MutaPLATE Enterovirus real time RT-PCR Kit (TaqMan)

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1 MutaPLATE Enterovirus real time RT-PCR Kit (TaqMan) Qualitativer Test für den spezifischen Nachweis von humanen Enteroviren (Polio-, Coxsackie A-, Coxsackie B- und Echoviren) in real time PCR - Mikrotiterplattensystemen (z.b. Applied Biosystems/ Stratagene, Corbett Research: RotorGene, Cepheid: SmartCycler). KV Für in vitro Diagnostik Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, Bensheim, Germany Tel.: +49 (0)6251/ info@immundiagnostik.com Fax: +49 (0)6251/ Stand: N:/WINDAT/AL/MB/ADT/MPEnt 1

2 1. VERWENDUNGSZWECK Der MutaPLATE Enterovirus real time RT-PCR Kit ist ein qualitativer Test zum spezifischen Nachweis von Enteroviren (Polio-, Coxsackie A-, Coxsackie B- und Echoviren) in klinischen Proben (Vollblut, Plasma, Respirationstraktproben, CSF (cerebrospinal fluid) und anderen Körperflüssigkeiten) mittels real time PCR-Mikrotiterplattensystemen (z.b. Applied Biosystems, Stratagene, Corbett Research: RotorGene, Cepheid: SmartCycler). 2. EINLEITUNG Humane Enteroviren sind ubiquitär vorkommende Pathogene mit einer weltweit hohen Inzidenz (ca. 500 Millionen Infektionen/Jahr). Bislang sind 66 verschiedene Serotypen bekannt, welche der Familie der Picornaviridae zugeordnet werden. Enteroviren können lebensbedrohende Infektionen hervorrufen, insbesonders bei Kindern. Krankheiten wie Myocarditis, Paralysis, multiples Organversagen, Meningitis und Encephalitis sind häufig mit einer Enterovirus-Infektion assoziiert. Humane Enteroviren sind kleine, hüllenlose Viren mit einem ss-rna Genom von 6-7 kb. Bislang ist kein effektives antivirales Chemotherapeutikum zur Bekämpfung der Viren verfügbar. Der Infektionsweg ist in der Regel fäkal-oral, aber die hoch ansteckenden Viren können auch über befallene Lebensmittel / kontaminiertes Essbesteck übertragen werden. 3. TESTPRINZIP Der MutaPLATE Enterovirus real time RT-PCR (TaqMan) Kit enthält spezifische Primer, TaqMan-Sonden und weitere Reagenzien für die Detektion von Enteroviren in klinischen Proben mittels offenen real time PCR Systemen. Zielsequenz für den Nachweis ist ein Abschnitt innerhalb der 5`-untranslatierten Region (5`-UTR) des Genoms. Der erste Schritt des Enterovirennachweis ist eine reverse Transkription (RT), in welcher das virale RNA-Genom in cdna umgeschrieben wird. Anschließend werden mit einer thermostabilen DNA-Polymerase mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) die für Enterovirus spezifischen Genfragmente amplifiziert. Nachfolgend wird die Spezifität des entstandenen Amplikons durch real time Hybridisierung mit für Enterovirus - spezifischen Sonden überprüft (TaqMan: mit Fluorophor und Quenchermolekül markierte Oligonukleotide). Bei spezifischer Enterovirus-Amplifikation wird das emittierte Fluoreszenzsignal von der optischen Einheit des real time PCR Mikrotiterplattensystems detektiert (ABI: PRISM SDS-, Stratagene: MxPRO-, Corbett Research: Rotorgene 3000/ Software). Die Enterovirus-spezifische Amplifikation wird mittels FAM-Fluoreszenz gemessen. Zudem überprüft eine in jede Reaktion eingeschlossene interne Kontrolle, welche parallel zu den Proben koamplifiziert und detektiert wird, eine mögliche RT- bzw. PCR-Inhibition. Die Detektion der amplifizierten internen Kontrolle wird mittels VIC/ HEX- Fluoreszenz gemessen. Stand: N:/WINDAT/AL/MB/ADT/MPEnt 2

