5.2. Differenzierung und Quantifizierung von Rind und Schwein mittels Real-Time PCR

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1 5.2. Differenzierung und Quantifizierung von Rind und Schwein mittels Real-Time PR Im Laufe der Zeit wurde bei dieser rbeit die Differenzierung und Quantifizierung der DN von Schwein und Rind in den Vordergrund gestellt, da die meisten sich im Handel befindenden Fleisch- und Wurstprodukte vor allem diese beiden Sorten Fleisch beinhalten. In diesem bschnitt soll das unter 5.1 aufgestellte β-ctin-system mit dem mitochondrialen 16S rrn-system verglichen werden Vorversuche & Optimierung des β-ctin-systems Konstruktion von weiteren spezifischen Primern für Schwein und Rind nhand von einigen Richtlinien versuchte man, Primer zu konstruieren, die eine noch größere Spezifität und Differenzierung zwischen Rind und Schwein zuließen. Im ereich des 3 Endes der Forward-Primer wurde getestet, ob die Lage und/oder die rt eines Nukleotidaustausches, der in einer Fehlpaarung (mismatch) mündete, diese Erhöhung der Differenzierungsmöglichkeit erlaubte. Generell gilt, daß es Fehlpaarungen gibt, an denen die Polymerase früher einen Stop einlegt, während sie bei anderen Nukleotidaustauschen diesen Fehler öfters überliest. Die Fehlpaarungen GT oder TG stellen einen sogenannten non-frequent stop dar. Die Polymerase überliest diese Stelle öfters, während sie bei Kombinationen wie,g,g oder GG einen frequent stop einlegt- die mplifikation abbricht [22]. Durch frequent stop- Fehlpaarungen wird die Schmelztemperatur der Primer erniedrigt. Im folgenden ist ein Überblick über die Fehlpaarungsmöglichkeiten und ihre uswirkung auf die Polymerase dargestellt. GT << << T << << TG T G TT G GG non-frequent stop frequent stop Es wurden zwei zusätzliche Rinderprimer und drei weitere Schweineprimer nach diesen Kriterien konstruiert. Es wurden auch zusätzlich Primer gesetzt, die keine Fehlpaarung im ereich des 3 Endes beinhalten. In die Real-Time PR wurden 1ng/µl und 1ng/µl DN von Rind und Schwein eingesetzt. Diese nsätze wurden sechs Mal wiederholt. ls Reverse- Primer diente der allgemeine sich im Exon III befindende bctin-r. Nachfolgend wurden die Sequenzen der spezifischen Primer und anschließend Vergleiche von t-werten aufgelistet, die eine ussage über die Spezifität der Primer zulassen. Je größer der Unterschied zwischen den t-werten der DNs des Schweins und Rindes ist, desto besser läßt sich mit diesem Primer differenzieren. Weiters wurden die Sequenzen von Rind und Schwein in dem ereich der Primer aufgezeigt und mit blauer Farbe die asen unterlegt, die einen Unterschied zwischen Rind und Schwein in dieser Sequenz erkennen lassen. Die Nukleotidaustausche im ereich des 3 Endes der Forward-Primer wurden in rot gehalten, wobei die untere ase das ursprüngliche Nukleotid darstellt. 45

2 Rinderprimer-Vergleich os taurus: G TT G GG G T T bctin-t-f1: G TT G GG G G bctin-t-f2: G TT G GG T bctin-t-f3: G TT G GG G G bctin-t-f4: G TT G GG G Sus scrofa: GG GGT G G GT T 12 1 bctin-t-f1 bctin-t-f3 bctin-t-f2 bctin-t-f4 8 t nzahl der Wiederholungen bb. 5-1.: Vergleich der t -Werte der spezifischen Rinder- Primer mit DN von Rind und Schwein (1ng/µl) 25 2 bctin-t-f1 bctin-t-f3 bctin-t-f2 bctin-t-f4 t nzahl der Wiederholungen bb : Vergleich der t -Werte der spezifischen Rinder- Primer mit DN von Rind und Schwein (1ng/µl) 46

