Charakterisierung von Transkripten mittels RT-PCR

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1 Charakterisierung von Transkripten mittels RT-PCR Versuchsleiter: Ulrike Gerischer Protokollführung: Karl Varadi Gruppe: 11 Durchführung: Protokoll testiert: WS02 Universität Ulm

2 Inhaltsverzeichnis I. Theoretischer Hintergrund... 2 II. Material und Methoden... 4 III. Ergebnisse 3.1 Ergebnisse der RNA-Aufreinigung Ergebnisse der RP-PCR... 6 IV. Diskussion 3.1 Ergebnisse der RNA-Aufreinigung Ergebnisse der RP-PCR

3 I. Theoretischer Hintergrund Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hat sich als Methode zur schnellen und unkomplizierten Amplifikation von DNA-Sequenzen etabliert. Voraussetzung für das Gelingen dieser in vitro- Methode ist die Kenntnis der flankierenden Sequenzen des zu amplifizierenden Fragments. Dadurch kann man einzelsträngige Oligonukleotide (primer) konstruieren, deren Sequenzen zu den Flanken komplementär sind und so eine Anlagerung an ihnen erlauben. Eine thermostabile DNA- Polymerase (Taq, Tth) erweitert dann die Primer unter Anwesenheit von dntps mit einem der DNA-Stränge als Matrize zu einem neuen doppelsträngigen Produkt. Seit ihrer Erfindung seitens Kary B. Mullis anno 1983 wurden viele verschiedene PCR-Techniken entwickelt, von denen hier eine besonders wichtige hervorgehoben werden soll: die RT-PCR. Die gewöhnliche PCR eignet sich nur zur Vermehrung von Desoxyribonukleinsäuren. Bei der Erforschung zellulärer Prozesse kann es jedoch außerordentlich wichtig sein, nicht nur die DNA sondern auch ihr Transkript, die mrna, zu untersuchen. Die Reverse-Transkriptase-PCR (RT- PCR) ermöglicht Experimente dieser Art. Bei dieser Methode wird der gewöhnlichen PCR ein Reaktionsansatz vorgeschaltet, der mit Hilfe von viralen Polymerasen, den sog. reversen Transkriptasen (RTasen), die mrna wieder in DNA umwandelt. Diese cdna (copy-dna) kann dann mit der üblichen PCR-Technik vervielfältigt werden. Die bekanntesten RTasen sind beispielsweise die MMLV-RTase aus dem Moloney-Maus-Leukämie-Virus, die AMV-RTase aus dem Avian-Myoblastosis-Virus oder die Tth-Polymerase aus dem Bakterium Thermus thermophilus. Temperente Viren benötigen diese RNA-abhängigen DNA-Polymerasen zu ihrer Vermehrung, da ihr Erbgut meist als RNA vorliegt und es in dieser Form nicht in das Genom des Wirtes integriert werden kann. Im ersten Reaktionsansatz einer RT-PCR synthetisiert die RTase analog zu DNA-Polymerasen unter Anwesenheit von dntps, einem Primer (z.b. Oligo-dT-Primer als komplementärer Partner für die Poly-A-Endungen eukaryotischer mrna) und einem mrna-molekül als Matrize ein cdna-molekül. Dieses unterscheidet sich von normaler DNA nur dadurch, dass es als Einzelstrang mit der Matrizen-mRNA gepaart vorliegt. Die cdna wird dann als Template für die nachfolgende PCR verwendet. Hier wird die genante Struktur zuerst bei 95 C denaturiert um erneut Einzelstränge zu bilden. Ein zweiter zugegebener Primer kann nach Absenken der Temperatur auf einen für ihn spezifischen Wert an die cdna hybridisieren (annealing). Bei der Elongation der Primer ergänzt eine thermostabile Polymerase (Taq, Tth, wobei letztere auch für die RT-Reaktion verwendet werden kann) nach Erhöhung der Temperatur auf ca. 72 C den fehlenden DNA- Einzelstrang anhand der Vorgabe der cdna. Werden diese meist eine Minute andauernden Schritte (Denaturierung, Annealing, Elongation) nun in Kombination mit beiden Primern oft