Biophysikalische Chemie. Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg. Praktikum Biophysik. Elastizitätsmessungen an lebenden Zellen

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1 Biophysikalische Chemie Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Praktikum Biophysik Elastizitätsmessungen an lebenden Zellen

2 Inhaltsverzeichnis 1 Theoretische Grundlagen Allgemeines Stichpunkte zur Vorbereitung Die Rasterkraftmikroskopie Aufbau Funktionsweise Abbildungsmethoden Die Kraftspektroskopie Approach Retraction Das Hertz Modell Die Viskoelastizität Das Zwei-Platten-Modell Viskose Flüssigkeiten Elastische Festkörper Viskoelastische Substanzen Biologische Proben Zellkultur Fibroblasten Fixierung Elastizität in der Biologie Versuchsdurchführung und Auswertung Vorbereitung biologischer Proben Messung des E-Moduls an lebenden Fibroblasten

3 Kapitel 1 Theoretische Grundlagen 1.1 Allgemeines In diesem Versuch sollen die Elastizitäten von lebenden Fibroblasten (Zellen des Bindegewebes) an verschiedenen Stellen gemessen werden. Dazu wird ein atomares Kraftmikroskop benutzt, welches ursprünglich entwickelt wurde um Oberflächen abzubilden. Mehr und mehr wurde jedoch auch das direkte Messen von Kräften, die Kraftspektroskopie eine vielfach benutzte Anwendung dieses Mikroskops. Als Kraftmesser dient ein Hebelarm der eine gewisse Federkonstante besitzt, vergleichbar mit einer Springfeder. An der Vorderseite dieses Arms ist eine kleine nach unten gerichtete Spitze angebracht, mit der in die Zelle hineingedrückt wird. Aus der Verbiegung des Arms kann die Kraft berechnet und dann die Elastizität bestimmt werden (siehe hierzu nachfolgende Abschnitte) Stichpunkte zur Vorbereitung atomares Kraftmikroskop (engl.: Atomic Force Microscope) Kraftspektroskopie Cantilever Piezo (Visko-)Elastizität Hertz-Modell Fibroblasten Zellkultur 1.2 Die Rasterkraftmikroskopie Die Raster-Kraftmikroskopie und hierauf aufbauenden Technologien werden i. A. zur Untersuchung und Bearbeitung von Oberflächen aller Art im Nanometerbereich verwendet. G. Binnig und G. Rohrer entwickelten am IBM-Forschungslabor in Zürich das sog. Raster-Tunnelmikroskop (STM Scanning Tunneling Microscope ), wofür sie 1986 gemeinsam den Nobelpreis für Physik erhielten (1.1). Das STM stellt die Grundlage aller 2

4 KAPITEL 1. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 3 Abbildung 1.1: Die Familie der Raster-Sondenmikroskope. Angepasst aus [3]. weiteren Geräte dar, die heute in großer Zahl vorliegen und der Abbildung oder Manipulation von Oberflächen aller Art dienen (siehe 1.1 ). Wie beim STM erfolgt die Untersuchung beim Raster-Kraftmikroskop in der Regel zerstörungsfrei und hochauflösend hinsichtlich der Topographie von Proben bzw. selektiv bzgl. deren verschiedenster physikalischer und biologischer Eigenschaften. Es ist in der Lage sehr kleine ( N) Kräfte zu messen, welche auftreten, wenn Atome oder Moleküle miteinander in Wechselwirkung treten. Daher wird oft von einem Atomic Force Microscope oder AFM gesprochen Aufbau Ein AFM hat mit einem optischen Mikroskop ziemlich wenig gemein. Es gibt weder eine Lichtquelle noch optische Abbildungssysteme oder Okulare. Das eigentliche Abbildungsprinzip ist mechanischer Natur. Abbildung 1.2: Das in diesem Versuch verwendete Raster-Kraftmikroskop von JPK Instruments. Angepasst aus [3]. Der wichtigste Bestandteil eines AFM s ist der sog. Cantilever dessen Bewegung mit Hilfe eines Lasersystems (Laser + Detektor) aufgezeichnet wird. Der Cantilever besteht aus einem federnden Hebelarm an dessen Vorderseite eine meist rechtwinklig nach unten gerichtete Spitze, der Cantilever-Tip (Abb. 1.3), angebracht ist. Am gegenüberliegenden Ende ist dieser Hebelarm mit seinem Träger dem sog. Chip verbunden. Der Cantilever kann

5 KAPITEL 1. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 4 physikalisch als eine einfache Springfeder beschrieben werden. Die wichtigste Eigenschaft jeder Feder ist die Federkostante k [N/m]. Sie ist eine Materialkonstante und hängt im Wesentlichen von den Parametern Länge und Breite des Cantilevers sowie seiner Dichte ab. Die Federkonstanten von gängigen Cantilevern liegen zwischen 0, 005 N/m und 40 N/m. Der Cantilever Chip ist an ein Piezoelement angebracht, welches die Bewegungen in z- Richtung des Cantilevers mit hoher Präzision (Nanometerbereich) steuert. Für größere Bewegungen besitzt das AFM einen sog. Stepper Motor mit dem ebenfalls die Bewegung in z-richtung gesteuert werden kann. Oftmals wird ein Rasterkraftmikroskop auf ein inverses optisches Mikroskop gesetzt, so dass die Probe bzw. der Cantilever vor und während der Messung betrachtet werden können. Abbildung 1.3: Elektronenmikroskopische Aufnahmen eines Cantilevers von vorne mit der Spitze in diesem Fall nach oben gerichtet (links) und der Cantileverspitze (rechts) Funktionsweise Das Hauptprinzip eines Rasterkraftmikroskops ist die Messung atomarer Kräfte zwischen dem Cantilever-Tip und der Oberfläche der Probe. Diese Kräfte können je nach Probe und Anwendung anziehender oder abstoßender Natur sein. Im Allgemeinen treten nahe an der Probe (< 10 Angström) abstoßende elektrostatische Kräfte auf (repulsives Regime) und der federnde Hebelarm wird in diesem Bereich von der Probe weggelenkt, weiter von der Probenoberfläche entfernt (10 bis mehrere 100 Angström) sind die auftretenden Kräfte anziehend (attraktives Regime) und der Cantilever wird zu der Oberfläche hingezogen. Diese Auslenkungen des Cantilevers aus der Ruhestellung in z-richtung können aufgezeichnet werden und man bekommt so Informationen über abstoßenden/anziehenden Kräfte auf der Oberfläche der Probe. In erster Linie wird dies benutzt um die Topographie der Probenoberfläche zu rekonstruieren aber je nach Art des verwendeten Cantilevers können auch Informationen über mechanische, chemische, elektrostatische oder magnetische Eigenschaften der Probe gewonnen werden. Der Cantilever ist an einem Chip angebracht welcher wiederum auf einem Piezoelement befestigt wird. Mit dem Piezoelement kann die Position des Cantilevers in z-richtung sehr fein gesteuert werden. Die Messung der Cantilever Position erfolgt nach dem Prinzip eines optischen Hebels. Dafür wird ein Laser möglichst auf den vorderen Teil des Cantilevers

