Amyloid-beta (1-40) CSF ELISA

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1 Arbeitsanleitung CSF ELISA Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von humanem in humanem Liquor zur Unterstützung der Diagnose einer Alzheimer-Erkrankung. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. ZWECKBESTIMMUNG Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von humanem in humanem Liquor zur Unterstützung der Diagnose einer Alzheimer-Erkrankung. 2. KLINISCHE BEDEUTUNG Weltweit wurde die Zahl der Demenzkranken im Jahr 2010 auf 36 Millionen geschätzt. Angenommen, es bleibt beim Mangel an effektiven Präventions- und Heilungsmöglichkeiten, wird alle 20 Jahre eine Verdoppelung der Zahl an Demenzerkrankungen erwartet. Die Alzheimer-Erkrankung ist dabei mit rund 60-70% die häufigste Ursache einer Demenz. Prävalenz und Inzidenz steigen mit zunehmendem Alter. So liegt die Prävalenz bei knapp über 1% bei den Jährigen und bei über 30% bei Personen, die 90 Jahre und älter sind. Der erste Fall einer Alzheimer-Erkrankung wurde 1907 von Dr. Alois Alzheimer beschrieben und definiert. Er schilderte die Eiweißablagerungen (Plaques) und Fasern (Tangles) im Gehirn von Patienten diese werden als zwei typische Kennzeichen der Alzheimer-Erkrankung angesehen. Die Eiweißablagerungen bestehen hauptsächlich aus Amyloid-beta (Aβ) Peptiden. Amyloid-beta Peptide werden während des normalen Zellstoffwechsels durch die β- und γ-sekretase aus dem Amyloid-Precursor-Protein (APP) gebildet und in den Liquor (CSF) abgegeben (siehe [1] und darin aufgeführte Referenzen). Bei APP handelt es sich um ein integrales Membranprotein mit 695, 751 oder 770 Aminosäuren. Es wurden viele verschiedene Aβ Peptide beschrieben wurde eine weitere häufig in den Plaques vorkommende Isoform, das Aβ(N3pE), beschrieben, wobei jedoch das häufigste in den Plaques vorkommende Peptid das Amyloid-beta (1-42) darstellt, welches im Liquor von Patienten mit Alzheimer-Erkrankung auf ca. 50%, verglichen mit einer Kontrollgruppe gleichen Alters, absinkt. Der Krankheitsverlauf einer Alzheimer-Erkrankung wird durch 3 Stadien charakterisiert, wie sie durch Arbeitsgruppen des US National Institutes of Aging definiert wurden, das präklinische Stadium, das MCI- Stadium ( mild cognitive impairment, milde kognitive Beeinträchtigung) und das Demenz-Stadium. Schon im präklinischen Stadium kommt es zur Amyloidose. Erste kognitive Defizite werden im MCI-Stadium evident, während in der finalen Demenz der Patient nicht mehr in der Lage ist, zu arbeiten bzw. Alltagstätigkeiten zu verrichten. Die Konzentration von Amyloid-beta (1-42) im Liquor wird daher als sehr hilfreicher Biomarker in der Diagnose der Alzheimer-Erkrankung angesehen (in Kombination mit anderen Biomarkern wie Tau und Phospho-Tau). Darüber hinaus wurde das Ratio von Amyloid-beta (1-42) zu in mehreren unabhängigen Studien als überlegener diagnostischer Marker im Vergleich zum Amyloid-beta (1-42) allein für die Alzheimer-Erkrankung gezeigt (z.b. [3-5]). 3. TESTPRINZIP Der Kit verwendet einen monoklonalen Antikörper spezifisch für den C-Terminus des, der auf der Oberfläche der Mikrotiterstreifen immobilisiert ist. aus der Probe, den Standards und den Kontrollen bindet an diesen Antikörper und das gebundene wird daraufhin durch einen monoklonalen Antikörper spezifisch für den N-Terminus des (Klon 82E1) erkannt. Dieser Antikörper Klon 82E1 ist mit Meerrettichperoxidase konjugiert, die mittels des Tetramethylbenzidin (TMB) Substrats nachgewiesen wird. Die Konzentration des ist somit proportional zu der gemessenen optischen Dichte. 4. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Nur zum In-vitro-Gebrauch. Nur für den Gebrauch durch Fachpersonal. 2. Vor der Testdurchführung sollte die Arbeitsanleitung vollständig und sorgfältig gelesen werden und verstanden worden sein. Die gültige Version aus dem Kit verwenden. 3. Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist IBL bzw. der jeweilige Lieferant innerhalb einer Woche nach Empfang der Ware schriftlich zu benachrichtigen. Beschädigte Komponenten dürfen nicht zur Testdurchführung verwendet werden, sondern sollten solange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden endgültig geregelt ist. 4. Chargen-Nummer und Verfallsdatum beachten. Es dürfen keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen in einem Test verwendet werden. Verfallene Reagenzien dürfen nicht verwendet werden. 5. Gute Laborpraxis und Sicherheitsrichtlinien beachten. Je nach Bedarf sollten Laborkittel, Einmal- Latexhandschuhe und Schutzbrillen getragen werden. Version / 7