wiederholt, erhält man schon nach kürzester Zeit eine hohe Anzahl an in DNA konvertierten Kopien der cdna und somit der mrna. Die Vermehrung der DNA erfolgt also exponentiell und lässt sich mit der Formel N = N 0 2 n, wobei N die Anzahl der amplifizierten Moleküle, N 0 die Anzahl der Templates vor der Amplifizierung und n die Anzahl der Zyklen bedeuten. Diese Effektivität lässt sich in der Praxis aufgrund kleinster Änderungen in der Reaktion (z.b. leichte gegenseitige Inhibition) jedoch nicht erreichen. Die tatsächliche Ausbeute einer PCR lässt sich eher mit der Formel N = N 0 (1 + E) n beschreiben, wobei E die Effizienz der Reaktion ist und experimentell zwischen 0,8 und 0,9 liegt. Die RT-PCR lässt sich beispielsweise bei der quantitativen Bestimmung von RNA einsetzen. Ihre Sensitivität liegt einige Zehnerpotenzen höher als die des bei RNA-Untersuchungen traditionell verwendeten northern-blots. Qualitative Anwendungen können aufzeigen, ob in bestimmten DNA- Bereichen durchgehende Transkripte gebildet werden oder nicht. Das soll im Folgenden anhand des im Praktikum durchgeführten Versuches demonstriert werden. 2

4 Der gramnegative Bakterienstamm Acinetobacter sp. ADP1 verfügt über eine Genregion in seinem Chromosom, welche für Enzyme codiert, die am Ligninkatabolismus beteiligt sind. Nach Umwandlung des Lignins zu Chinasäure wird letztere über den ß-keto-Adipatweg zur aromatischen Verbindung Protocatechuat (PCA) metabolisiert. Der ß-keto-Adipatweg wird von einer Enzymgruppe ausgeführt, deren codierende Gene als qui-gene bezeichnet werden. Ihnen benachbart in der Genregion befindet sich die pca-genregion, deren Produkte Protocatechuat zu Metaboliten des Zitronensäurezyklus katalysieren. Dieser Abbauweg wird nur dann von den Bakterien gewählt, wenn sich PCA im Milieu befindet, d.h. dass PCA als Induktor für die Transkription der qui- und pca-gencluster tätig ist. Abbildung 1 zeigt den Übergang des letzten Gens aus dem pca-gencluster (pcag) zum ersten Gen des qui-genclusters (quib). Abb. 1: Detaillierte Ansicht des Übergangs der Gencluster pca und qui Interessanterweise kann para-hydroxybenzoat (POB), eine Verbindung, welche PCA chemisch sehr ähnlich ist (Hydroxylgruppe in der meta-stellung fehlt), ebenfalls beide Abbauwege induzieren. Diese Verbindung wird mittels POB-Hydroxylase, ein Enzym, dessen codierender Gencluster (pob) in unmittelbarer Nachbarschaft zum pca-gencluster situiert ist, in PCA umgewandelt. Daher ist die Verbindung POB als Induktionsmittel für die Transkription geeignet. Die Transkriptstruktur der beiden Cluster ist momentan unbekannt. Es wird vermutet, dass es sich um zwei unabhängig voneinander transkribierte Operons handelt, da die Existenz einer potentiellen Terminationsstruktur für die RNA-Polymerase (Haarnadelstruktur der DNA hinter pcag) nachgewiesen wurde. Ebenfalls denkbar ist auch, dass die Transkription des pca-genclusters die von qui mit erfasst. Für diese Tatsache sprechen Experimente mit mutierten Acinetobacter- Stämmen. Im ersteren der beiden Fälle würde eine RT-PCR mit einer anschließenden Agarose- Gelelektrophorese bei Anwendung der Primerpaare ON2/ON3 und ON4/ON5 nur das 740 Bp große Fragment ergeben (Abb. 1). Im anderen Fall wäre zusätzlich das 508 Bp-Fragment sichtbar. Das folgende Experiment soll verdeutlichen ob einer dieser beiden Fälle zutrifft oder ob eventuell auch andere Möglichkeiten in Betracht gezogen werden können. 3

