Bedeutung der PCR für die Borreliose-Diagnostik

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1 Bedeutung der PCR für die Borreliose-Diagnostik Jahrestagung der Deutschen Borreliose- Gesellschaft Wuppertal, O. NOLTE Die gesamte Präsentation ist urheberrechtlich geschützt. Eine Weiterverwendung, auch auszugsweise, darf nur mit Genehmigung des Verfassers erfolgen. Wenn nicht anders ausgewiesen, stammen alle Bilder und Abbildungen vom Verfasser. Die Verwendung anderer Bilder/Abbildungen erfolgt zu reinen Unterrichtszwecken. Labor Dr. Brunner Mainaustraße 48 a/b DE Konstanz

2 Diagnostik von Infektionskrankheiten vor 1880: Diagnose nach Untersuchung des Patienten, keine Labordiagnostik Russell Drysdale (1941) The Agapitos/Wilson Collection 1882: Robert KOCH: Begründung der modernen medizinischen Mikrobiologie, Aufklärung von Tuberkulose und Cholera R. Virchow & R. Koch (Robert Koch Bezwinger des Todes, 1937) Beginn des 20. Jh Feste Nährböden; Bakteriologie als Säule der Infektionsdiagnostik R. Koch Nobel Award certificate

3 PCR Polymerase Kettenreaktion Eine Nachtfahrt und die Polymerase Kettenreaktion 1982: Carry B. MULLIS: Erstbeschreibung der polymerase chain reaction Kary B. MULLIS erhält den Nobelpreis für Medizin aus der Hand von König Gustav (1993) [pers. homepage von MULLIS]

4 PCR die Kettenreaktion typisches Temperaturprofil einer PCR Die PCR besteht aus einer bis zu 50-fachen Wiederholung des gezeigten Zyklus: Denaturierung: aufschmelzen des DNA Doppelstrangs annealing: anlagern der primer (Startmoleküle) extension: verlängern durch die Polymerase Zeitangaben konventionelle PCR (aus NOLTE et al (2005): Biophotonics

5 PCR die Primer Animation von: Richard WHEELER (Zephyris) GNU-Lizenz

6 PCR die Primer jedes Gen hat seine eigene DNA-Sequenz Beispiel: ribosomales Gen (Borrelia burgdorferi) 5 forward -Strang des DNA-Doppelstrangs 3 GATCCGTTAGGCTTGATTAGCCCGGATAGGCTTC/ /CGGGATAGACGTCGAGCTTCGCGCTCTAGGGGAT CGAAGCGCGAGATC 3 5 forward-primer TTAGGCTTGATT CTAGGCAATCCGAACTAATCGGGCCTATCCGAAG/ /GCCCTATCTGCAGCTCGAAGCGCGAGATCCCCTA 3 reverse -Strang des DNA-Doppelstrangs 5

7 PCR die Primer jedes Lebewesen hat seine eigene DNA-Sequenz Beispiel: ribosomales Gen (Staphylococcus epidermidis) 5 3 GATCCGTTAGGCTTGATTAGCCCGGATAGGCTTC/ /CGGGATAGACGTCGAtCaTCcCcCTCTAGGGGAT CGAAGCGCGAGATC 3 5

8 PCR die Primer die Auswahl der primer erlaubt, nur Erreger-spezifische DNA zu amplifizieren! Bb. Se. GATCCGTTAGGCTTGATTAGCCCGGATAGGCTTC/ /CGGGATAGACGTCGAGCTTCGCGCTCTAGGGGAT CGAAGCGCGAGATC GATCCGTTAGGCTTGATTAGCCCGGATAGGCTTC/ /CGGGATAGACGTCGAtCaTCcCcCTCTAGGGGAT CGAAGCGCGAGATC 3 5 in diesem Beispiel würde das ribosomale Gen der Borrelien amplifiziert da die primer mittels komplementärer Basenpaarung binden können während das ribosomale Gen des Hautbesiedlers S. epidermidis nicht amplifiziert würde!

