Auswertung PCR. Übersicht Nachweise mittels PCR. 1. Beta-Globin

Transkript

1 Übersicht Nachweise mittels PCR Lfd.-Nr. Nachweis von: Elektrophorese/Photometrie/ Luminometrie/ Fragmentanalyse/Sequenzierung/ Restriktionsanalyse 1. Beta-Globin 267 bp (zum Nachweis der DNA- Qualität) 2. B-Lymphome (Immunglobulin-Schwerketten- Rearrangement) 3. Borrelien - mit dem Primer Fr2A: Bande oder Schmier im Bereich zwischen 240 und 280 bp - mit dem Primer Fr3A: Bande oder Schmier im Bereich zwischen 60 und 160 bp Pos. bei Cp-Wert unter 40 Real-time-PCR (Flagellin-Gen-Sequenz von B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii, B. valaisiana)) 4. BRAF (real-time-pcr AMP) (Nachweis von Mutation V600 im BRAF-Gen auf Chromosom 7) 5. Chlamydien (cryptic plasmid von Chlamydia trachomatis) 6. c-kit Sequenzierung Pos. bei Cp-Werten unter bp - zum Spezifitätsnachweis sequenzieren Ex 9, 11, 13, 17, 18: ca bp Sequenzierung zum Mutationsnachweis (Nachweis von Mutationen Exon 9,11,13,17,18) 7. CMV Real time-pcr (Tib Molbiol) (Fragment des Glykoprotein B Genes) 8. Darmparasiten Real-time-PCR von RIDA Gene von r-biopharm (Nachweis von Giardia lamblia, entamoeba histolytica, Cryptosporidium parvum, Dientamoeba fragilis) Pos. bei Cp unter 37 Optimal bei Cp zwischen 18 und 35 Giardia lamblia: Filter465/510: Ktr Cp25+/-1 Entam. hist.: Filter 533/610: Ktr. Cp 26+/-1 Cryptosp.parv.: Filter 618/660: Ktr. Cp 27+/-1 Dientam. frag.: Filter 533/580: Schmelzkurve: Peak bei 85 C +/-1 C 04.13/rev. 11 Auswert_PCR 1 Seite 1 von 8

2 9. EBV 1. real-time-pcr (TibMolbiol) 2. Nested PCR (Bam HI W-Fragment) 1. pos. Bei Cp bis 37 2.: 1. Lauf: 400 bp 2. Lauf: 249 bp 10. E. coli (Verotoxine, enteroinvasive E. coli, hitzelabiles und hitzestabiles Toxin) VT1: 130 bp VT2: 285 bp VT2v: 385 bp - zur Abgrenzung von VT2-Vatianten kann das Amplifikat von VT2 einer Restriktionsanalyse unterworfen werden (siehe Anhang S. 5) 11. EGFR (Exon auf Chr. 7) 1. real-time-pcr (AMP) 2. Sequenzeirung 12. Endopredict (Sividon) RT-qPCR, Gen-Expression Prognose Mamma-CA 13. Entamoeba histolytica und dispar (18S rrna-gen) 14. GNAS1 (Nachweis von Wildtyp und Mutationen am Codon 210 am GNAS1-Gen [Guanine-nucleotidebinding protein] bei polyostotischer und monoostotischer fibröser Dysplasie) EIEC: 424 bp LT: 708 bp ST: 182 bp 1. Pos. bei Cp zwischen 20 und 37 2.Sequenzierung Zum Mutationsnachweis Der Cp-Wert von RPL37A des QC-Streifens sollte unter 24 liegen Real-time-PCR: Pos. bei Cp bis 40 Amplifikatlänge: je ca. 372 bp WT-1: WT-2: gnascys/r201c gnasgly/r201g gnashis/r201h 04.13/rev. 11 Auswert_PCR 1 Seite 2 von 8