5 II. Material und Methoden Da die für den Versuch benötigten Reagenzien und deren Zusammensetzung im Skript veranschaulicht sind, soll in diesem Abschnitt auf die zusätzliche Darstellung verzichtet werden. Es werden lediglich Materialien und Methoden erwähnt, die im Skript nicht notiert sind. Als mrna-quelle wurden die Stämme ADP1 (wt) und ADPU18 von Acinetobacter in Form von Ausstrichen auf Petrischalen (Mineralmedium mit Succinat als C-Quelle) zur Verfügung gestellt. Der Stamm ADPU18 enthält keine pca-qui-pob-genregion und dient somit als Negativkontrolle. Für die Vorkulturen wurden je Stamm 5 ml autoklaviertes Succinat-Flüssigmedium mit einer Kolonie angeimpft. Die Vorkultur des Stammes ADPU18 musste mit mehreren Kolonien angeimpft werden, da sich in der Petrischale ein Bakterienrasen gebildet hatte und es nicht möglich war eine einzelne zu übertragen. Die Vorkulturen wurden über Nacht (ÜN) unter Schütteln bei 30 C inkubiert. Da die Transkription der qui/pca-gencluster nur während der Wachstumsphase der Bakterien stattfindet, wurde nach der ÜN-Inkubation jeder Kultur 5 ml autoklaviertes Succinatmedium hinzugefügt ( Hauptkultur). Die Induktion der Transkription erfolgte nach Zusetzten von je 40 µl POB (0,5 M) mit einer anschließenden Inkubation (2 h, 30 C). Bei der Ernte der Kulturen wurde der Stamm ADPU18 von Gruppe 11 (wir) und der Stamm ADP1 von Gruppe 12 isoliert. Für die Weiterverarbeitung wurden 4,5 ml Kultur pelettiert, weitere pelettierte 3,5 ml wurden als Backup eingefroren. In erster Linie wurden die Nukleinsäuren durch Zelllyse (2 µl Lysozym 400 µg/ml, Inkubation 4 Min. bei RT) und Aufreinigung mit RNeasy Total RNA Kit (Quiagen) isoliert. Die einzelnen Arbeitsschritte sind dem Skript zu entnehmen. Das Endvolumen des Eluats betrug anstatt 100µl nur ca. 70 µl, da beim Zentrifugationsschritt Probleme auftraten. Für die Kontrolle mittels Agarose- Gelelektrophorese wurden 5 µl aus dem Eluat entnommen, mit 5 µl sterilem Probenauftragspuffer vermischt und eingefroren (Probe A). Da für eine RT-PCR nur RNA von Bedeutung ist und kontaminierende DNA bei der PCR mit amplifiziert wird und das Ergebnis verfälscht, wurde diese in einem DNase-Verdauungsansatz entfernt. Dazu wurden 10 µl DNase-Puffer (10 ) und 3 µl RNase-freie DNase hinzugefügt und das Eluat mit H 2 O auf ca. 100 µl Gesamtvolumen komplettiert. Für die erneute Aufreinigung wurde wieder das Quiagen-Kit verwendet. Die mrna wurde dieses mal nur mit 30 µl sterilem Wasser eluiert, da aber die gleichen Probleme wie bei der ersten Aufreinigung auftraten, betrug das Endvolumen nur etwa die Hälfte. Auch hier wurden 5 µl aus dem Eluat entnommen und mit 5 µl Probenauftragspuffer versetzt (Probe B), der Rest wurde eingefroren. Wegen den aufgetretenen Problemen bei der Eluation konnte auch keine Konzentrationsbestimmung der mrna erfolgen, da nicht ausreichend Material vorhanden war. Zur Aufreinigungskontrolle wurden die Proben A und B auf einem Agarosegel (0,8%) aufgetragen und getrennt. Des Weiteren wurde die RT-PCR vorbereitet und durchgeführt. Für die Hybridisierung des Primers ON1 (1 µl, Annealing-Temperatur: 47 C) an der mrna des Stammes ADPU18 verwendete man 11 µl mrna-lösung einer anderen Gruppe, da die eigene in nicht ausreichenden Mengen vorhanden war. Die Arbeitsschritte für die Synthese der cdna sind dem Skript zu entnehmen. Als RTase wurde das Enzym Superskript II (Fa. GIBCO/BRL) verwendet. Im letzten Schritt wurde die hergestellte cdna mittels PCR in gewöhnlicher DNA konvertiert, wobei 8 Ansätze vorzubereiten waren. In Tabelle 1 ist nur die Verteilung der Nukleinsäuren und der verwendeten Primer dargestellt, die restlichen typischen PCR-Komponenten wurden in einem Mastermix zusammengestellt, welches in Tabelle 2 aufgeführt ist. 4