3 4. KITBESTANDTEILE Jeder Testkit enthält Reagenzien zur Durchführung von 96 Bestimmungen, sowie eine Gebrauchsanleitung. Bezeichnung Reagenz Konfektion Deckelfarbe A1 Enzym Mix 1x 90 µl blau A2 Primer-/ Sonden Mix 2 x 750 µl gelb A3 Positivkontrolle 1 x 0,5 ml rot A4 Negativkontrolle 1 x 0,5 ml grün 5. ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL Benötigte Materialien - mitgeliefert: Reagenzien für die real time PCR im Mikrtotiterplattenformat Gebrauchsanweisung Benötigte Materialien - nicht mitgeliefert: real time PCR-Mikrotiterplattensystem, z. B. Applied Biosystems oder vergleichbare Instrumente (z.b. von Stratagene, Corbett Research oder Cepheid) TC II - PCR-Reaktionsplatte, 96-well (Applied Biosystems) oder vergleichbare Mikrotiterplatten (bzw. PCR-Reaktionsgefäße, welche sich ebenfalls zur optischen Detektion in zum Applied Biosystem vergleichbaren Instrumenten eignen) Transparente Abdeckfolien für Mikrotiterplatten RNA-Extraktionskit für Stuhlproben (z. B. High Pure Viral RNA Kit, Roche) Pipetten (0,5 200 µl) sterile Filterspitzen für Mikropipetten 6. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Alle Reagenzien (A1 bis A4) sollten bei -20 C gelagert werden. Alle Reagenzien können bis zum Ablauf des (auf der Kit-Packung angegebenen) Mindesthaltbarkeitsdatum verwendet werden. Mehrfaches Auftauen/ Einfrieren der Reagenzien A1, A2, A3 und A4 unbedingt vermeiden (im Bedarfsfall aliqoutieren) Arbeitsschritte zügig durchführen und alle Reagenzien dabei stets geeignet kühlen. Primer-/ Sonden-Mix (A2) vor Lichtkontakt schützen. Stand: N:/WINDAT/AL/MB/ADT/MPEnt 3

4 7. HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Für in vitro Diagnostik. Dieser Test muss durch speziell geschultes Personal durchgeführt werden. Die klinischen Proben müssen als potentiell infektiöses Material angesehen und entsprechend auch entsorgt werden. Die Regeln der Good Laboratory Practice (GLP) müssen eingehalten werden. Testkit nach Ablauf des Mindesthaltbarkeitsdatum nicht mehr verwenden. AMPLIFIKATION Die PCR-Technologie ist sehr sensitiv, d. h. die Amplifikation eines einzelnen Moleküls generiert Millionen identischer Kopien. Diese Kopien können in Form von Aerosolen entweichen und sich auf Unterlagen festsetzen. Um eine Kontamination von Proben mit Amplifikaten aus vorausgegangenen Experimenten zu vermeiden, sollte in zwei (möglichst auch räumlich) von einander getrennten Bereichen gearbeitet werden und zwar: 1) Bereich, in dem die Proben vorbereitet und die Reagenzien angesetzt werden. 2) Bereich für die Amplifikation und deren Detektion. Pipetten, Reaktionsgefäße und andere Arbeitsmittel sollten nicht innerhalb der verschiedenen Arbeitsbereiche zirkulieren. Sterile Pipettenspitzen mit Filtereinsatz benutzen. Für jeden Arbeitsplatz neue Handschuhe und Kittel benutzen. Dekontaminieren Sie in regelmäßigen Abständen Ihre Pipetten und Laborbänke mit Dekontaminationslösung. Vermeiden Sie Aerosolbildung. 8. TESTDURCHFÜHRUNG Die gesamte Durchführung ist in folgende drei Schritte aufgeteilt: A) RNA-Extraktion. B) Reverse Transkription der RNA und nachfolgende Amplifikation/ kombinierte Detektion der entstandenen cdna-templates mittels TaqMan-Hybridisierungssonden. C) Interpretation der Ergebnisse mit Hilfe der Software des verwendeten real time PCR- Mikrotiterplattensystems (z. B. Applied Biosystems, Stratagene, Corbett Research: RotorGene, Cepheid: SmartCycler). A) RNA-EXTRAKTION 1) Die Extraktion viraler RNA wird mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen RNA- Isolierungs-Kits aus Stuhlproben durchgeführt und erfolgt entsprechend den Angaben des Herstellers (z.b. High Pure Viral RNA Kit, Roche). 2) Falls die (TaqMan) real time RT-PCR nicht sofort durchgeführt wird, sollten die extrahierten RNA-Proben bei <-20 C aufbewahrt werden. Stand: N:/WINDAT/AL/MB/ADT/MPEnt 4