3 eim Vergleich dieser beiden Diagramme konnte keine eindeutige ussage zugunsten eines spezifischen Rinder-Primers getroffen werden. Die t-werte bewegten sich im Schnitt um 8-1, von ein paar usreißern abgesehen. Der Primer bctin-t-f4 wurde erst in den letzten beiden Wiederholungen der Real-Time PR verwendet. uch beim Vergleich der eingesetzten DN-Mengen von 1ng/µl und 1ng/µl ließ sich kein Trend in die eine oder andere Richtung ablesen. In weiterer Folge wurden auch noch die Primer für Schwein aufgelistet. Schweineprimer-Vergleich: Sus scrofa: GG GGT G G GT T bctin-ss-f1: GG GGT G G GT T G bctin-ss-f2: GG GGT G G GT bctin-ss-f3: GG GGT G G GTG T G bctin-ss-f4: GG GGT G G GT T G bctin-ss-f5: GG GGT G G GT T os taurus: G TT G GG G T T t nzahl der Wiederholungen bctin-ss-f1 bctin-ss-f2 bctin-ss-f3 bctin-ss-f4 bctin-ss-f5 bb : Vergleich der t -Werte der spezifischen Schweine-Primer mit DN von Rind und Schwein (1ng/µl) 47

4 t bctin-ss-f1 bctin-ss-f2 bctin-ss-f3 bctin-ss-f4 bctin-ss-f nzahl der Wiederholungen bb : Vergleich der t -Werte der spezifischen Schweine-Primer mit DN von Rind und Schwein (1ng/µl) eim Vergleich der beiden Diagramme mit den spezifischen Schweine-Primern ergab sich ein ähnliches ild wie bei der Real-Time PR mit den spezifischen Primern für Rind. Der größte t-wert-unterschied belief sich im Schnitt ebenfalls auf 1, was zu einer eindeutigen Differenzierung nicht ausreichte. Weiters waren auch keine Unterschiede zwischen den verschieden eingesetzten DN-Mengen zu erkennen. Insgesamt konnte man feststellen, daß sich aus diesen Primern höchstens bctin-t-f1 oder bctin-ss-f4 zu einer Quantifizierung, die aber sehr ungenau wäre, heranziehen ließen. Weiters wurde erkannt, daß die Lage und rt der Nukleotidaustausche in dieser Region keine uswirkung auf die Spezifität der Primer hatten. Somit konnten keine generellen ussagen über das Konstruieren eines möglichst spezifischen Primers im ereich seines 3 Endes getätigt werden. Zusammenfassend mußte man erkennen, daß sich im gewählten Sequenzabschnitt zu viele Homologien zwischen Rind und Schwein befinden müssen, um eine eindeutige Differenzierung und Quantifizierung möglich zu machen. us diesem Grund ging man dazu über, in der Sequenz verschobene Forward- Primer zu konstruieren, die sich vor allem am 3 Ende gut unterschieden. Zusätzlich wurde in zwei Fällen ein Nukleotidaustausch vier asen vor dem 3 Ende eingebaut, der zu einer noch größeren Differenz zu den anderen Säugetieren führen sollte. os taurus Sus scrofa onsensus c++ct+cc g+g+ c+c.+g+atg a+gcg+...+ bctin-t-f5 GGTGT GTTG GG bctin-t-f6 GGTGT GTTG GGG +t++ct+cc+ +cg+c+gct+ c+c++gg+tg a t bctin-ss-f6 TT GGGGTG G bctin-ss-f7 TT GGGGTG GG GGG TTGTGTTT TTGTTG GGTT 48

