Entwicklung und Validierung der VIROTYPE BVDV real-time RT-PCR

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1 Entwicklung und Validierung der real-time RT-PCR Gaunitz C, Engemann C, Labitzke M, Schroeder C, Kühn TE, Gabert, J Labor Diagnostik GmbH Leipzig

2 Gliederung Testprinzip Testprotokoll Testcharakteristik Validierung Vollblut, Plasma, Serum Ohrstanzgewebe Probenaufarbeitung Zusammenfassung

3 BVD Diagnostik Erreger-Nachweis Zellkultur ( Goldstandard ) Durchflusszytometrie (NS 2/3) Antigen capture ELISA (NS 2/3, E RNS ) Real-time RT-PCR

4 BVD Diagnostik Detektion von PI-Tieren in der kolostralen Phase neutralisierende Aktivität kolostraler Antikörper maskiert die Detektion von Virus-Antigen im Blut falsch negative Ergebnisse mit ELISA-Testverfahren* sicherer Nachweis auch in der diagnostischen Lücke nur durch die real-time RT-PCR *AVID BVD Symposium 2007, G. Wolf, LMU München

5 Testprinzip real-time Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) single-tube, one-step damit keine Gefahr von Kreuzkontaminationen alle Reagenzien zum Nachweis von -RNA mit Positiv- und Negativkontrolle enthalten Amplifikationskontrolle integriert im PCR-Mix Primer-Sonden-Kombination* spezifisch für Pestiviren Amplifikationskit für RNA-Material aus allen zuverlässigen RNA- Präparationen *Hoffmann et al., 2006

6 Testprinzip real-time PCR Annealing Reporter TagMan Sonde Quencher Polymerisation TagMan Chemie Verdrängung der Sonde + Abspaltung Reporter des Reporters FAM Interne Kontrolle HEX Fluoreszenz Proportionalität! 1 Reporter-Signal pro DNA-Kopie PCR-Produkte

7 Testprotokoll PCR-Mix Enzym-Mix 19,75 µl 0,25 µl PCR-Mix enthält: Primer / Sonden + interne Kontrolle Master-Mix 20 µl + RNA- Probe 5 µl Mischen in Kavität übertragen real-time RT-PCR-Lauf starten

8 Testprotokoll der Ziel- Cycler- Programm 2,5 Stunden Laufzeit 1. Reverse Transkription 2. Denaturierung der Reversen Transkriptase + Aktivierung Taq- Polymerase 3. Amplifizierung Sequenzen 1 2 3

9 Testprotokoll Amplifikation der Kontrollen Ct-Wert = Detektionsschwellenwert Positivkontrolle -Fam Positivkontrolle IC-Hex Negativkontrolle IC-HEX Threshold

10 Testprotokoll Auswertung der real-time RT-PCR-Ergebnisse RNA-Probe interne Konrolle FAM IC HEX Genom nachweisbar positiv nicht nachweisbar negativ Viel -Genom nachweisbar Kompetitive Hemmung der IC -Genom nicht nachweisbar IC nicht detektierbar Wiederholung

11 Testcharakteristika Spezifität Die Sonde detektiert alle Pestivirus-Stämme I und II Gaede et al. 2005, Nachweis und Spezies-spezifische Differenzierung von Pestiviren mit der real-time RT-PCR. Berl.Münch.Tierärztl. Wschr. 118, Hoffmann et al., J Virol Methods 136, (2006)

12 Einsatz der internen Kontrolle PCR-Inhibitoren am Beispiel Phenol (Extraktion) -FAM Ohne Phenol + ++ Amplifikationskontrolle Ausbleiben des -Signals korreliert mit Ausfall der internen Kontrolle +++ Probe - IC-HEX FAM Ct Ct S S + Phenol S ++ Phenol S +++ Phenol No Ct No Ct IC-HEX Ohne Phenol

13 Einsatz der internen Kontrolle Amplifikationskontrolle PCR-Inhibitoren - Rinderkot Zusetzen von Rinderkot zur Ohrstanzprobe vor der Homogenisierung Das RNA-Eluat wurde unverdünnt, 1/10 und 1/100 verdünnt in der real-time RT-PCR eingesetzt. Probe interne Kontrolle FAM HEX Ct- Wert Ct-Wert A 22, A Kot unverd. No Ct No Ct A Kot 1: A Kot 1: durchgeführt am Institut für Mikrobiologie, LMU München

14 Testcharakteristika Exzellente Reproduzierbarkeit der Ergebnisse! Reproduzierbarkeit 7 Testläufe an verschiedenen Tagen VK (%): 1,3 2,2 8 Ansätze/Probe in einem Testlauf VK (%): 2,2 3,0 Interassay-Varianz -FAM IC-HEX Probe Ct-MW STD VK ( %) Ct-MW STD VK ( %) PC 28,95 0,67 2,3 28,28 0,50 1,8 NC no Ct ,25 0,62 2,2 pos 20,95 0,54 2,6 no Ct - - Ohr pos 31,32 0,69 2,2 28,13 0,35 1,3 Intraassay-Varianz -FAM IC-HEX Proben Ct-MW STD VK (%) Ct-MW STD VK (%) NC no Ct ,44 0,91 3,0 10 K/well 37,26 1,05 2,8 28,31 0,63 2, K/well 28,51 0,30 1,1 29,03 0,84 2, K/well 18,25 0,36 2,0 no Ct - - Batch to batch Ergebnisse derselben Proben mit 3 verschiedenen Chargen VK (%): 0,9 2,9 -FAM IC-HEX Ct-MW STD VK (%) Ct-MW STD VK (%) PC 10 7 K/well 17,26 0,25 1,5 no Ct - - PC 10 6 K/well 20,90 0,10 0,5 no Ct - - PC 10 5 K/well 23,96 0,29 1,2 29,61 0,87 2,9 PC 10 4 K/well 27,32 0,25 0,9 28,58 0,41 1,5 PC 10 3 K/well 30,45 0,55 1,8 28,57 0,26 0,9 PC 10 2 K/well 33,13 0,62 1,9 28,79 0,38 1,3 PC 10 1 K/well 35,93 0,45 1,2 28,52 0,42 1,5 PC 1 K/well 38,63 1,37 3,6 28,63 0,28 1,0