5 B) REAL TIME Enterovirus (TaqMan) RT-PCR PROTOKOLL Es ist ratsam, das gesamte Protokoll zu lesen, bevor mit der Durchführung begonnen wird. Der Ansatz einer Gesamtmenge an Master-Mix für die jeweilige Anzahl an Proben und die entsprechenden Kontrollen sollte folgendermaßen erfolgen: 1) Die Enzym-Mix Menge für eine Reaktion mit der Anzahl (N) der durchzuführenden Reaktionen (inklusive Kontrollen A3 und A4) multiplizieren und zum Ausgleich der Pipettier-Ungenauigkeit einen zusätzlichen (virtuellen) Ansatz berechnen. Mit allen weiteren Reagenzien in der gleichen Weise verfahren. Reagenzien während der Arbeitsschritte stets geeignet kühlen! Reaktionsvolumen Master-Mix Volumen 0,8 µl Enzym-Mix (A1) 0,8 µl x (n +1) 14,2 µl Primer-/ Sonden-Mix (A2) 14,2 µl x (n +1) 2) Die folgenden Reagenzien in einem sterilen Reaktionsgefäß vorsichtig mischen (NICHT VORTEXEN!): Enzym-Mix (A1) und Primer-/ Sonden-Mix (A2). Diese Mischung stellt den Master-Mix dar; kurz in einer Tischzentrifuge abzentrifugieren. 3) 15 µl des Master-Mix mit einer Mikropipette/ sterilen Filterspitzen in jede der benötigten Vertiefung der 96er-Mikrtotiterplatte vorlegen. 5 µl der Proben-RNA bzw. Positiv- und Negativ- Kontrollen (A3 und A4) zu den jeweiligen Vertiefungen zupipettieren und durch Auf- und Ab-Pipettieren mischen (es empfiehlt sich zuerst die Negativkontrolle zu pipettieren und diese unverzüglich mit Abdeckfolie zu verschließen, um Kontaminationen zu vermeiden). Die 96er-Mikrotiterplatte mit der transparenten Abdeckfolie abkleben und in das real time PCR Mikrotiterplattensystem überführen. 4) Folgendes RT-PCR Protokoll durchführen: Beim RotorGene-Instrument folgende Einstellungen wählen: Enterovirus-spezifische Amplifikation: Source 470nm - Detector 510nm (FAM Channel) Interne Kontroll-Amplifikation: Source 530nm - Detector 555nm (JOE Channel) 45 C für 30 min 95 C für 2 min 45 Zyklen: 95 C für 0 sec 55 C für 30 sec Messung am Ende dieses Schritts 72 C für 20 sec Stand: N:/WINDAT/AL/MB/ADT/MPEnt 5

6 C) RT-PCR ANALYSE UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE Enterovirus spezifische Amplifikation wird mittels FAM Fluoreszenz detektiert. Die interne Kontrolle wird mittels VIC / HEX Fluoreszenz gemessen. Folgende Einstellung sollten für die Bestimmung von Reporter- und Quencer-Molekülen mit der ABI PRISM SDS Software (bzw. der Software vergleichbarer Instrumente) gewählt werden: Detection Reporter Quencher Enterovirus RNA FAM none Interne Kontrolle VIC / HEX none Folgende Resultate sind möglich: 1) FAM Fluoreszenz wird detektiert. Das Ergebnis ist positiv: die Probe enthält Enterorovirus - RNA. In diesem Fall ist die Detektion der VIC / HEX Fluoreszenz nicht notwendig, da hohe Enterorovirus cdna - Konzentrationen zu einem verminderten bzw. fehlenden Fluoreszenz-Signal der internen Kontrolle führen kann (Kompetition). 2) Es wird keine FAM - Fluoreszenz detektiert, jedoch eine VIC / HEX Fluoreszenz (Signal der internen Kontrolle). Die Probe enthält keine Enterorovirus - RNA. Das detektierte Signal der internen Kontrolle schließt die Möglichkeit einer PCR-Inhibition aus. 3) Weder FAM-, noch VIC / HEX Fluoreszenz wird detektiert. Es kann keine diagnostische Aussage gemacht werden. Die PCR-Reaktion wurde inhibiert. Stand: N:/WINDAT/AL/MB/ADT/MPEnt 6