6 Ansatz NS Ursprung der NS cdna ADP 1 Gruppe 12 cdna ADP 1 cdna ADPU 18 cdna ADPU 18 Gruppe 9 (sollte Gruppe 11 sein) ON 2 ON 4 ON 3 ON 5 mrna mrna ADPU 18 ADPU 18 Gruppe 11 Eigenes Präparat ON 2 ON 4 ON 2 Primer ON 3 ON 5 ON 3 Tab. 1: Pipettierschema der Nukleinsäuren (NS) und der Primerpaare für die PCR ON 4 ON 5 pzr1 pzr1 Sektion Mikrobiologie ON 2 ON 3 ON 4 ON 5 Die Primerpaare ON2/ON3 hybridisieren an einem Sequenzabschnitt im quib-gen und synthetisieren ein PCR-Fragment von 740 Bp (s. Abb. 1). Der erste Primer des Primerpaars ON4/ON5 hybridisiert am pcag-gen, der andere am quib-gen, so dass das 508 Bp große PCR- Produkt nur dann entstehen kann, wenn die Transkription der beiden Genbereichen überlappt und die entsprechende mrna in cdna umgeschrieben wird. Die cdna der ersten beiden Ansätze entstammt dem Wildtyp von Acinetobacter (ADP1) und wurde von einer anderen Gruppe (12) hergestellt. Die Ansätze 3 und 4 enthalten die cdna des Stammes ADPU18, allerdings handelt es sich um Proben der Gruppe 9 (s. vorletzter Abschnitt S. 4). Die eigene mit DNase behandelte mrna des Stammes ADPU18 befindet sich in den Ansätzen 5 und 6 und soll lediglich als Kontrolle für die DNase-Behandlung dienen. In den letzten beiden Ansätzen wurde der Plasmid prz1 als DNA-Quelle verwendet, der die zu untersuchende Genregion in Form eines 11 kbp großen EcoRI-Fragmentes enthält. Mastermix dntp [je 5M] 17 µl Puffer 10 42,5 µl MgCl 2 12,75 µl H 2 O 263,5 µl Tab. 2: Mastermixkomponenten für die PCR Es wurden 5 µl cdna bzw. 2 µl mrna zusammen mit je 2,5 µl der jeweiligen Primer vorgelegt und je Ansatz 40 µl Mastermix hinzugefügt. Die Taq-Polymerase wurde mit 1 µl zuletzt hinzugefügt. Die spezifischen Annealing-Temperaturen der beiden Primerpaare ON2/ON3 und ON4/ON5 liegen nach Berechnung mit der im Skript stehenden Formel bei 47 C. Das Produkt der PCR wurde in einer 0,8%-igen Agarose-Gelelektrophorese untersucht. 5

7 III. Ergebnisse 3.1 Ergebnisse der Nukleinsäurenaufrenigung Der Trübung des Succinat-Mediums in dem die Vorkultur von Acinetobacter ÜN angezogen wurde nach zu urteilen, sind die Zellen recht gut gewachsen. Das zeigt sich auch nach der ersten Aufreinigung in der Bandenintensität von B1. B1 B2 chr. DNA B3 B4 Gruppe 11 (ADPU18) vor DNase-Verdau B1 nach DNase-Verdau B2 Gruppe 12 (ADP1) vor DNase-Verdau B3 nach DNase-Verdau B4 23 S 16 S 5 S Bild 1 zeigt das Ergebnis der gelelektophoretischen Auftrennung der beiden mrna-aufrenigungsschritte. Die Banden B1 bzw. B3 stellen die Aufreinigungen des Kontrollstammes ADPU18 bzw. ADP1 vor der Behandlung mit DNase. Die Proben der beiden Stämme nach der Behandlung sind in den Banden B2 und B4 sichtbar. Bild Ergebnisse der RT-PCR S ,74 kb Bild 2: Ergebnisse der RT-PCR 0,5 kb 6