3 15. Hämochromatose (Nachweis von Mutation C282Y Cystein zu Tyrosin und H63D Histidin zu Asparaginsäure am HFE- Gen, einem zur MHC Klasse I gehörenden Protein) C282Y: 164 bp, Restriktion mit SnaBI: 164 bp (Wildtyp) 72 bp und 92 bp (Mutation) H63D: 161 bp Restriktion mit BclI: 94 bp und 67 bp ( Wildtyp) 161 bp (Mutation) 16. Helicobacter pylori real-time-pcr (23S rrna-gen) sicher pos. bei Cp unter Herpes-1 u. 2 Real-time-PCR (Nachweis des Glykoprotein D (gd)-genes von HSV-1 und des Glykoprotein G (gg)-genes von HSV-2) 18. Herpes zoster Real-time-PCR (Nachweis Polymerase-Gens von Varizella zoster)) 19. HPV nach LCD Array 3.5 C von Chipron (Primer MY09/11 und Mix 125) Hybridisierung nach PCR 20. HPV (L1-Region, sicher pos. bei Cp unter 40 sicher pos. bei Cp unter 40 Mit dem Chipron-Test werden folgende HPV- Typen nachgewiesen: 6,11,16,18,31,33,35,39,42,44,45,51,52,53,54,56,5 8,59,61,62,66,67,68,70,72,73,81,82,83,84,90,91 Ca. 450 bp (MY09/11) Ca. 150 bp (GP5+/6+9 Primer MY09/11 und Primer GP5+/6+)). Sequenzierung zur Differenzierung der verschiedenen HPV-Typen 04.13/rev. 11 Auswert_PCR 1 Seite 3 von 8

4 21. HPV 16, 18 oder 33 (als nested PCR, E6 ORF) 1.Lauf: 307 bp 2. Lauf: HPV 16: 124 bp HPV 18: 188 bp HPV 33: 145 bp 22. HPV Haut L1 ORF, Consensus PCR für viele Haut-HPV s) 23. Hypermethylierung des MGMT-Promotors (Gliome) Methylierung und quantitative real-time-pcr (Promotor-Hypermethylierung der O6-Methylguanine-DNA- Methyltransferase) 24. IDH1-Mutationen (Gliome) (Codon 132, Chromosom 2) 25. JC-Virus (Large T-Antigen) 26. Kaposi-Sarkome (HHV-8) (nested PCR für ORF26 des humanen Herpes-Virus 8) 480 bp (ggf. Sequenzierung) Cp sollte unter 40 liegen, Anteil der methylierten DNA sollte über 1% liegen. Sequenzierung (129 bp) Real-Time-PCR: Pos. bei Cp unter 40 1.Lauf (KS-1 u. KS-2): 233 bp 2. Lauf (WH-1 u. WH-2): ca. 180 bp 27. k-ras-mutations-nachweis 1. real-time-pcr (AMP) (Codon 12, 13 und 61 vom Exon 1 k-ras-gen) 2. Nested PCR (Codon 12/13 von Exon 1 k-ras- Gen) 1. Real-time-PCR: Pos. bei Cp zwischen 15 und Nested PCR: 1. Lauf: 179 bp 2. Lauf: 114 bp Sense- und Antisense-Strang sequenzieren 28. Leishmania ssp. (Nachweis konservierte Region der Minicircle kdna) 29. Listeria monocytogenes und Listeria sp. 116 bp Sequenzierung Listeria-genus-spezifisches Gen; PCR und Hybridisierung auf einem Teststreifen (blau = pos.) 04.13/rev. 11 Auswert_PCR 1 Seite 4 von 8