6 KAPITEL 1. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 5 Abbildung 1.4: Ein Infrarotlaser wird auf die Oberfläche des Cantilevers fokussiert, dort reflektiert und von einer Vier-Quadranten-Photodiode detektiert. Die Position des Lasers verändert sich mit der Auslenkung des Cantilevers. Angepasst aus [3]. fokussiert, wo er reflektiert wird und der ausfallende Strahl dann auf einen Detektor trifft. Ein optischer Hebel hat den Vorteil, dass eine winzig kleine Auslenkung des Cantilevers (oft ist diese im einstelligen Nanometerbereich) in einer wesentlich größeren und sehr viel einfacher messbaren Positionsänderung des Laserstrahls auf der Diode resultiert. Die Mehrzahl der AFMs verwendet eine Photodiode, die aus vier gleich großen, separat auslesbaren Diodenfeldern A,B,C und D besteht (Abb. 1.4), sog. Vier-Quadranten-Photodiode. Das Signal einer Photodiode wird in Volt gemessen. Auf diese Weise kann die Auslenkung des Cantilevers in zwei Richtungen: (i) vertikal (Vertical Deflection) und (ii) horizontal (Lateral Deflection) gemessen werden. Die Vertical Deflection wird berechnet indem das Signal der oberen mit dem Signal der unteren Diodenfeldern verglichen wird. Die Lateral Deflection repräsentiert das Verdrillen des Cantilevers und wird berechnet indem das Signal der rechten mit dem Signal der linken Diodenfelder verglichen wird. Die Abweichung des Laserstrahls aus der Mitte der vier Diodenfelder zieht eine Spannungsänderung nach sich und die Auslenkung wird deswegen zunächst in Volt ausgegeben. Um daraus die tatsächliche Auslenkung bzw. Bewegung des Cantilevers zu erhalten, muss das Cantilever-Laser System vor jeder Messung kalibriert werden, d.h es muss eine Beziehung zwischen Auslenkung des Laserstrahls und Auslenkung des Cantilevers hergestellt werden. Diese ist nicht immer gleich, da sie selbstverständlich von der Position des Lasers auf dem Cantilever abhängt. Um die Beziehung zu bestimmen, drückt man mit dem Cantilver auf eine sehr harte Oberfläche, welche nicht nachgibt, denn hier entspricht die Auslenkung des Cantilevers nach oben (von Probe weg) genau der Piezobewegung nach unten (zur Probe hin). Die Piezobewegung und Auslenkung des Laserstrahls werden beide gemessen und somit weiß man nun wie Auslenkung des Lasers mit der Auslenkung des Cantilevers in Beziehung steht. Kennt man nun noch die Federkonstante k kann man auch die zugehörigen Kräfte angeben. Denn es gilt: Wird der Cantilever um eine Strecke s [m] aus der Ruhelage ausgelenkt, kann die dazu nötige Kraft F [N] gemäß dem Hookeschen Gesetz wie folgt

7 KAPITEL 1. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 6 berechnet werden: F [N] = k s (1.1) F = - ks Abbildung 1.5: Ein Cantilever verhält sich wie eine einfache Feder mit einer bestimmten Federkonstante. Diese wird nur von den Fertigungs- bzw. Materialeigenschaften des Cantilevers beeinflusst. Angepasst aus [3] Abbildungsmethoden Der Kontaktmodus (engl.: Contact Mode) Im Fall des Kontaktmodus wird der Tip des Cantilevers in Kontakt mit der zu untersuchenden Oberfläche gebracht und es treten nur abstoßende Kräfte auf (repulsives Regime). Vereinfacht kann von einem leichten Kratzen über die Probenoberfläche gesprochen werden. Dabei wirken aufgrund der Überlappung der Elektronenwolken der Atome zwischen dem Tip und der Probe Abstoßungskräfte mit extrem kurzen Reichweiten. Entweder wird nun die Höhe konstant gehalten und die Cantileverauslenkung spiegelt das Höhenprofil wider oder die abstoßende Kraft zwischen Tip und Probe wird konstant gehalten, indem das Piezoelement in z-richtung derart nachregelt, dass die Verbiegung des Cantilevers konstant bleibt. Hier repräsentiert nun die Bewegung des Piezoelements das Höhenprofil der Probe. Erstere Methode ist nur geeignet für sehr glatte Oberflächen, wohingegen die zweite Methode auch für rauere Oberflächen angewandt werden kann. Die Untersuchung im Kon- Abbildung 1.6: Im Kontaktmodus befinden sich die Cantilever-Spitze und die Probe im unmittelbaren Kontakt. Angepasst aus [3]. taktmodus ist eine einfache und effektive Methode. Sie ist jedoch anfällig für Störungen