7 MutaPLATE Enterovirus real time RT-PCR Kit (TaqMan) Qualitative screening assay for the real time detection of Enterovirus using real time PCR microplate systems (e. g. Applied Biosystems, Stratagene, CorbettResearch: RotorGene, Cepheid: SmartCycler). KV For in vitro diagnostic use Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, Bensheim, Germany Tel.: +49 (0)6251/ Fax: +49 (0)6251/ Date: 2007/07/30 1 N:WINDAT/AL/MB/ADT/eMP Enterovirus TaqMan

8 1. INTENDED USE The MutaPLATE Enterovirus real time RT-PCR (TaqMan) kit is a qualitative screening assay for the detection of Enterovirus in clinical samples (whole blood, plasma, respiratory samples, cerebrospinal fluid [CSF] etc.) using microplate systems (e. g. Applied Biosystems, Stratagene, CorbettResearch: RotorGene, Cepheid: SmartCycler). 2. INTRODUCTION Human enteroviruses (until now there are 66 serotypes known, belonging to the family of Picornaviridae) are ubiquitous pathogens with a high incidence worldwide (about 500 million infections/ year). Enteroviruses may cause life-threatening infections, especially among children. Diseases such as myocarditis, paralysis, multiple organ failure, meningitis and encephalitis may be associated with enterovirus infections. Human Enteroviruses are small, non-enveloped viruses with a ss-rna genome of 6-7 kb. Thus far, there is no effective antiviral chemotherapeutics available. Route of transmission is fecal-oral, but the viruses can also be transmitted via contaminated food, knifes and forkes and others and are highly contagious. 3. PRINCIPLE OF THE TEST The MutaPLATEL Enterovirus real time RT-PCR (TaqMan) kit contains specific primers, TaqMan probes and additional material for the detection of the Enterovirus. Clinical samples are used as starting material for the extraction of RNA. Target sequence for the detection is within the 5`- untranslated region (5`-UTR) of the genome. The amplification of possibly present Enterovirus RNA and the proof of specificity by hybridization of the amplicon specific TaqMan probe is done in one step. The TaqMan probe is labelled with a fluorescence dye on one end and a quencher molecule on the other end. In case of a Enterovirus specific amplicon, the emitted fluorescence signal is detected and quantified by the real time PCR microplate system`s optical unit (ABI: PRISM SDS-, Stratagene: MxPRO-, Corbett Research: Rotorgene 3000/ Software). Enterovirus specific amplification is measured by FAM fluorescence. To exclude a possible RT-PCR inhibition, the amplification mix contains an internal control. The amplification of this internal control does not affect the Enterovirus detection and is measured by a probe`s VIC / HEX fluorescence. Date: 2007/07/30 2 N:WINDAT/AL/MB/ADT/eMP Enterovirus TaqMan

9 4. KIT CONTENT Each kit contains enough reagents to perform 96 tests. Each kit also contains a package insert. Reference Type of reagent Presentation Cap color A1 Enzyme Mix 1 x 90 µl blue A2 Primer-/ Probe Mix 2 x 750 µl yellow A3 Positive control 1 x 0.5 ml red A4 Negative control 1 x 0.5 ml green 5. TEST PERFORMANCE Required materials - provided: RT-PCR reagents Package insert Required materials - not provided: ABI system or comparable instrument (e.g. Stratagene, Corbett Research, Cepheid) TC II reaction plate, 96 wells (Applied Biosystems) or comparable microtiter plates or reaction tubes to be used for optical detection within the two-parts holding frame (Applied Biosystems) Optical adhesive covers (Applied Biosystems) or comprable covers RNA extraction kit Pipets (0.5 µl 200 µl) with sterile filter tips 6. STORAGE AND HANDLING All reagents (A1 to A4) should be stored at -20 C. All reagents can be used until the expiration date printed on the labels. Do not freeze and thaw the reagents A1, A2, A3 and A4 several times. If used sporadically, prepare aliquots of the reagents. Cool all reagents during the working steps. Date: 2007/07/30 3 N:WINDAT/AL/MB/ADT/eMP Enterovirus TaqMan

