Etablierung einer. Homemade - PCR

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1 Etablierung einer Homemade - PCR Anja Schöpflin Institut für Pathologie Universitätsklinikum Freiburg Überblick: Anwendungsgebiete der PCR Anforderungen an Primer Auswahl geeigneter Primer / Primerdesign am Beispiel ß Globin Etablierung neuer Primer Evaluierung der Ergebnisse Trouble Shooting

2 Anwendungsgebiete der PCR: vielfältige ltige Einsatzmöglichkeiten: spezifischen Sequenzabschnitt in der DNA / cdna vervielfältigen ltigen Nachweis und Quantifizierung viraler und / oder mikrobieller Erreger Mykobakterien, HPV Nachweis einer bekannten Nukleinsäuresequenz uresequenz in der DNA / cdna dient dem Nachweis evtl. Mutationen EGFR, c-kit, B-raf, K-ras etc. Genexpressionsstudien Transkriptionslevel unterschiedlicher Gene (mrnas) in verschiedenen Gewebe oder Zelltypen quantitative RT - PCR PCR im Überblick: Taq-Polymerase Primer Komponenten einer PCR: Puffer Tris-Puffer von ph 8,55 9,0 MgCl 2 Koenzym für r die Taq-Polymerase beeinflusst die Produktspezifität dntp ATP, CTP, GTP und TTP Proben DNA / cdna

3 Anforderungen an Primer: Länge: 18 bis max. 30 Nukleotide Nukleotidzusammensetzung: GC Gehalt: 40 bis max. 60% Sequenz am 3-3 Ende: Komplementarität an den 3-3 Enden vermeiden Wiederholungen von 3 oder mehr Gs oder Cs am 3-3 Ende vermeiden Gentechnische Methoden; Spektrum Verlag Anforderungen an Primer: Schmelztemperatur T m : vereinfachte Formel zur Berechnung vom T m T m = 2 C 2 C * (A+T) + 4 C 4 C * (C+G) Annealingtemperatur T A : ca. 4 C 4 C unter der errechneten Schmelztemperatur T m muss in der Regel empirisch ermittelt werden z. B. Gradienten PCR Gentechnische Methoden; Spektrum Verlag

4 Auswahl geeigneter Primer am Beispiel ß Globin: ß Globin: (HBB oder ß Globinprotein) bildet zusammen mit alpha Globin die häufigste Form des Hämoglobins ß Globin Gen auf Chromosom 11 lokalisiert Housekeeping Gen zur Überprüfung der DNA Qualität Programme für f r Primer Design: Primer 3 Genius: Primer ncbi: Primer Blast diverse Primer Design Programme von Herstellern / Firmen (z.b. Invitrogen; Applied Biosystems; Biomol etc.) Auswahl geeigneter Primer am Beispiel ß Globin: Primer 3: Produktgröß öße e 268bp Primer Forward : 5`GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3 3 Primer Forward Primer Reverse : 5 CCA 5 GTT GCA CCT ACT TCA AC 3 3 Primer Reverse

5 Etablierung neuer Primer: Primer werden lyophilisiert geliefert Primer in entsprechendem Volumen TE Puffer oder molecular grade Water aufnehmen ph Wert sollte im neutralen bis leicht basischen Bereich liegen (ca. 7,0) Arbeitslösung sung mit molecular grade Water herstellen i. d. Regel 10µM M (=10pmol/µl) l) Etablierung neuer Primer: Schmelztemperatur T m der Primer berechnen: T m Primer Forward : 2 C 2 C * (8+1) + 4 C 4 C * (4+7) = = 62 C Primer Forward T m Primer Reverse : 2 C 2 C * (5+5) + 4 C 4 C * (8+2) = = 60 C Primer Reverse 1. Austestung in einer Gradienten PCR Annealingtemperaturen T A wie folgt gewählt: 56 C C / 58 C C / 60 C C / 62 C C / 64 C DNA aus Zelllinie als positiv Kontrolle 50ng DNA Einsatzmenge

6 Etablierung neuer Primer: Ansatz der PCR Reaktion: 20µl Ansatz, 50ng DNA Einsatzmenge: Komponente 1x Endkonzentration 10x Reaktionspuffer [15mM MgCl 2 ] 2,0µl 25mM MgCl 2 0,4µl 2mM 10mM dntp Mix 0,4µl 0,2mM Primer Forward [10µM] 1µl 0,5µM Primer Reverse [10µM] 1µl 0,5µM Taq Polymerase 5Units/µl 0,1µl 0,5 Units / Reaktion 50ng Template DNA 1,1µl 100ng 1x Wasser 13,6µl Etablierung neuer Primer: Thermoprofil: 94 C 3min. 94 C 1min. 56 C 64 C 30sec. 72 C 1min. 72 C 10min. 4 C hold 34x Initiale Denaturierung der Polymerase Denaturierung Annealing Extension Final Extension