8 KAPITEL 1. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 7 (z.b Schwingungsübertrag) und bei sensiblen Proben kann sie auch zur Beschädigung dieser führen oder aber die Cantileverspitze nutzt sich ab, was in einer verminderten Auflösung resultiert. Der Nicht-Kontaktmodus (engl.: Non-Contact Mode) Im Nicht-Kontaktmodus wird der Tip eines Cantilevers der Probe lediglich stark angenähert, was die Möglichkeit eröffnet, Materialien vollständig zerstörungsfrei und ohne Schwingungsübertrag zu untersuchen. Der Cantilever befindet sich also knapp überhalb der Probe und wird durch einen piezoelektrischen Wandler zu Schwingungen angeregt. Bei maximaler Auslenkung nach unten kommt er der Probe so nahe, dass die anziehenden van der Waals Kräfte wirken. Die Anregung des Cantilevers geschieht meist mit oder nahe überhalb seiner Resonanzfrequenz, d.h. es wird eine Oszillation mit einer best. Amplitude und Phase induziert. Eine Änderung der Anziehungskräfte (auf Grund von Abstandsänderungen zwi- Abbildung 1.7: Im Nicht-Kontaktmodus berühren sich die Cantilever-Spitze und die Probe nicht. Angepasst aus [3]. schen Tip und Probe) äußert sich in einer Änderung der Resonanzfrequenz des Cantilevers. Diese Änderung kann nun benutzt werden, um Informationen über die Cantilever-Proben Interaktion zu erhalten. In der sog. Frequenzmodulation wird die Resonanzfrequenz als Feedbacksignal benutzt und durch Nachregeln des Cantilever-Probenabstands mit Hilfe des Piezoelements konstant gehalten. Meist wird dem Cantilever jedoch durchgehend eine feste Frequenz, die nicht genau der Resonanzfrequenz entspricht, aufgedrängt. Eine Änderung der Resonanzfrequenz des Cantilevers, durch anziehende Kräfte, bewirkt in diesem Fall eine Phasenverschiebung zwischen Schwingung des Cantilevers und der Anregungsfrequenz, sowie eine Amplitudenänderung. Beide Parameter können ebenfalls als Feedbacksignal benutzt und konstant gehalten werden (Amplituden- oder Phasenmodulation). Mit dieser Methode kann man zusätzlich zum Höhenprofil auch Auskunft über bestimmte Materialeigenschaften (z.b. Dichte) erhalten. Der Nicht-Kontakt Modus wird oft im Vakuum eingesetzt weil die Kräfte sehr gering sind und im Vakuum Störungen deutlich verringert werden können. Im Vakuum wird auch verhindert, dass sich der unter normalen Bedingungen oftmals entstehende Wasserfilm auf der Probe bildet, der die Messung negativ beeinflusst. Allerdings ist es im Vakuum schwierig biologische Materialien und gar unmöglich z.b. lebende Zellen zu untersuchen.

9 KAPITEL 1. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 8 Der Intermittierende Kontaktmodus (meist engl.: Tapping Mode) Praktische Bedeutung hat deshalb vor allem der intermittierende Betriebsmodus des AFMs erlangt. Er stellt eine Kombination aus den beiden vorherigen Methoden dar. Hier oszilliert die Mikroskopspitze etwas näher an der Probenoberfläche und berührt diese bei jeder Annäherung kurz. Vakuum ist nicht nötig und die direkte Interaktion von Cantileverspitze und Probe ist trotzdem deutlich geringer als im Kontakt Modus, was von Vorteil sein kann, wenn man biologische Materialien untersuchen möchte. In der Nähe (bzw. durch "Berühren") der Probenoberfläche wird die Oszillation infolge der dort wirkenden Kräfte gedämpft, die Amplitude wird verkleinert. Das Piezoelement kontrolliert mit Hilfe eine Rückkopplungselektronik die Höhe des Cantilevers derart, dass die dämpfungsbedingt verringerte Schwingungsamplitude zwischen Anregung und Schwingung des Cantilevers konstant bleibt. Die mittlere z-koordinate der Spitze folgt somit wieder der Probentopographie. Dies erfolgt mit einem gegenüber dem Kontaktmodus wesentlich Abbildung 1.8: Im intermittierendem Kontaktmodus osziliert der Cantilever mit einer bestimmten Frequenz. Dadurch vermindert sich die Interaktionszeit des Tips mit der Oberfläche und somit auch die Wahrscheinlichkeit die Probe zu beschädigen. Angepasst aus [3]. verringerten Energieumsatz, so dass auch bei dieser Messmethode gegen Beschädigungen anfällige Proben untersucht werden können. Das Auslesesignal Das Scannen eines Bereichs der Probenoberfläche geschieht Zeilenweise, wobei jede Zeile zwei Mal abgetastet wird. Es werden sog. trace ( Hin-Spur ) und retrace ( Rück-Spur ) Signale aufgenommen. Aus der Bewegung des Piezos erhält man das Höhenprofil der Probe. In den dynamischen Modi (Cantilever schwingt) erhält man über das zusätzlich aufgezeichnete Phasen-Bild (falls Phase nicht als Feedbackparameter dient) noch zusätzliche mechanische Eigenschaften (z.b. Härte, Elastizität) der Probe (siehe 1.10). So kann zum Beispiel im Phasenbild die Oberflächenstruktur einer Proben, hinsichtlich ihrer Festigkeit differenziert werden, obwohl sich die verschiedenen Oberflächenbereiche nicht im Höhenprofil unterscheiden. Darüber hinaus kann das Phasenbild auch als Technik zur Kontrastverstärkung von nur schwach ausgeprägten Stufen oder Kanten eingesetzt werden. Das Abbilden von Proben mit einem AFM hat nicht nur Vorteile. Alle AFM-Abbildungen sind das Ergebnis der Tip-Probe Interaktion oder anders formuliert: die Probe wird mit dem AFM-Tip gesehen. Dies bringt eine Reihe von Abbildungsfehlern mit sich. Einer davon ist unvermeidlich und hat seinen Ursprung in der Form der Tips. Das bedeutet, dass