15 Testcharakteristika Titration von in vitro RNA* mit bekannter Kopienzahl Hohe analytische Sensitivität weniger als 10 Kopien/well werden sicher detektiert Analytische Sensitivität FAM Signal Kopien/well *zur Verfügung gestellt von B.Hoffmann, FLI, Insel Riems

16 Validierung Vollblut, Plasma, Serum Blutproben oder RNA mit bekanntem -Status aus real-time RT-PCR in house-untersuchungen (staatliche Einrichtungen) Einzel- und Poolproben unterschiedlicher Poolgröße Aufarbeitung dieser Proben mit QIAamp Viral RNA Mini (QIAGEN)

17 Validierung Blut, Plasma, Serum Gesamtprobenzahl 356 Referenz positiv 153 positiv 151 Sensitivität 98,7 % Spezifität 98,5 % Effizienz 98,6 % negativ 2 Referenz negativ 203 negativ 200 positiv 3

18 Validierung Ringversuch 2006 Sehr gute Ergebnisse im Vergleich zu in house- Methoden und anderen kommerziellen Kits Auch die schwach positiven Proben werden sicher detektiert Proben-Nr. erwartetes Virotype Ringversuch Ergebnis Ct-Werte A6 neg no Ct A7 neg no Ct A8 pos 22,58 A9 pos 26,17 A10 pos 29,77 A11 pos 32,57 A12 pos 23,32 A13 schwach pos 31,07 A14 schwach pos 34,15 A15 pos 30,89 A16 schwach pos 34,55 A17 neg no Ct A18 pos 28,68 A19 neg no Ct A20 pos 25 A21 pos 24,87 A22 pos 26,54 A23 neg no Ct

19 Poolbarkeit Pools von 25 Blutproben zugelassen Pool -FAM -FAM Pool Ct MW CT Ct MW Ct 1 20, ,43 20, , ,45 30, , ,64 23, , ,92 32, , ,65 24, , ,79 34,72 Vollblut,,BVD positiv, TGD Thüringen Vollblut, BVD positiv, TGD Thüringen

20 Probenaufarbeitung Blut, Plasma, Serum Herstellung der Poolproben RNA-Isolierung (verschiedene kommerzielle Kits werden empfohlen) Ohrstanzgewebe Homogenisierung der Proben -Laborschwingmühle (MixerMill, TissueLyser) -Ribolyser und entsprechende Lyse-Matrix Herstellung der Gewebepools RNA-Isolierung (kommerzielle Kits empfohlen)

21 Probenaufarbeitung Aufarbeitung der Gewebeprobe Ohrstanze + Lyse-Matrix µl Lyse-Puffer Ribolyser 2 x 40 sec, Stufe 4 oder Vortex: 20 sec, Stufe max RNA Extraktion RNeasy Fibrous Tissue Mini (QIAGEN) Lyse-Matrix Labor Diagnostik Leipzig

22 Validierung Ohrstanzgewebe - mechanische Zerkleinerung - Zentrifugation - RNA Extraktion (RNeasy Fibrous Tissue Mini (QIAGEN) - real-time RT-PCR TissueLyser (Retsch / QIAGEN) *Untersuchungen durchgeführt am Inst. f. Mikrobiologie, LMU München im Rahmen eines Arbeitsbesuches bei Dr. R. Fux und Dr. G. Wolf

23 Validierung Ohrstanzen Probe - Stamm Virotype LMU inhouse kolostrale -AK Ct- Wert Ct-Wert Ct-Wert SNT-Titer - FAM IC-HEX -FAM A BH Erna H KB2 KB12 1- CR4043 neg 22, ,04 1- CR4043 neg CR4043 neg 22, ,09 1- CR4043 neg ,01 1- PT810 < PT810 > pos neg No Ct No Ct

24 Poolbarkeit Probe Pools von 12 Ohrstanzgewebe-Proben zugelassen -FAM -FAM Pool Probe Pool MW MW Ohr ,11 Ohr , , ,89 Erna, PI-Tier, LMU München KB 11, PI-Tier, LMU München

25 Zusammenfassung zugelassener Testkit (FLI 451) mit real-time PCR-Lizenz von F. Hoffmann- La Roche sehr hohe Sensitivität Poolbarkeit (25 Serumproben, 12 Ohrstanzproben) standardisiert einfach und robust in der Durchführung integrierte Amplifikationskontrolle Exzellente Ergebnisse im Vergleich zu in house-methoden und anderen kommerziellen Kits

26 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!

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