7 Evaluierung der Ergebnisse: C C C C C PCR PCR negativ negativ 500bp 250bp 100bp 50bp Produktgröße des Ampilkons: 268bp Evaluierung der Ergebnisse: Spezifität der PCR: 500bp 250bp 100bp 50bp PCR Produkt aus Gel ausschneiden PCR Produkt aufreinigen Sequenzierung des PCR Produkts Sequenzabgleich mit der Datenbank 100% Übereinstimmung mit ß Globin

8 Evaluierung der Ergebnisse: Übertragung der etablierten Bedingungen auf FFPE Gewebe: Standardbedingungen: Annealingtemperatur T A 58 C MgCl 2 Konzentration 2mM [Endkonzentration] 4 DNA Proben aus FFPE Gewebe: 100ng Einsatzmenge DNA aus Zelllinie als positiv Kontrolle Evaluierung der Ergebnisse: DNA DNA 1 FFPE FFPE Gewebe Gewebe DNA DNA 2 FFPE FFPE Gewebe Gewebe DNA DNA 4 FFPE FFPE Gewebe Gewebe DNA DNA 3 FFPE FFPE Gewebe Gewebe PCR PCR negativ negativ Zelllinie Zelllinie (pos. (pos. Kontrolle) Kontrolle) 500bp 250bp 100bp 50bp

9 Trouble Shooting: Keine oder nur schwache Produktbildung: Sequenz der Primer stimmen nicht exakt mit der Sequenz des Template überein Fehler beim Ansatz der PCR Reaktion Proben DNA (FFPE Gewebe) ist von unzureichender Qualität stark fragmentierte DNA Heiz oder Kühlraten K des verwendeten Thermocyclers sind ineffizient Trouble Shooting: Lösungsmöglichkeiten: glichkeiten: erneute Überprüfung der Primersequenzen,, bes. bei der Verwendung neuer Primer Annealingtemperatur herabsetzen, Zyklenzahl erhöhen hen Wiederholung der DNA Extraktion, Wiederholung der PCR Erhöhung hung der MgCl 2 Konzentration, bes. bei Proben die mit EDTA entkalkt wurden (z.b. Beckenkammbiopsien) regelmäß äßige Wartung der Thermocycler durch technischen Dienst

10 Trouble Shooting: DNA DNA 1 FFPE FFPE Gewebe Gewebe DNA DNA 2 FFPE FFPE Gewebe Gewebe DNA DNA 3 FFPE FFPE Gewebe Gewebe DNA DNA 4 FFPE FFPE Gewebe Gewebe DNA DNA 5 FFPE FFPE Gewebe Gewebe DNA DNA 6 FFPE FFPE Gewebe Gewebe DNA DNA 7 FFPE FFPE Gewebe Gewebe DNA DNA 8 FFPE FFPE Gewebe Gewebe PCR PCR negativ negativ 500bp 250bp 100bp 50bp DNA DNA 1 FFPE FFPE Gewebe Gewebe DNA DNA 2 FFPE FFPE Gewebe Gewebe DNA DNA 3 FFPE FFPE Gewebe Gewebe DNA DNA 4 FFPE FFPE Gewebe Gewebe DNA DNA 5 FFPE FFPE Gewebe Gewebe DNA DNA 6 FFPE FFPE Gewebe Gewebe DNA DNA 7 FFPE FFPE Gewebe Gewebe DNA DNA 8 FFPE FFPE Gewebe Gewebe PCR PCR negativ negativ 500bp 250bp 100bp 50bp Trouble Shooting: Unspezifische PCR Produkte: Sequenz der Primer stimmen nicht exakt mit der Sequenz des Template überein Fehler beim Ansatz der PCR Reaktion (häufig bedingt durch eine falsche Primerkonzentration)

11 Trouble Shooting: Lösungsmöglichkeiten: glichkeiten: Anwendung einer hot start PCR Verwendung von hot start Taq Polymerasen essenzielle Komponenten (z.b. Taq Polymerase) ) erst nach der Denaturierung zum PCR Ansatz pipettieren Annealingtemperatur erhöhen, hen, Zyklenzahl verringern Fragen?

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