10 KAPITEL 1. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 9 Abbildung 1.9: Links: Fibroblast, Höhenprofil aufgenommen unter physiologischen Bedingungen Rechts: Phasen-Bild aus dem selben Datensatz. Der wesentlich weichere Kern und einige härtere Aktinfilamente des Cytoskeletts sind hervorgehoben. Abbildung 1.10: Eine AFM Abbildung wird direkt von der Form der Tips beeinflusst. Angepasst aus [3]. keine Strukturen fehlerfrei abgebildet werden können, die kleiner sind als der Tip selbst (Abb. 1.10). 1.3 Die Kraftspektroskopie Da die Funktionsweise des AFM s auf zwischenmolekularen und atomaren Kräften basiert, können diese selbstverständlich auch bestimmt werden. Dies wird allgemein als Kraftspektroskopie bezeichnet. Mit entsprechend kleinen Federkonstanten können Kräfte im Bereich von einigen pn gemessen werden. Bei der Kraftspektroskopie scannt der Cantilever die Oberfläche nicht, sondern er wird nur in z- Richtung an einer Stelle der Probe bewegt. Das Resultat ist ein Kraftspektrum (Kraft-Abstandskurve), dies bedeutet, dass Kräfte die auf den Cantilever wirken in Abhängigkeit von dem Probe-Tip Abstand 1 gemessen und dargestellt werden. Somit kann man z. B. Anziehungskräfte zwischen Probe und Cantilever messen. Eine andere Anwendung wäre z.b. Polymere, die auf einer Oberfläche fixiert sind, an den Cantilever zu koppeln und dann auseinander zu ziehen und dabei die Kräfte zu messen. Oder man kann sogar ganze Zellen von der Oberfläche abreißen und somit die Adhäsionskraft der Zelle bestimmen. Auch die Elastizitätsmessung ist eine Kraftspektroskopie, da man die Kraft während des 1 Streng genommen ist das nur solange korrekt, bis der Cantilever die Probe berührt. Sind Cantilever und Probe in Kontakt und wird das Piezo dennoch weiter ausgedehnt, wird der Cantilever gemäß seiner Federkonstante nach oben ausgelenkt, solange er nicht in die Probe eindringen kann bzw. diese zerstört. D.h. er kompensiert die Bewegung des Piezos durch eine Auslenkung nach oben. Das bedeutet aber, dass der Abstand von Probe zu Cantilever zwar Null ist, die Kraft-Abstandskurve aber gemäß der z-bewegung des Piezos weitergeführt wird und nicht gemäß Abstand von Probe-Cantilever.

11 KAPITEL 1. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 10 Eindrückvorgangs aufzeichnet und daraus die Elastizität berechnen kann. Allgemein kann der Vorgang der Kraftspektroskopie in zwei Bereiche eingeteilt werden. Das Annähern an die Probe der sog. Approach und das Entfernen von der Probe die sog. Retraction Approach Beim Approach wird der Cantilever, gesteuert vom Piezzoelement, nach unten (Richtung Probe) bewegt. Dabei wird der Tip immer weiter an die Probe angenähert bis er in die Reichweite von den Van der Waals Kräften gelangt. Sind diese stark genug, springt dieser Abbildung 1.11: Approach, der Cantilever wird zur Probe hin bewegt. Links: Ausgangslage des Cantilevers Mitte: Wirkungsbereich von langreichweitigen Adhäsionskräften. Rechts: Die Bewegung wird erst dann gestoppt, wenn ein voreingestellter Wert der Auslenkung erreicht ist. Angepasst aus [3]. schlagartig auf die Probenoberfläche ( jump to contact ). Wird die Bewegung fortgesetzt verbiegt sich der Cantilever bis zu einem voreingestellten Wert (Abb. 1.11). Dabei wird Abbildung 1.12: Links: Schematische Darstellung einer Approach-Kurve auf einer sehr harten Oberfläche. Rechts: Schematische Darstellung einer Retraction-Kurve auf einer sehr harten Oberfläche. Angepasst aus [3]. der Druck auf die Probe proportional zu der Auslenkung des Cantilevers erhöht. Das während dem Approach gemessene Signal ist in der Abbildung 1.12, Links dargestellt. Die z-bewegung des Cantilevers wird üblicherweise auf der Abszisse (x-achse) aufgetragen. Auf der Ordinate (y-achse) wird die Auslenkung des Cantilevers aufgetragen, wobei (hier) positive Werte eine Auslenkung nach oben also eine Abstoßung und negative Werte eine Auslenkung nach unten und somit eine Anziehung bzw. Adhäsion repräsentieren. Befindet sich der Cantilever in der Ruhelage ist die Auslenkung in y-richtung Null.