9 PCR die Kettenreaktion Nov.19 th 2010 IBIS Biosciences die eigentliche Amplifikation DNA Doppelstrang 95 C + primer 1 und 2 95 C + primer 1 und 2 semikonservative Neusynthese 95 C + primer 1 und 2 zunehmende Anreicherung von Amplifikaten definierter Länge

10 PCR die Kettenreaktion die eigentliche Amplifikation DNA aus dem Untersuchungsmaterial dient als Vorlage ( template ) für die Neusynthese (Amplifikation) die Neusynthese startet immer von den primern, welche als Startpunkt für die Polymerase dienen. Durch intelligente Auswahl von primern sehr hohe Spezifität möglich! nur wenn die primer ihr Ziel finden kommt es zu einer Amplifikation

11 Direkter vs. indirekter Erregernachweis Zeitpunkt (min.) Zeitpunkt (max.) Erregernachweis Sensitivität Spezifität Kosten Serologie (ELISA, Western- Blot) nein, indirekt! frühestens 4 Wochen nach Infektion ggf. Jahre bis Jahrzehnte variabel mäßig, abhängig vom Antigen GKV!* PCR direkt (nur DNA!) ab Infektion während Infektion, ggf. auch länger mäßig bis hoch hoch bis sehr hoch IGel!** ( ) Kultur direkt ab Infektion solange Infektion andauert niedrig bis mäßig Goldstandard (GKV!)*** * Western-Blot nur als Bestätigungs- oder Abklärungstest ** IGEL: Individuelle Gesundheitsleistung bei GKV-Pat.; Kosten variieren von Labor zu Labor *** nur wenige Labore, da Borrelien schwer anzüchtbar sind

12 Direkter vs. indirekter Erregernachweis Die Serologie ist ein indirektes Verfahren, um einen Erregerkontakt nachzuweisen! Die PCR ist ein schnelles, sensitives Verfahren um Erreger-DNA im Untersuchungsmaterial nachzuweisen. Die Kultur ist ein langwieriges, wenig sensitives aber hoch-spezifisches Verfahren, um den Erreger direkt nachzuweisen und weitere Tests vorzunehmen.

13 Von der Probe zum PCR-Ergebnis Das Ergebnis der PCR wird durch die Qualität des Untersuchungsmaterials beeinflusst. Probennahme DNA-Isolierung

14 geeignete Untersuchungsmaterialien Zecke (lebend, nicht in Tesa fixiert) Hautbiopsien (nativ, NIE in Formaldehyd, mind. Stecknadelkopf groß, opt. von 2 Stellen) z.b. bei Erythema, Acrodermatitis, unklaren Hauterscheinungen (Knie-)Gelenkspunktate/Synovialflüssigkeit (mind. 1 ml), Synovialmembranen intraoperatives Material (NIE fixiert!) Liquor cerebrospinalis (mind. 1 ml, besser 3 4 ml!) Urin (Morgenurin, Erststrahl, mind. 5 ml) Blut (EDTA- oder Citratblut, KEIN Heparinblut, kein Serum, mind. 1 ml)

15 ungeeignete Untersuchungsmaterialien zerdrückte Zeckenlarven mit Tesa fixiert Formaldehyd (Formalin) fixiertes Gewebe Lipome Stuhl Körperflüssigkeiten <1 ml nur bedingt, <0,1 ml nicht geeignet

16 Von der Probe zum PCR-Ergebnis Um aus einer Probe eine PCR zu machen muss die DNA isoliert werden. Probennahme DNA-Isolierung PCR Ergebnis Animation von: Richard WHEELER (Zephyris) GNU-Lizenz

17 Prinzip der DNA-Extraktion biologische Materialien, bspw. Hautbiopsien, Gewebedünnschnitte Liquor Urin Zecken Borrelien isolierte DNA DNA bindende Matrix 1.) 2.) 3.) 4.) 5.) 6.) 7.) NOLTE (2010): Borreliose Wissen 22

18 DNA-Extraktion 200 µl (=0,2 ml) Untersuchungsmaterial (1/5 ml) DNA-Extraktion in 100 µl (Aufkonzentration 1:1) 1 10 µl Extrakt pro PCR-Reaktion Annahme: 1000 Borrelien/mL Blut 200 Borrelien gelangen in die Extraktion 200 Borreliengenome in 100 µl Extrakt 2 Genome pro µl Extrakt Wie viele Genome sind notwendig für eine sicher positive PCR?