8 In Bild 2 kann man die Ergebnisse der RT-PCR betrachten. Der Inhalt der Spuren 1 8 ist dem Pipetierschema in Tab. 1 (Material und Methoden) verzeichnet. Die einzige sichtbare Bande liegt in der Spur 8 auf der Höhe der 0,6 kb Standardbande. In den ersten vier Spuren wurde die DNA (aus cdna) beider Stämme von Acinetobacter aufgetragen, der Stamm ADP1 zuerst. Die Spuren 5 und 6 enthalten die aufgereinigte und mit DNase behandelte mrna des Stammes ADPU18 und in den letzten beiden Spuren wurde für die PCR Plasmid-DNA (prz1) eingesetzt, welche die zu untersuchende Genregion enthält. IV. Diskussion 4.1 Ergebnisse der Nukleinsäurenaufreinigung Wie man im Gelbild der Aufreinigungskontrolle (Bild 1) erkennen kann, ist sowohl die Anzucht beider Stämme von Acinetobacter, als auch die Aufreinigung der Nukleinsäuren, vor allem die der sensiblen RNA erfolgreich verlaufen. Anders lassen sich die relativ gut sichtbaren Banden in den Spuren B1 und B3 nicht erklären. Die oberste Bande auf dem Gelbild stellt die chromosomale DNA oder zumindest ein Teil davon dar. Die unteren Banden enthalten, wie rechts neben dem Bild verzeichnet, die ribosomale RNA (23 S, 15 S und 5 S). Die zu untersuchende mrna selbst (Stamm ADP1) ist auf dem Bild nicht sichtbar, da sie nur ca. 5 % der gesamten RNA-Masse der Bakterienzellen ausmacht und zudem in unterschiedlichen Größen vorkommt. Der Verdau der Proben mit DNase ist in beiden Fällen positiv verlaufen, denn in den Banden B2 und B4 verschwindet die Bande mit chromosomaler DNA. Man beobachtet zusätzlich das Abnehmen der Bandenintensität ribosomaler RNA (speziell bei 5 S, ansonsten vor allem beim Stamm ADP1), jedoch ist die Kontamination der DNase mit RNase so gut wie auszuschließen. Das Material ist vermutlich bei der zweiten Aufreinigung nach dem Verdau verloren gegangen. Des Weiteren lässt sich auf dem Gelbild ober- und unterhalb der ribosomalen RNA Schmier in den Spuren feststellen. Der Schmier oberhalb der 23 S rrna vor dem Verdau (B1 und B3) ist mit der Degradation der DNA zu erklären, die vermutlich wegen der unsachgemäßen Behandlung während der ersten Aufreinigung auftritt. Der Schmier nach dem Verdau (B4 und vor allem B2) könnte zusätzlich dadurch entstanden sein, dass die DNase nicht voll funktionsfähig gewesen ist und so die DNA in zu großen Fragmenten zerschnitten hat. Unterhalb der rrna (vor allem unterhalb der 23 S rrna) stammt der Schmier eher von der eigenen Degradation. Das deutet darauf hin, dass sowohl beim Stamm ADP1 als auch bei der Mutante die Aufreinigungsprozesse nicht sauber genug, im Sinne von beschädigenden, mechanischen Einflüssen, durchgeführt wurden. 4.2 Ergebnisse der RT-PCR Die Ergebnisse der RT-PCR sind leider nicht gut gelungen. In der 7. und 8. Spur (Bild 2) wurde als DNA-Quelle der Plasmid pzr1 verwendet, der an einer Stelle die zu untersuchende pca-qui-pob- Genregion besitzt. Diese wurde mit den Primerpaaren ON2/ON3 (Spur 7) und ON4/ON5 (Spur 8) amplifiziert und soll allgemein als Kontrolle zeigen, ob die PCR funktioniert hat. Die Primerpaare ON4/ON5 synthetisieren eine 508 bp große Sequenz, welche die pcag- und die quib-gene umspannt (s. Abb.1). An dieser Stelle ist auf dem Gelbild eine sehr intensive Bande erkennbar. Das zeigt also, dass die PCR-Komponenten in Ordnung waren und die PCR eigentlich funktioniert hat ist. In Spur 7 hätte man eine Bande im Bereich des 0,74 kb Markers erwartet, da die Primerpaare ON2/ON3 eine Sequenz von genau dieser Länge synthetisieren. In diesem Falle fehlt die Bande im Gel, jedoch ist sie bei anderen Gruppen vorhanden, was darauf schließen lässt, dass die Primer 7