5 Konstruktion eines allgemeinen Primers für Säugetiere Um das System zur Quantifizierung und Differenzierung über β-ctin zu vervollständigen, wurde ein Primer für Säugetiere geschaffen, der als ezugspunkt und Vergleichswert zu den spezifischen Primern dienen soll. os taurus Ovis aries Equus caballus Sus scrofa onsensus g c t a ccg+c c++++ t TGTTT TGTGT GTTGG -GTG MM-ct-F Optimale Primerkonzentration Um die bestmögliche Differenzierung und in weiterer Folge auch Quantifizierung zu erhalten, wurden verschiedene Primerkonzentrationen ausgetestet. eim allgemeinen Säugetier-Primer wurde durch eine Primermatrix mit dem Reverse-Primer die optimale Primerkonzentration von 3nM/3nM erstellt. Die spezifischen Forward-Primer wurden in einer Konzentration von 5nM/5nM, 3nM/3nM und 9nM/9nM mit dem Reverse-Primer ausgetestet. ls Matrix wurde DN aus drei verschiedenen Isolationen, die jeweils zwei Monate auseinander lagen verwendet. Es wurde 1ng/µl und 1ng/µl DN von Rind, Schwein und Schaf eingesetzt. Es kristallisierte sich heraus, daß die spezifischen Primer für Rind und Schwein (bctin-t-f6 und bctin-ss-f7), die eine Fehlpaarung vier asen vor Ende des 3 Endes besaßen, eine bessere Differenzierung zuließen. Diese Primer wiesen eine kleine Verbesserung in der Differenzierung gegenüber den auf den Seiten 45 ff beschriebenen Primern auf, jedoch ließen auch sie keine eindeutige qualitative ussage zu. Da es in der vorhandenen Zeit nicht möglich war, weitere Primer zu suchen, wurden diese bestmöglichen zur weiter folgenden Quantifizierung verwendet. nschließend sind als eispiel drei mplifikationsdiagramme zu sehen, die die Variation der Primerkonzentration anhand des Rinder-Primers bctin-t-f6 zeigen. 49

6 NT Ss 1ng/µl Ss 1ng/µl Oa 1ng/ml t 1ng/µl t 1ng/µl Oa 1ng/µl bb : ildschirmansicht des mplification Plots der Real-Time PR mit dem spezifischen Primer für Rind bctin-t-f6 und dem Reverse-Primer bctin-r in der Konzentration von 5nM/5nM und der DN von Rind (t), Schwein (Ss) und Schaf (Oa) in den Konzentrationen 1ng/µl und 1ng/µl - steht für die verschiedenen DN-Isolationen NT Oa 1ng/µl Ss 1ng/µl Oa 1ng/µl t 1ng/µl t 1ng/µl Ss 1ng/µl bb : ildschirmansicht des mplification Plots der Real-Time PR mit dem spezifischen Primer für Rind bctin-t-f6 und dem Reverse-Primer bctin-r in der Konzentration von 3nM/3nM und der DN von Rind (t), Schwein (Ss) und Schaf (Oa) in den Konzentrationen 1ng/µl und 1ng/µl - steht für die verschiedenen DN-Isolationen 5

