteren Produktinformationen. Fügen Sie das Produkt zu Ihrem Notizzettel hinzu. Sie können weitere Produkte suchen und später eine iste ausdrucken oder speichern. und/oder Trockenmilch zur Blockierung oder Verdünnung dieser Sekundärantikörper die intergrundfärbung signifikant erhöhen oder den Antikörpertiter reduzieren. Um dieses Problem zu umgehen, empfiehlt sich die Verwendung von speziell IgG-freiem BSA von Jackson ImmunoResearch (z.b. Katalog-Nr ). 8