9 funktionsfähig waren. Vermutlich handelt es sich um Pipetierfehler beim Zusammenstellen des Mastermixes. Die Spuren 5 und 6 enthalten neben dem Inhalt des Mastermixes und den Primerpaaren ON2/ON3 bzw. ON4/ON5 auch die aufgereinigte mrna des Stammes ADPU18. In einer gewissen Hinsicht handelt es sich hier um eine doppelte Negativkontrolle, denn in erster Linie kann der mutierte Stamm gar keine mrna der pca-qui-pob-genregion enthalten (also wurde auch der richtige Stamm verwendet) und des weiteren würde ein Inhalt in diesen beiden Spuren zeigen, dass die DNase- Behandlung nicht funktioniert hat oder eine Kontamination beim Arbeiten stattgefunden hätte. Da diese beiden Spuren jedoch keine Banden aufweisen, verläuft die Kontrolle zwar wie erwartet, jedoch kann man nicht mit absoluter Sicherheit DNA-Kontaminationen ausschließen (s. weiter unten). Die Spuren 3 und 4 enthielten die vermeintliche aus der mrna hergestellte cdna des Stammes ADPU18 als Matrize für die PCR. Da aber, wie schon erwähnt, dieser Stamm die zu untersuchende Genregion nicht enthält, kann man in diesen Spuren keine Banden erwarten. Wären Banden sichtbar, hätte es sich nur um Kontaminationen oder um DNA-Bruchstücke handeln können die der Aufreinigungskit von Quiagen nicht entfernen konnte. Schließlich wurde die eigentliche Genregion auf ihre Transkriptionsmuster untersucht. Hier wurde in der Spur 1 die cdna des Stammes ADP1 mit den Primerpaaren ON2/ON3 und in der Spur 2 mit den Primern ON4/ON5 amplifiziert. Bei einer voll funktionierenden PCR erhält man in Spur 1 auf jeden Fall ein Amplifikationsprodukt mit einer Länge von 740 bp (s. Abb. 1). In Spur zwei ist ein Produkt auf der Höhe des 508 bp Markers nur dann sichtbar, wenn die Transkription der pcagquib-gene überlappend ist. Falls das nicht der Fall sein sollte findet bei der RT auch keine Umsetzung der entsprechenden mrna in cdna statt und somit entsteht bei der PCR auch kein Produkt. Im Bild 2 sind an diesen Stellen überhaupt keine Banden sichtbar. Die Gelbilder anderer Gruppen enthalten jedoch die erwähnten Banden in Spur 1 und 2. Das bedeutet, dass eine übergreifende Transkription stattfindet und die Genregionen pca und qui nicht von zwei voneinander getrennte Operons gesteuert werden. Mit diesem Versuchsansatz lässt sich jedoch die Funktion der existenten Terminationsstruktur erklären. In Wirklichkeit ist die hier nachgewiesene übergreifende Transkription nicht empirisch, sonder stellt nur einen Teil der möglichen Transkriptionsmuster in dieser Genregion dar. Der andere Teil besteht aus zwei getrennt transkribierten pca- und qui-genregionen, die so nur mit einem northern-blot qualitativ nachweisbar sind. Durch diese Erklärungsansätze machen sowohl die Existenz der Terminationsstruktur also auch Experimente mit Mutanten (nur übergreifende Transkripte) Sinn. Nicht geklärt ist, wieso die PCR in Spur 8 funktioniert hat, die restlichen Versuchsansätze (nur die Spuren 1, 2 und 7) jedoch keine brauchbaren Ergebnisse geliefert haben. Die Ingredienzien für die PCR sollen funktionstüchtig gewesen sein, die PCR selbst hat, wie bereits erwähnt, funktioniert. Die naheliegendste Lösung sind aufgekommene Pipetierfehler, jedoch war sich der Experimentator sicher, alle Ansätze gleich behandelt zu haben. Es ist recht unwahrscheinlich 7 Ansätze falsch zu pipettieren und ein einziges richtig. Die Kontrollen in den Spuren 3-6 wären nur dann relativ sicher, wenn auch in den ersten beiden Spuren Ergebnisse auftreten würden, da man in diesem Fall eher von einer in jedem Ansatz funktionierenden PCR ausgehen könnte. Dies ist aber nicht der Fall. 8

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