7 NT Ss 1ng/µl t 1ng/µl t 1ng/µl Ss 1ng/µl t 1ng/µl t 1ng/µl bb : ildschirmansicht des mplification Plots der Real-Time PR mit dem spezifischen Primer für Rind bctin-t-f6 und dem Reverse-Primer bctin-r in der Konzentration von 9nM/9nM und der DN von Rind (t), Schwein (Ss) und Schaf (Oa) in den Konzentrationen 1ng/µl und 1ng/µl - steht für die verschiedenen DN-Isolationen Tab. 5-3.: uflistung der t-werte zwischen Rind und Schwein mit den spezifischen Primern bctin-t-f6 und bctin-ss-f7, dem allgemeinen Reverse-Primer bctin-r in unterschiedlichen Konzentrationen von 5nM/5nM, 3nM/3nM und 9nM/9nM Isolierung 5nM/5nM 3nM/3nM 9nM/9nM t zwischen Rind u. Schwein bei 1ng/µl t zwischen Rind u. Schwein bei 1ng/µl nhand der t-werte wurde erkannt, daß vermutlich die zweite Isolation der Rinder-DN mit Schweine-DN kontaminiert worden ist, da diese Probe wesentlich weniger spezifische Produkte und damit Fluoreszenz lieferte. ei Vergleich der bstände der t-werte zwischen DN des Schweins und des Rindes, konnte man sowohl bei 1ng/µl als auch 1ng/µl eingesetzte DN-Konzentration feststellen, daß die Differenzierung mit der niedrigsten Primerkonzentration 5nM/5nM am besten funktioniert hatte. Obwohl die DN des Schafes aus Platzgründen nur in die Real-Time PR mit 5nM/5nM und 3nM/3nM eingesetzt wurde, konnte man beim Vergleich dieser t-werte ebenfalls erkennen, daß die Unterscheidung zu Rind und Schwein bei der kleineren Primerkonzentration wesentlich besser war. Die mplifikation der DN des Schafes diente dazu, die Differenzierung zu anderen Säugetieren zu veranschaulichen. Im weiteren Verlauf der rbeit wurde mit der zuletzt durchgeführten DN-Isolation () gearbeitet. 51

8 Vorversuche mit dem mitochondrialen System Semiquantitative PR mit dem 16S rrn-system In diesem Vorversuch ging es darum, festzustellen, ob mit einer PR durch die Variation der Zyklenzahl der Nachweis von 1%Rind in einer unbekannten Probe möglich ist. Es wurde DN aus einer Probe isoliert, die zwar Schweinefleisch, aber kein Rindfleisch enthielt und reine Rinder-DN zugegeben, sodaß ihr nteil 1% in der Probe betrug. ls Primer wurden der universelle (unimit) und der für Rind spezifische Primer (tmit) des 16S rrn-system verwendet. Durch vorangegangene Experimente wurde anhand von Verdünnungsreihen von Rind und Schwein ermittelt, daß der größte Unterschied in der Produktausbeute zwischen 3 und 35 Zyklen zu beobachten war. Es wurden Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Proben ohne und mit 1% DN des Rindes wurden bei 62 mit 3 und 35 Zyklen mit beiden Primern amplifiziert. Um eine Konzentrationsabschätzung der PR-Produkte am garosegel vornehmen zu können, wurde ein Standard (Mass Ruler DN Ladder Low Range, MI Fermentas) verwendet, dessen anden bestimmte Konzentrationen zugewiesen werden können. Es wurden 5µl Standard und 1µl PR-nsätze versetzt mit Stoplösung aufgetragen. Mass Ruler unimit tmit unimit tmit 3 Z. 3 Z. 35 Z. 35 Z. NT NT 5bp bb : garosegel der semiquantitativen PR zum Nachweis von 1% Rind (+, +) in einer Probe aus Schwein (, ); Z=Zyklenzahl Ein großer Unterschied war zwischen den mplifikationen mit dem universellen Primer und dem spezifischen Primer für Rind zu beobachten. Während mit dem spezifischen Rind-Primer bei 3 Zyklen keine anden zu erkennen waren, erhielt man mit dem universellen Primer erwartungsgemäß überall Produkte. Jedoch wurde bei der Probe +1% Rind die Rind-DN nicht mit der DN-Lösung aus der Schweinprobe verdünnt sondern mit Wasser. Trotzdem konnte aus den vorhandenen anden die ussage getätigt werden, daß die 1% Rind-DN nachweisbar ist. Die anden der Proben mit 1% Rind-DN wurden nach 35 Zyklen mit beiden Primern wesentlich stärker. Die Probe, in der statt der isolierten DN Wasser verwendet worden ist, zeigt am deutlichsten den Unterschied in der Produktausbeute zwischen der mplifikation bei 3 und 35 Zyklen. Diese Probe zeigt auch die Sensitivität des Systems, da bei 1/1 der eingesetzten DN-Menge im Vergleich zu den anderen Proben deutliche Unterschiede zu sehen sind. nhand des quantifizierbaren Standards konnte eine Konzentrationsabschätzung der anden von ~1ng/µl gemacht werden. 52