19 PCR Nachweisgrenze Die Nachweisgrenze (analytische Sensitivität) einer guten PCR liegt bei 1 2 Genome pro PCR* (entspr Borrelien/mL) ( bei 1-10 µl pro PCR) zum Vergleich Mikroskopie: Nachweisgrenze mit Färbung ca /ml Nachweisgrenze ohne Färbung ca /ml Die PCR ist grundsätzlich ein hoch-sensitives Verfahren und anderen Erregernachweisen i.d.r. überlegen! *ab <10 Genome pro PCR treten Verteilungseffekte auf; die PCR kann falsch negativ ausfallen.

20 Nachweisgrenze Borrelien pro ml* Körperflüssigkeit Borrelien in 200 µl Körperflüssigkeit Borrelien in 100 µl Extrakt** (10 4 ) (10 3 ) 100 (10 2 ) Borrelien pro µl Extrakt ,2 0,02 Borrelien pro PCR **** 0 1**** sicher positiv sicher positiv evtl. positiv eine aus einer Serie positiv! * oder pro cm 3 Gewebe ** mit 10% Verlust gerechnet *** bei Einsatz von 1 10 µl pro PCR **** gerundet auf ganze Borrelien

21 Nachweisgrenze Für ein sicher positives PCR-Ergebnis sind zwischen 100 und 1000 Borrelien pro ml/cm 3! Untersuchungsmaterial erforderlich (Standard-PCR) Durch methodische aber teure Ergänzungen lässt sich dieser Bereich auf ca pro ml/cm 3 drücken*. zum Vergleich: Erregerdichte im Blut bei Patienten mit Bakteriämie: 0,1-1 Erreger/1 ml Blut (KELLOGG et al 1984)! * Forschung: bis zu 1 Genom pro ml, high-end Forschung: bis zu 1 Genom pro 10 ml

22 Verteilungsproblem Ursache für falsch negative PCR-Ergebnisse Körperflüssigkeiten mit intakten Borrelien (bspw. Liquor [1], Plasma [2] ) 200 µl = Zentrifugation = 1 ml Zell-haltige Lösung nach Zenrifugation [1] siehe auch GOOSKENS et al 2006 [2] siehe auch GOODMAN et al 1995 Pellet mit Entzündungszellen und ggf. Bakterien

23 Von der Probe zum PCR-Ergebnis Die Kettenreaktion aus (fast) nichts wird viel! Probennahme DNA-Isolierung PCR Ergebnis Erregernachweis durch Vervielfachung die Amplifikation Bilder: PCR mit moderner Dreiraumtrennung NOLTE Animation von: Richard WHEELER (Zephyris) GNU-Lizenz

24 PCR = Amplifikation! Nov.19 th 2010 IBIS Biosciences Vervielfältigung und das Kontaminationsproblem! log Kopien der Ziel-DNA PCR-Zyklen Weltbevölkerung im Jahr 2020 Sichtbarkeitsgrenze Elektrophorese tatsächlicher Amplifikationsverlauf* Nachweisgrenze H1N1-PCR rechnerisch: ca. 10 Billionen (10 12 ) DNA-Moleküle nach 40 Zyklen ca. 10 Moleküle reichen für eine Kontamination aus! * durch Abschwächung des Enzyms und Verbrauch der Reagenzien

25 PCR = Amplifikation! Nov.19 th 2010 IBIS Biosciences Vervielfältigung und das Kontaminationsproblem! Größenstandard Positivkontrolle Negativkontrolle positive Zecke Elektrophoresegel zur Darstellung der vervielfältigten (=positive PCR s) Ziel-DNA Moleküle Ergebnis einer so genannten nested (geschachtelten) PCR mit 20 Zyklen + 40 Zyklen; gelb: Sichtbarkeitsgrenze, rot: falsch positives Resultat [Ergebnis konnte nicht reproduziert werden]

26 Nachweisgrenze die PCR ist ein hoch empfindliches Nachweisverfahren die Signalverstärkung (Amplifikation) erfolgt durch Verdopplung der Ziel-DNA die Amplifikation verläuft logarithmisch es gilt: die PCR ist kontaminationsanfällig, und setzt höchste Maßstäbe an Erfahrung, Qualität und Ausrüstung des Labors!