12 KAPITEL 1. THEORETISCHE GRUNDLAGEN Retraction Abbildung 1.13: Retraction, der Cantilever wird von der Probe weg bewegt. Links: Start der Bewegung nach unten. Mitte: Adhäsion. Rechts: Rückkehr in die Ausgangslage. Angepasst aus [3]. Bei der Retraction wird der Cantilever solange nach oben (von der Probe weg) bewegt bis der ursprüngliche Abstand zwischen Probe und dem Cantilever wiederhergestellt ist. Ist die Wechselwirkung zwischen dem Tip und der Probe anziehender Natur, bleibt dieser zunächst auf der Probe kleben. Während der weiteren Bewegung wird der Zug auf den Cantilever proportional zu der Auslenkung aus der Ruhelage solange erhöht, bis die aufgebaute Zugkraft groß genug ist, um die Anziehung zu überwinden. Ist dies der Fall, kehrt der Cantilever schlagartig in die Ruhelage zurück. Das während der Retraction gemessene Signal ist in der Abbildung 1.12, rechts dargestellt. Auch hier wird die z-bewegung des Cantilevers auf der Abszisse und seine Auslenkung aus der Ruhelage auf der Ordinate aufgetragen. 1.4 Das Hertz Modell Bei Elastizitätsmessungen mit dem AFM, kann das Verhalten von elastischen Festkörpern unter dieser Art Belastung mit der Theorie von [2] beschrieben werden. Diese Theorie ergänzt durch [6] beschreibt das Verhalten elastischer Körper unter der externen Belastung (hier) mit einer kegelförmigen Spitze (AFM Tip). Wird eine kegelförmige Spitze mit dem halben Öffnungswinkel α gegen eine flache elastische Oberfläche gedrückt hängt die angreifenden Kraft F quadratisch von der Eindringtiefe z der Spitze ab: wobei E Y F ( z) = 2E Y tan(α) π das relative E-Modul des Systems darstellt: 1 E Y = 1 µ2 tip E tip Y + 1 µ2 sample E sample Y z 2 (1.2) (1.3) µ ist die Querkontraktionszahl (engl.: Poisson ratio) die bei Zellen 0.5 entspricht. (Näheres hierzu im nach folgenden Abschnitt) Ist das E sample Y << E tip Y, dann gilt: 1 E Y 1 µ2 sample E sample Y (1.4)

13 KAPITEL 1. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 12 Abbildung 1.14: Schematische Darstellung eines Kraft-Eindringtiefe-Diagramms (Approach). Für harte (b) und weiche Substrate (c) [7]. und somit F ( z) = 2Esample Y tan(α) π(1 µ 2 sample ) z2 (1.5) Vereinfacht stellt die so gewonnene Kraft-Eindringtiefe-Kurve eine Parabel dar: F ( z) = a z 2 (1.6) mit dem Koeffizienten: a = 2Esample Y tan(α) π(1 µ 2 sample ) (1.7) 1.5 Die Viskoelastizität (Anm.: Dieser Abschnitt erläutert die korrekte Theorie für viskoelastische Materialien wie z.b. Zellen. Im Versuch wird jedoch nur die elastische Komponente der Zellen bestimmt werden, wie im Abschnitt vorher beschrieben wurde.) Die Viskoelastizität beschreibt das Deformations- und Fließverhalten von Substanzen. Idealisiert unterscheidet man dabei zwischen dem Fließen von idealviskosen Flüssigkeiten und dem Verformen von idealelastischen Festkörpern. Alle realen Substanzen besitzen sowohl einen viskosen, wie auch einen elastischen Anteil und werden dementsprechend als viskoelastisch bezeichnet. Das viskoelastische Verhalten hängt neben den Materialeigenschaften unter anderem auch von: ab. der Art der Belastung der Höhe der Belastung der Dauer der Belastung der Temperatur

14 KAPITEL 1. THEORETISCHE GRUNDLAGEN Das Zwei-Platten-Modell Das Zwei-Platten-Modell dient (hier) zur Definition von physikalischen Größen, mit deren Hilfe das viskoelastische Verhalten von Körpern beschrieben werden kann. (Abb. 1.15). Die obere Platte mit der Fläche A wird durch die parallele Kraft F bewegt und die Auslenkung x gemessen. Die untere Platte ist unbeweglich. Die zwischen den Platten mit Abstand h befindliche Substanz wird geschert. Zur Bestimmung der viskoelastischen Parameter wird Abbildung 1.15: Das Zwei-Platten-Modell zur Beschreibung von Scherversuchen. eine Haftung an beiden Platten (sowie eine laminare Schichtenströmung bei Flüssigkeiten) vorausgesetzt. Die angelegte Schubspannung τ (engl.: shear stress) entspricht der angelegten Scherkraft F pro Fläche A: τ [P a] = F (1.8) A Die tatsächliche Scherrate σ lässt sich aus der Geschwindigkeit pro Höhe errechnen: σ [s 1 ] = v h (1.9) Viskose Flüssigkeiten Ideale inkompressible Flüssigkeiten werden als Newtonsche Flüssigkeiten bezeichnet. Bei konstanter Temperatur lässt sich die Scherviskosität η über das Verhältnis von Schubspannung und Scherrate mit dem Gesetz von Newton bestimmen: η [P a s] = τ σ (1.10) Veranschaulicht wird eine idealviskose Flüssigkeit (nach Newton) mit Hilfe des Dämpfer- Modells (Abb Links). In diesem sind Kraft und Kolbengeschwindigkeit zueinander proportional. Der Proportionalitätsfaktor entspricht der Reibung des Dämpfers. Bei der Entlastung bleibt der Dämpferkolben in der erreichten Position stehen. In einer idealviskosen Lösung wird die zugeführte Deformationsenergie vollständig verbraucht Elastische Festkörper Auch das Verhalten von idealelastischen Festkörpern lässt sich mit dem Zwei-Platten- Modell beschreiben. Die Scher-Deformation γ (engl.: shear strain) hängt von der Auslenkung x und dem Plattenabstand h ab: γ [1] = x h (1.11)