5 30. Mikrosatellitenanalyse (Screening HNPCC) 31. Mykobakterien-Nachweis nach Chipron LCD MYCO-Direkt 1.7 (Nachweise von M. tuberculosis komplex, atyp. Mykobakterien mittels Multiplex-PCR) 1.Satz Primer: BAT26: bp (Mononucleotid Repeat) BAT40 : bp (Mononucleotid Repeat) MfD15 (D17S250): ca. 150 bp (Dinucleotid- Repeat) D2S123: bp (Dinucleotid-repeat) APC: bp (Dinucleotid-Repeat) 2. Satz Primer: Bat25: ca. 90 bp (Mononucleotid-Repeat) D10S197: bp (Dinucleotid-Repeat) D18S58: bp (Dinucleotid-Repeat) D18S69: ca. 110 bp (Dinucleotid-Repeat) MYCL1: bp (Tetranucleotid-Repeat) - Amplifikate jeweils von Normal (Blut- ) und Tumor- Probe gepaart vergleichen a) Nachweis von M. tuberculosis-komplex IS6110: 123 bp b) Nachweis von M. genus c) Nachweis von M. avium/intracellulare (MAI) M. kansasii M. xenopi M. abscessus M. gordonae M. peregrinum M. szulgai M. haemophilum M. xenopi M. marium/ulcerans M. simiae M. smegmatis 04.13/rev. 11 Auswert_PCR 1 Seite 5 von 8

6 32. Mykobakterien (Nachweise von M. tuberculosis komplex und atyp. Mykobakterien) Hybridisierung nach PCR 33. Mykobakterien (65 kda-antigen) 34. Mykobakterien BCG (Nachweis Spacer-Region der Direct Repeat Region) 35. Oligodendrogliome (Nachweis on 1p- und 19q- Deletionen) 36. Parvovirus B19 (NS1-Gen) 37. SV-40 (Nachweis des der retinoblastoma (Rb-) pocket binding domain des SV-40- Virus (real-time-pcr) b) Nachweis von M. tuberculosis-komplex IS6110: 123 bp Evt. zusätzlich Sequenzierung bei Vorhandensein eines Amplifikates c) Multiplex-PCR für M. gordonae (221 bp), M kansasii (292 bp) und M. fortuitum (144 bp) = Set A d) Multiplex-PCR für M. avium (216 bp), M. malmoense (236 bp) und weitere atypische Mykobakterien (16 SrRNA) ( 147 bp) = Set B 1. Lauf: 310 oder 231 bp 2. Lauf: 133 bp - zum Nachweis der Mykobakterien-Art dient eine Restriktionsanalyse (siehe Anhang S. 5) 99bp bp: M. bovis BCG 99bp: M. bovis, M. africanum I Keine Bande: M. tuberculosis, M. africanum II Primer: D1S468, D1S508, D1S489, D1S200, D1S514; D1S507, D1S199, D1S2734, D1S211, D1S2696: D19S210, D19S219, D19S596, D19S1182, D19S412, D19S Lauf: 241 bp 2. Lauf: 217 bp - zum Spezifitätsnachweis ggf. sequenzieren Sicher positiv bei Cp unter /rev. 11 Auswert_PCR 1 Seite 6 von 8

7 38. T-Lymphome (Gamma-Rezeptor) Nested PCR (Nachweis der Gamma-Rezeptor- Familien V 1-11 nach Lorenzen et al. 1994): 1. Lauf: 260 bp 2.Lauf: Bande oder Schmier im Bereich von 120 bp Mix PCR (Nachweis der Gamma-Rezeptor- Familien V 2 5, V 8 9, V nach Trainor et al. 1991): Bande oder Schmier im Bereich von bp 28. Toxoplasma gondii (Nachweis eines multicopy genomic fragmentes [529 bp DNA repetitive Region]) 29. Tropheryma whipplei (Nachweis Morbus whipple mittels real-time-pcr) 30. Yersinia enterocolitica (16 SrRNA) 162 bp - zum Spezifitätsnachweis sequenzieren Positiv bei Cp unter bp - zum Spezifitätsnachweis sequenzieren Erläuterungen: Bei der Beschreibung 1. Lauf und 2. Lauf handelt es sich jeweils um eine nested PCR, wobei der 2. Lauf der auszuwertende ist /rev. 11 Auswert_PCR 1 Seite 7 von 8

8 Anhang Restriktionsanalyse für E. coli und Mykobakterien: Erstellt: Dr. K. Henneicke Geprüft: Dr. med. Schreiber Freigegeben: Dr. med. Schreiber Datum / Unterschrift Datum / Unterschrift Datum / Unterschrift 04.13/rev. 11 Auswert_PCR 1 Seite 8 von 8