27 Von der Probe zum PCR-Ergebnis Unterschiedliche PCR-Verfahren: ein Prinzip aber dennoch nicht vergleichbar! Probennahme DNA-Isolierung PCR Ergebnis PCR-Methoden handgestrickt, kommerziell, nested, real-time? Bilder: NOLTE Animation von: Richard WHEELER (Zephyris) GNU-Lizenz

28 Methodenüberblick (1) Standard-PCR, 2 primer, Gelnachweis, Identifikation nach Größe des PCR-Produkts, selten, ungeeignet, geringe Spezifität Nachweis der Amplifikation im Elektrophoresegel DNA Primer* 1 Primer* 2 * Primer: Startmoleküle, die den Zielbereich der PCR auf der DNA und damit den nachzuweisenden Erreger definieren. Eine PCR benötigt mindestens zwei Primer an verschiedenen Stellen der Ziel-DNA.

29 Methodenüberblick (2) nested (geschachtelte) PCR, 2 x 2 primer, Gelnachweis, hohe Spezifität (2. primer-paar!) höchste analytische Sensitiviät (1 Genom), hohes Kontaminationsrisiko DNA Primer 1 Primer 2 1. PCR: 20 Zyklen (=Voramplifikation oder Anreicherung), danach werden 5 µl aus PCR 1 in PCR 2 übertragen ( superexponentielle Amplifikation) DNA Primer 3 Primer 4 Nachweis der Amplifikation im Elektrophoresegel

30 Methodenüberblick vergleich Standard-PCR und nested PCR unspezifisch spezifisch durch Verwendung von 2 primern hohes Risiko unspezifischer Ergebnisse, Beurteilung schwierig spezifisch durch Verwendung von 2 mal 2 primern hohe Spezifität und Unterdrückung unspezifischer Resultate durch Voramplifikation (beachte das kleinere PCR- Produkt)!

31 Methodenüberblick (3) Standard-PCR (2 primer) und Verwendung einer spezifischen Sonde (bspw. dipstick-verfahren), gute Spezifität, mäßige analytische Sensitivität (10 20 Genome pro PCR) DNA Sonde Primer* 1 Primer* 2 Nachweis der Amplifikation im dipstick-verfahren; PCR- Produkte binden an eine Sonde, die auf dem dip-stick verankert ist, Nachweis über eine Farbreaktion

32 Methodenüberblick (4) real-time-pcr mit (a) einer/ (b) zwei Sonde/n, (a) gute/ (b) sehr gute Spezifität, gute analytische Sensitivität (1 10 Genome pro PCR) DNA (a) Sonde Primer* 1 Primer* 2 (b) Sonde-1 Sonde-2 Auswertung einer realtime PCR am PC; die Vervielfältigung der Ziel-DNA kann online in Echtzeit monitoriert werden; je früher eine Kurve erscheint, desto mehr Ziel-DNA war in der Ursprungsprobe

33 Methodenüberblick (5) PLEX-ID Standard-PCR mit Massenspektrometrie; fast uneingeschränkte Erregersuche und hohe Spezifität durch Multiplex-Ansatz (= mehrere Primer-Paare) Verlust an Sensitivität!

34 Methodenvergleich breites Methodenspektrum mit Vor- und Nachteilen keine Methode mit Zulassung für die Routinediagnostik (IVD-Zulassung = in vitro Diagnostik); Voraussetzung: CE- Kennzeichnung* (= Zulassung als Medizinprodukt gemäß Art. 17 und Anhang XII der Richtlinie 93/42/EWG) [auch nicht PLEX-ID!]) häufig homebrew (= eigene Methoden) oder kommerzielle, aber nicht IVD-zugelassene Verfahren, die laborintern validiert werden müssen Ursprünglich Abkürzung für Europäische Gemeinschaft in den vier Amtssprachen (bspw. Communauté Européenne ), heute reines graphisches Symbol mit Verknüpfung zu der entsprechenden EWG-Richtlinie. * PCR von QIAGEN mit CE-Markierung aber nicht durch Studien validiert.