15 KAPITEL 1. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 14 Das Verhältnis der angelegten Schubspannung τ und der Deformation γ entspricht bei konstanter Temperatur im linear-elastischen Bereich nach dem Hook schen Gesetz einer Materialkonstante, dem Schubmodul G (engl.: shear modulus): G [P a] = τ γ (1.12) Das Schubmodul lässt sich auch in das Dehn- oder Elastizitätsmodul E Y (engl.: Youngs modulus) umrechnen, das durch Zugversuche im linear-elastischen Teil ermittelt wird, oder auch durch AFM-Messungen [7] bestimmt werden kann. Bei der Umrechnung zwischen G und E Y Werten gilt: E Y [P a] = 2 G(1 + µ) (1.13) µ ist die Querkontraktionszahl (engl.: Poisson ratio), die je nach Substanz einen Wert zwischen -1 und 0,5 annimmt. Sie beschreibt das Verhältnis der Quer- zur Längsdehnung. Für einen inkompressiblen, isotropen Körper (Wasser) ist µ = 0, 5 daher gilt: E = 3G (1.14) Veranschaulicht wird ein idealelastischer Festkörper nach Hook anhand des Federmodells. Abbildung 1.16: Links: Das Dämpfer-Modell für viskose Flüssigkeiten Rechts: Das Feder- Modell für elastische Festkörper. In diesem sind die Kraft und die Auslenkung der Feder zueinander proportional (Abb Rechts). Der Proportionalitätsfaktor entspricht der Federkonstante. Bei der Entlastung stellt sich die Feder sofort wieder in ihren Ausgangszustand ein. In einem idealelastischen Festkörper wird die Energie gespeichert, so dass der Ausgangszustand nach einem Belastungs-/Entlastungs-Zyklus wieder vollständig eingenommen wird Viskoelastische Substanzen Die meisten realen Substanzen verhalten sich zum Teil elastisch und zum Teil viskos. Daher spricht man von viskoelastischen Substanzen. Ob sich ein Körper eher elastisch oder eher viskos verhält, hängt auch von der Geschwindigkeit der Krafteinwirkung ab. Wirkt z.b. eine lokale Kraft langsam auf eine Polymerlösung, können sich die Polymere entwirren und erhöhen durch die höhere Reibung die effektive Viskosität der Lösung. Wirkt die selbe Kraft jedoch sehr schnell auf die Lösung, verfangen sich die Polymere ineinander und führen zu einem höheren elastischen Anteil. Viskoelastische Flüssigkeiten nach Maxwell Das Verhalten einer viskoelastischen Flüssigkeit kann durch die Hintereinanderschaltung einer Feder und eines Dämpfers, dem sogenannten Maxwell-Modell, veranschaulicht werden (Abb. 1.17). Vor der Belastung sind beide Komponenten nicht deformiert. Im ersten

16 KAPITEL 1. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 15 Abbildung 1.17: Links: Das Maxwell-Modell für viskoelastische Flüssigkeiten. Rechts: Verformung viskoelastischer Körper nach Maxwell: wird eine Maxwell-Flüssigkeit belastet reagiert sie zunächst elastisch, danach ist die Verformung durch den viskosen Anteil bestimmt. Moment reagiert nur die Feder, danach auch der Dämpferkolben. Bei der Entlastung stellt sich die Feder wieder vollständig zurück, während der Dämpfer ausgelenkt bleibt. Viskoelastische Flüssigkeiten werden also teilweise deformiert. Viskoelastische Festkörper nach Kelvin und Voigt Das Verhalten der viskoelastischen Festkörper kann durch die Parallelschaltung einer Feder und eines Dämpfers, dem sog. Kelvin/Voigt-Modell, veranschaulicht werden (Abb. 1.18). Beide Einzelkomponenten sind dabei durch einen starren Rahmen verbunden. Vor der Be- Abbildung 1.18: Links: Das Kelvin/Voigt-Modell für viskoelastische Festkörper. Rechts: Verformung viskoelastischer Körper nach Kelvin/Voigt: wird eine Kelvin-Körper belastet und zum Zeitpunkt t 1 wieder entlastet, kehrt dieser wieder in die Ausgangsstellung zurück. lastung sind beide Komponenten undeformiert. Während der Belastung können sich die beiden Komponenten nur zur gleichen Zeit und im selben Maße deformieren, da sie über den starren Rahmen verbunden sind. Die Verformung findet so lange statt, wie die konstante Belastungskraft wirkt. Die Feder wird dabei durch den Dämpfer gebremst. Bei der Entlastung ist die Feder bestrebt sich sofort elastisch zurückzudeformieren. Dies geschieht durch den Dämpfer jedoch zeitlich verzögert. Am Ende ist keine dauerhafte Deformation entstanden.

17 Kapitel 2 Biologische Proben 2.1 Zellkultur Unter Zellkultur versteht man die Techniken, die die Erhaltung von tierischen sowie pflanzlichen Zellen in vitro erlaubt, wobei physiologische, biochemische und genetische Eigenschaften der Zellen möglichst unverändert bleiben sollen. Zellkulturen sind ein wichtiger Bestandteil medizinischer und biologischer Forschung. Sie dienen sowohl als Testsystem als auch zur Herstellung von Medikamenten und sind vor allem in der Grundlagenforschung von immenser Bedeutung. Abbildung 2.1: Schema einer typischen eukaryotischen Zelle. Man unterscheidet zwischen Zelllinien (immortalisierte Zellen einer Gewebeart, die sich unbegrenzt fortpflanzen können) und primären Zellen (nicht immortalisiert) die direkt aus Gewebe entnommen wurden. Um Kulturen von tierischen Zellen herzustellen werden oft Zellen aus Embryos oder Tumoren als Startmaterial benutzt. Diese haben den Vorteil, dass sie sich schnell vermehren. Außerdem sind im Fall von Tumoren oft die Zellen schon derart genetisch mutiert, dass sie keine eingeschränkte Lebensdauer besitzen. Das gewünschte zelluläre Gewebe wird mit einer Protease behandelt, welches Proteine abbaut, die den Zellverband zusammenhalten. Dadurch werden die Zellen vereinzelt. Durch Zugabe von Wachstumsfaktoren können gezielt bestimmte Zelltypen zur Teilung angeregt werden. Die gewünschten Zellen werden nun in einem Nährmedium kultiviert. Man unterscheidet zwischen adhärenten Zellen, also Zellen die eine Bindung zu ihrer Umgebung herstellen und nicht-adhärenten Zellen, welche in Suspension gehalten werden können. 16