10 7. WARNINGS AND PRECAUTIONS For in vitro diagnostic use only. This assay needs to be carried out by skilled personnel. Clinical samples should be regarded as potentially infectious materials. This assay needs to be run according to GLP (Good Laboratory Practice). Do not use the kit after its expiration date. AMPLIFICATION The RT-PCR technology is utmost sensitive. Thus, amplification of a single molecule generates millions of identical copies. These copies may evade through aerosols and sit on surfaces. In order to avoid contamination of samples with RNA which previously was amplified, it is important to physically strictly divide sample and reagent preparation units from sample amplification units. Set up two separate working areas: 1) Isolation of the RNA 2) Amplification/ detection of amplification products Pipets, vials and other working materials should not circulate among working units! Use always sterile pipette tips with filters Wear separate coats and gloves in each area Routinely decontaminate your pipettes and the laboratory benches with decontaminant Avoid aerosols 8. PROCEDURE The complete procedure is separated in three steps: A) RNA extraction. B) Amplification and combined detection of RNA fragments using reverse transcriptase and TaqMan probes. C) Interpretation of the results using the ABI: PRISM SDS- (respectively the Stratagene: MxPRO- or Corbett Research: RotorGene 3000/ 6000-) software. A) RNA-EXTRACTION 1) RNA extraction (by use of a commercial available RNA isolation kit): Extract viral RNA from clinical respiratory samples by use of a commercial RNA isolation kit (suited for stool samples) according to the manufacturer`s instructions. 2) If (TaqMan) RT-PCR is not performed immediately, store extracted RNA at 20 C. Date: 2007/07/30 4 N:WINDAT/AL/MB/ADT/eMP Enterovirus TaqMan

11 B) Real time Enterovirus (TaqMan) RT-PCR-PROTOCOL Please carefully read the manufacturer s instructions before starting the procedure! Each assay should include a negative and positive control. Use filter tips for all pipetting: 1) The Enzyme Mix volume per reaction and sample (n) should be multiplied with the number of samples to be performed (including controls A3 and A4). For reasons of unprecise pipetting, add an extra (virtual) sample. Proceed in the same manner with all additional reagents! Cool all reagents during the working steps! Reaction Volume Master Mix Volume 0.8 µl Enzyme Mix (A1) 0.8 µl x (n+1) 14.2 µl Primer-/ Probe Mix (A2) 14.2 µl x (n+1) Mix gently (do NOT vortex!) the following reagents in a sterile tube: Enzyme Mix (A1) and Primer-/ Probe Mix (A2). This mixture is the Master Mix. Spin down briefly in a table centrifuge. Pipet 15 µl of the amplification mix (Master Mix) per well of a 96 wells optical microtiter plate. The number of wells used is calculated from the number of samples plus one positive and one negative control. 2) Add 5 µl of sample RNA or positive or negative control per well, respectively. Mix by up and down pipetting. Pipet the negative control first. To avoid contamination, it is advisable to cover the wells containing the negative control with an adhesive seal while pipetting the positive control and sample RNA. Remove this adhesive seal after preparing all wells. 3) Cover the 96 wells optical microtiter plate with optical adhesive cover. 4) Run the RT-PCR using following temperature protocol: For RotorGene instrument choose following settings: enterovirus specific amplification: Source 470nm - Detector 510nm (FAM Channel) Internal control amplification: Source 530nm - Detector 555nm (JOE Channel) 45 C for 30 min 95 C for 2 min 45 cycles of: 95 C for 0 sec 55 C for 30 sec measurement at end of this step 72 C for 20 sec Date: 2007/07/30 5 N:WINDAT/AL/MB/ADT/eMP Enterovirus TaqMan

12 C ) RT-PCR ANALYSIS AND INTERPRETATION OF RESULTS Enterovirus specific amplification is detected by FAM fluorescence. The internal control is measured by VIC / HEX fluorescence. Use following settings to define a reporter and quencher with the ABI PRISM SDS software: Detection Reporter Quencher Enterovirus RNA FAM none Internal Control VIC / HEX none Following results can arise: 1) FAM fluorescence is detected. The result is positive: The sample contains Enterovirus. The occurence of VIC/HEX fluorescence is inessential as high concentrations of Enterovirus RNA may reduce or even inhibit the amplification of the internal control. 2) No FAM, but VIC/HEX fluorescence is detected. The result is negative: The sample does not contain Enterovirus. The detected signal of the internal control excludes the possibility of an inhibition of the RT-PCR. 3) Neither FAM, nor VIC/HEX fluorescence is detected. A diagnostic statement can not be made. An inhibition of the RT-PCR reaction occurred. Date: 2007/07/30 6 N:WINDAT/AL/MB/ADT/eMP Enterovirus TaqMan