35 Methodenvergleich daher mangelnde Standardisierung und Vergleichbarkeit der Verfahren, damit verbundene Einschränkungen für den Betroffenen häufig nicht erkennbar!

36 Von der Probe zum PCR-Ergebnis PCR positiv oder: wie sag ich s meinem Patienten? Probennahme DNA-Isolierung PCR Ergebnis Animation von: Richard WHEELER (Zephyris) GNU-Lizenz

37 Ergebnis: negativ = negativ? nicht nachweisbar!!! Probe war tatsächlich negativ Anzahl der Borrelien in der Probe war unter der Nachweisgrenze Volumen der Probe war zu gering (<100 µl) Inhibition (bei bspw. Blut, Gewebe, Anwesenheit von Formalin möglich; interne Kontrolle sollte verwendet werden!) Laborfehler (Kontrollen!)

38 Ergebnis: positiv = positiv? DNA war nachweisbar!!! Probe war tatsächlich positiv Laborkontaminationen (abhängig von Laborausstattung, QM-System, Qualifikation und Erfahrung der Mitarbeiter, geeignete Kontrollsystem, Validationen!) Kreuzreaktion ( einfache PCR-Systeme ohne Spezifikationskontrolle [selten])

39 Zusammenfassung Die PCR ist zwar ein direktes Verfahren dessen Resultat im Hinblick auf die Symptomatik und andere Laborparameter interpretiert werden muss! Die PCR kann aber nicht zwischen lebenden (vitalen) und toten Erregern ( freie DNA ) unterscheiden! Die Grenzen des Verfahrens (untere Nachweisgrenze, verwendetes primer-system, Leistungsdaten) sind für eine differenzierte Interpretation unerlässlich!

40 Zusammenfassung (2) Unterschiedliche Systeme erschweren Vergleichbarkeit der Ergebnisse, ausreichend validierte, CE-gekennzeichnete Verfahren derzeit nicht erhältlich. Ko-Infektionen : derzeit nur wenig Erfahrungen, kaum Anbieter. Die PCR ist das im Durchschnitt sensitivste Nachweisverfahren. Neben falsch negativen Resultaten besteht die Gefahr von falsch positiven Ergebnissen. Dieses Risiko ist umso höher, je sensitiver die PCR ist.

41 Ausblick Caspar David FRIEDRICH: Wanderer über dem Nebelmeer um 1818 Hamburger Kunsthalle

42 Ausblick Bezüglich Sensitivität der PCR s ist eine Grenze erreicht (~1 Genom pro PCR). Verbesserungen werden in Zukunft nur im Bereich der DNA-Extraktion (Extraktion aus größerem Probenvolumen) zu erwarten sein. Neue Verfahren wie PLEX-ID mit höherer Spezifität und gleichzeitigem Hinweis auf Differentialdiagnose (multipler Erregernachweis, Ko-Infektionen ). Auf absehbare Zeit wird PLEX-ID zu teuer sein, derzeit im Bereich der Vektor-übertragenen Infektionen nur für die Forschung verfügbar (keine CE-Kennzeichnung!).

43 Ausblick In nur 30 Jahren ist die PCR von einer reinen Forschungsmethode zu einer der wichtigsten diagnostischen Verfahren gereift! 1982: Erfindung 1991: erste Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik ca. 2000: real-time Verfahren (hohe Kosten) 2010: Kopplung von PCR und Massenspektrometrie (noch höhere Kosten) was wird kommen: ~2015: hoher Automatisierungsstandard und niedrige Kosten, die PCR wird zum Massenparameter, ähnlich der heutigen klinischen Chemie und die Borreliose-Diagnostik?

44 proud member BioSciences, Karlsbad, California * veritas ex sanguis: Die Wahrheit liegt im Blut One vector many diseases: Ein Vektor viele Erkrankungen Der IBIS Skunk Work Patch basiert auf der Idee der Lockheed Skunk Works, geschlossenen, der Innovation verpflichteten Projektarbeitsgruppen.

45 Herbsttagung: , Konstanz