18 KAPITEL 2. BIOLOGISCHE PROBEN 17 Zelltypen, wie Fibroblasten und Epithelzellen sind adhärente Zellen und wachsen auf den beschichteten Plastikoberflächen der Schälchen, die für Zellkulturen verwendet werden. Embryonische Fibroblasten können besonders gut in Kultur gehalten werden und sind deswegen einer der am meisten erforschten Zelltypen. 2.2 Fibroblasten Fibroblasten sind Zellen des Bindegewebes. Sie werden durch ein dichtes Netzwerk aus verschiedenen Proteinen zusammengehalten, der sogenannte extrazellulären Matrix (EZM). Fibroblasten produzieren solche extrazellulären Matrix Proteine, hauptsächlich Kollagen und organisieren diese. Innerhalb dieses Protein-Netzwerks können sie sich fortbewegen, indem sie ihr Zytoskelett neu organisieren und alte Verbindungen zur EZM lösen sowie neue ausbilden. Für den Vorgang der Zellmigration gibt es bis heute keine einheitliche und allgemein gültige Beschreibung. Man weiß, dass die Zelle einzelne dünne Membranfinger sogenannte Filopodien ausstreckt. Diese untersuchen die Umgebung nach geeigneten Adhäsionsbereichen und knüpfen dann neue Kontakte zur Umgebung. Nachdem die Zelle Abbildung 2.2: Lichtmikroskopische Aufnahme einer REF (rat embryonic fibroblast) auf einer Petrischale (Maßstabsleiste: 50µm). genügend neue Ankerpunkte gebildet hat, ist es ihr möglich, die Zellmembran in diese Richtung zu erweitern. Um die Membran auszustülpen werden breite, flache Zellfortsätze, sogenannte Lamellopodien gebildet, die sich an den Untergrund heften. Dies geschieht durch eine Umstrukturierung ihres Aktinnetzwerkes. Ausgehend von diesen Adhäsionsplaques bildet die Zelle nun Stressfasern aus, welche höchstwährscheinlich dazu dienen ihren Zellkörper nach zu ziehen.

19 KAPITEL 2. BIOLOGISCHE PROBEN Fixierung (Anm.: In diesem Versuch werden lediglich lebende Zellen vermessen) Ziel einer Fixierung von Zellen ist, diese abzutöten, um sie dauerhafte zu konservieren, dabei aber strukturelle und biochemische Eigenschaften der Zelle zu erhalten. Dazu werden die Zellen mit einem Fixiermittel behandelt, welches sie abtötet und präserviert, indem ihre Makromoleküle quervernetzt und somit stabilisiert werden. Heutzutage verwendet man dafür reaktive Aldehyde, besonders Paraformaldehyd (PFA) und Glutaraldehyd, welche die freien Aminogruppen von Proteinen kovalent binden und somit anliegende Proteine quervernetzen. Um ganzes Gewebe zu fixieren, muß dieses anschließend in ein stützendes Medium eingebettet werden. Häufig werden dazu Wachse oder Harze verwendet. 2.3 Elastizität in der Biologie Das Elastizitätsmodul (Youngs modulus) von lebenden Zellen liegt zwischen 0.5 und 200 kpa abhängig von dem Zelltyp und dem Zellbereich (Kern, Membran etc.), was deutlich weicher ist als andere biologische Materialen (z.b. Polymere 1 GPa oder Seide 10 GPa) oder Werkstoffe wie Stahl ( 200 GPa). Versuche haben gezeigt, dass Spannung und Elastizität der Zelle größtenteils auf das Aktinfilament-Netzwerk zurückzuführen sind [5]. Die Forscher schädigten das Aktin-Netzwerk mit speziellen Chemikalien wie Cytochalasin und fanden drastische Änderungen der Zellmorphologie sowie eine Verringerung der Zellelastizität um den Faktor 3. Andere Forscher zeigten anhand von Steifigkeitsmessungen an Krebszellen, dass diese weicher sind als gutartige Zellen [4]. Diese Tatsache könnte einmal in der Krebsdiagnostik eine Rolle spielen. Abbildung 2.3: Wertebereich für den Elastizitätsmodul biologischer Zellen und Vergleich mit denen von Metallen, Keramik und Polymeren. Die Elastizität der Umgebung der Zelle, also der EZM ist ebenfalls Gegenstand verschiedener Forschungsarbeiten, da sie ausschlaggebend das Verhalten einer Zelle beeinflussen kann. Zum Beispiel spielt sie eine Rolle bei der Ausdifferenzierung von mesenchymalen

20 KAPITEL 2. BIOLOGISCHE PROBEN 19 Stammzellen oder kann die Spezifizierung von Stammzellen zu Neuronen, Myoblasten und Osteoblasten bewirken [1].