9 Konzentrationsbestimmung mit dem PicoGreen dsdn Quantitation Reagent Rn Konz.[ng/ml] Mit diesem Kit sollten Vergleichswerte zur Konzentrationsbestimmung durch das Photometer gemacht werden. us den photometrisch vermessenen DN-Proben von Rind (Muskel und Leber), Schwein (Muskel und Leber), Schaf (Muskel und Leber), Pferd, Huhn, Truthahn, Gans, Strauß und Ente wurden Teile entnommen und laut dieser Konzentrationsbestimmung auf 4ng/ml verdünnt. ls Standards dienten der aus dem Kit stammende PicoGreen Lambda-DN- Standard (1µg/ml), eine weitere Lambda-DN (λ DN Hind III Marker; 5µg/ml) und ein selbst hergestellter Standard aus Lachs-Sperma-DN. Die Standards wurden von 1ng/ml bis 5ng/ml verdünnt. Die Messungen mit dem Farbstoff erfolgten bei 5ms, 1ms und 25ms. Es wurden diese Meßwerte ausgewählt, deren Standardkurven die größte Linearität besaßen. In diesem Fall handelte es sich um die Messung bei 5ms. bb : I Standardkurve mit dem PicoGreen Lambda- DN-Standard zur Quantifizierung mit dem PicoGreen dsdn Quantitation Reagent Rn Konz.[ng/ml] bb : II Standardkurve der Lambda-DN (λ DN Hind III Marker) zur Quantifizierung mit dem PicoGreen dsdn Quantitation Reagent 53

10 1 8 Rn Konz. [ng/ml] bb. 5-2.: III Standardkurve der Lachs-Sperma-DN zur Quantifizierung mit dem PicoGreen dsdn Quantitation Reagent Durch diese Standardkurven ergaben sich folgende Konzentrationen: Tab. 5-4.: Konzentrationsberechnungen mit dem PicoGreen dsdn Quantitation Reagent anhand von drei verschiedenen Standardkurven; die zu vergleichende photometrisch ermittelte DN-Konzentration beträgt 4ng/ml Spezies Rn Konzentration aus I [ng/ml] Konzentration aus II [ng/ml] Konzentration aus III [ng/ml] Rind; Leber 387,95 155,7 317,29 381,82 Rind; Muskel 486,31 163,7 333,65 42,12 Schwein; Leber 2963,3 124,62 248,31 296,28 Schwein; Muskel 4454,94 175,69 361,67 436,86 Schaf; Leber 2435,62 16,55 28,21 246,55 Schaf; Muskel 4686,75 183,63 379,28 458,7 Pferd; Muskel 51,1 194,7 43,85 489,17 Gans; Muskel 3498,93 142,96 289,2 346,76 Ente; Muskel 4152,63 166,39 341,3 411,26 Huhn; Muskel 3648,45 148,8 3,38 36,8 Truthahn; Muskel 429,73 167,3 343,3 413,75 Strauß; Muskel 426,51 167,19 342,79 413,44 Es wurden dieselben Proben mit den gleichen Standards mehrmals vermessen. Die oben dargestellten Standardkurven und die dazugehörigen Ergebnisse einer Messung sollen hier als repräsentatives eispiel angeführt werden, da sich ein Trend durch sämtliche Quantifizierungen mit dem PicoGreen dsdn Quantitation Reagent abzeichnete. In jeder der vorgenommenen Messungen erreichte man mit dem PicoGreen Lambda-DN- Standard maximal die Hälfte der eingesetzten Konzentration, während die Quantifizierung anhand der anderen beiden Standards (λ DN Hind III Marker und Lachs-Sperma-DN) relativ gut mit den photometrisch bestimmten Konzentrationen übereinstimmte. us diesem Grund wurde in der weiteren rbeit auf die photometrisch bestimmten Konzentrationen zurückgegriffen. 54

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