21 Kapitel 3 Versuchsdurchführung und Auswertung 3.1 Vorbereitung biologischer Proben Ein Tag vor den Messungen werden Fibroblasten (Rat Embryonic Fibroblasts (REF)) vom Assistenten auf Glasoberflächen ausgesäht und in Nährmedium (10% FBS enthaltendes DMEM) bei 37 C inkubiert. Am Tag der Messung wird das Medium wieder abgesaugt und die Oberfläche mit den Zellen dreimal mit lauwarmen PBS (Phosphate Buffered Saline) gewaschen um Schmutz und tote Zellen, die nicht adherent sind, zu entfernen. Um die lebende Zellen dann zu vermessen wird die Oberfläche schließlich wieder mit Medium bedeckt. Das AFM besitzt eine Inkubatorbox, so dass auch während der Versuchsdurchführung die Temperatur auf 37 C eingestellt werden kann. 3.2 Messung des E-Moduls an lebenden Fibroblasten Ziel des Versuchs ist es Elastizitätsmessungen an lebenden Fibroblasten durchzuführen. Vereinfacht wird angenommen, dass es sich bei beiden Proben um elastische Körper handelt. Die Kraft-Eindringtiefe-Diagramme werden mittels AFM-Kraftspektroskopie gewonnen. Es sollen so die E-Module im Bereich des Kerns, dem Zytoplasma und der Lamellipodia ermittelt werden. In jedem Bereich sollten mehrere Messungen gemacht werden um eine akzeptable Statistik zu bekommen (ca. jeweils 10 an Lamellipodia + Zytoplasma und 5 am Kern). Wegen der hohen Sensibilität der Messapparatur sollte der Raum während des Versuchs möglichst ruhig bleiben (keine Gespräche, Umherlaufen etc.). Da die Vier-Quadranten-Diode die Auslenkung des Cantilevers aus der Ruhelage in Volt liefert müssen diese in Newton transformiert werden. Hierfür wird vor jedem Versuch der Cantilever kalibriert, indem zunächst seine sog. Sensitivität (engl.: Sensitivity) bestimmt wird, welche von der Position des Lasers auf dem Cantilever abhängt. Für die Bestimmung wird eine Kraft-Abstandskurve 1 auf einem sehr harten Untergrund (z.b. Glas) aufgenommen. Sobald der Cantilever auf die Oberfläche trifft, wird der Laserstrahl ausgelenkt. Bei weiterer Kraftausübung (Piezo dehnt sich weiter in z-richtung aus) sollte der Cantilever, gemäß dem Hooke schen Gesetz linear und im gleichen Maße wie sich das Piezo nach unten 1 Dies ist zunächst eigentlich keine Kraft-Abstandskurve sondern eine Volt (Signal der Diode)- Abstandskurve (Ausdehnung des Piezos) 20

22 KAPITEL 3. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND AUSWERTUNG 21 ausdehnt, nach oben ausgelenkt werden. Das bedeutet im Volt-Abstandsdiagramm sollte eine Gerade mit bestimmter Steigung 2 aufgezeichnet werden. Mithilfe dieser Steigung kann man nun ein Beziehung zwischen Laserauslenkung und wahrer Auslenkung des Cantilevers herstellen. Das Ergebnis der Sensitivitätsmessung ist, dass das Signal der Diode nun nicht mehr in Volt sondern in Nanometer (Auslenkung des Cantilevers aus der Ruhelage) angegeben wird. Um diesen Wert schließlich in Kraft zu transformieren, braucht man die Federkonstante des Cantilevers, die ja bekanntlich eine Relation von Auslenkung zu Kraft herstellt. Um die Federkonstante des Cantilevers zu bestimmen wird die Thermal Noise Method benutzt, welche thermische Fluktuationen des Cantilevers nutzt, um aus diesen mit Hilfe des Äquipartitionstheorems die Federkonstante zu bestimmen 3. Das Ergebnis der Kalibration ist eine Beziehung zwischen dem Signal des Detektors in Volt (Auslenkung des Laserstrahls) und der Kraft in Newton die auf den Cantilever bzw. auf die Oberfläche wirkt. An alle Kraft-Eindringtiefe-Diagramme wird die Beziehung (1.6) gefittet und mit der Gleichung (1.4) kann anschließend das gesuchte E-Modul der Probe ermittelt werden. Es sind statistische Mittelwerte aller zehn an einer Stelle gemessenen E-Module zu bilden, damit diese miteinander verglichen werden können. Dabei soll untersucht und begründet werden, ob und warum sich das E-Modul innerhalb einer Zelle ändert. Anm.: Am Versuchstag erhält jeder Student noch eine knappe Anleitung zur Auswertung. Anmerkungen/Verbesserungsvorschläge zum Skript bitte an: deeg@is.mpg.de 2 Auslenkung des Lasers nimmt linear mit Kraft zu, da der Laser an die Auslenkung des Cantilevers gekoppelt ist. Die Kraft, die auf den Cantilever/Oberfläche wirkt, nimmt hier wegen der weiteren Piezoausdehnung zu. 3 für weiterführende Informationen empfiehlt es sich, die verschiedenen PDFs die zum Download auf der Seite von JPK angeboten werden, anzusehen. Im Speziellen: NanoWizard - A practical guide to AFM force spectroscopy and data analysis, und NanoWizard - Determining the elastic modulus of biological samples using the atomic force microscope

23 Literaturverzeichnis [1] A. Engler, S. Sen, H. Sweeney, and D. Discher. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell, (126): , [2] H. Hertz. pages , [3] JPK. The NanoWizard AFM Handbook. JPK Instruments, , 1.2, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.10, 1.11, 1.12, 1.13 [4] M. Lekkaa, J. Lekkia, M. Marszaeka, P. Golonkaa, Z. Stachuraa, Cleffb B., and A. Z. Hrynkiewicza. Local elastic properties of cells studied by sfm. Applied Surface Science, (141): , [5] C. Rotsch and M. Radmacher. Drug-induced changes of cytosceletal structures and mechanics in fibroblasts - an atomic force microscopy study. Biophys. J, (78): , [6] N. Sneddon. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem. Int. J. Eng. Sci., 3(47), [7] A. Vinckier and G. Semenza. Measuring elasticity of biological materials by atomic force microscopy. FEBS Letters, pages 12 16, ,