3 6. Reagenzien dieses Kits, die Gefahrstoffe enthalten, können Reizungen der Augen und der Haut hervorrufen. Siehe Angaben in KOMPONENTEN DES KITS und auf den Etiketten. Sicherheitsdatenblätter für dieses Produkt sind auf der IBL-Homepage zum Download verfügbar oder auf Anfrage direkt von IBL erhältlich. 7. Chemikalien und vorbereitete oder gebrauchte Reagenzien sind unter Beachtung der jeweiligen nationalen Bestimmungen als Gefahrstoffabfall zu entsorgen. 8. Das Reinigungspersonal ist durch das Fachpersonal bezüglich möglicher Gefahren und Umgang anzuleiten. 9. Alle Reagenzien dieses Kits, die humanes Serum oder Plasma enthalten, ergaben bei der Prüfung auf anti-hcv, HBsAg bzw. Antikörper gegen HIV I/II-Virus ein negatives Ergebnis. Trotzdem kann das Vorhandensein solcher infektiöser Erreger nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Reagenzien sollten deshalb wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. 10. Kontakt mit Stopplösung vermeiden. Kann Hautreizungen und Verätzungen hervorrufen. 5. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Der Kit wird bei Umgebungstemperatur angeliefert und sollte bei 2-8 C gelagert werden. Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Hinweise zur Lagerung und Haltbarkeit der Proben und vorbereiteten Reagenzien sind den entsprechenden Kapiteln zu entnehmen. Die Mikrotiterplatte ist auch nach dem Öffnen der Verpackung bis zum Verfallsdatum des Kits haltbar, wenn der Beutel sorgfältig wieder verschlossen und bei 2-8 C gelagert wird. 6. PROBENGEWINNUNG UND -AUFBEWAHRUNG Die Alzheimer s Biomarker Standardization Initiative bietet folgende Empfehlungen für prä- und analytische Aspekte für AD Biomarker im Liquor ([6]). Probengewinnung Die Lumbalpunktion kann bei dem Patienten entweder sitzend oder liegend im Bereich der Lendenwirbel L3-L5 durchgeführt werden. Verwenden Sie vorzugsweise eine atraumatische Nadel mit kleinem Durchmesser (0.7 mm und 22 G). Mit einer kleinen Gauge-Nadel entsteht nur ein geringfügiges Loch in der Dura und mit einer atraumatischen Nadel wird die Chance auf Kontamination mit Blut im Liquor reduziert und die Heilung gefördert. Jedes Labor sollte nur eine Art von Polypropylen-Röhrchen verwenden. Unter keinen Umständen Glasoder Polystyrol-Röhrchen verwenden. Röhrchen des kleinsten Volumens verwenden und diese mindestens zur Hälfte füllen. Es ist wichtig, die Proben sorgfältig zu beschriften und betreffende Charakteristika der Probe aufzuzeichnen, so dass bei der Verwendung dieser Proben alle Details vorliegen. Eine Zentrifugation ist nur für visuell hämorrhagische Proben erforderlich. Die Zentrifugation sollte so schnell wie möglich, innerhalb von 2 Stunden nach der Lumbalpunktion, (vor Ort oder im nächstgelegenen Labor) erfolgen. Es sind keine Effekte durch die Zentrifugationsgeschwindigkeit bekannt, es wird jedoch empfohlen bei 2000g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zu zentrifugieren. Probenversand Die Proben können per Post versendet werden, wenn die Dauer des Transports weniger als 5 Tage beträgt. Probenlagerung Für längere Lagerung wird empfohlen die Proben bei -80 C einzufrieren. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren ist auf ein Minimum von 1-2 Mal zu begrenzen. Jedes Labor sollte identische Polypropylen-Röhrchen verwenden. Glas- oder Polystyrol-Röhrchen in keinem Fall für Sammlung, Lagerung oder Verdünnung von Liquorproben verwenden. Alle Verdünnungen des Liquors müssen in Polypropylen-Röhrchen erfolgen. Für die Verdünnung des Liquor ist es wichtig, zuerst den Probendiluent in ein Polypropylen-Röhrchen vorzulegen und die Liquorprobe direkt in den Probendiluent zu pipettieren. Proben mit einer Erythrozytenzahl> 500/µL sollten nicht ohne Zentrifugation verwendet werden. Lagerung: -80 C Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Haltbarkeit: < 2 Jahre Version / 7

4 7. KOMPONENTEN DES KITS Anzahl / Menge Symbol 1 x 12 x 8 MTP 3 x 6 x CAL A-F LYO 3 x 2 x CONTROL 1 LYO CONTROL 2 LYO 1 x 0.5 ml ENZCONJ CONC 1 x 100 ml SAMPLEDIL 1 x 20 ml ASSAYBUF 1 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP 1 x 50 ml WASHBUF CONC Komponente Mikrotiterplatte Beschichtet mit C-terminal spezifischem monoklonalen Maus-Antikörper. Standard A-F, lyophilisiert 0; 118; 235; 470; 940; 1880 pg/ml Enthält: und Stabilisatoren. Kontrolle 1+2, lyophilisiert Enthält: und Stabilisatoren. Konzentrationen / Akzeptanzbereiche siehe QC-Zertifikat. Enzymkonjugat Konzentrat (30x) Enthält: N-terminal spezifische monoklonale Maus-Antikörper, konjugiert an HRP (Klon: 82E1) und Stabilisatoren. Probendiluent Gebrauchsfertig. Enthält: Puffer, BSA und Stabilisatoren. Assaypuffer Gebrauchsfertig. Grün gefärbt. Enthält: Puffer, BSA und Stabilisatoren. TMB Substratlösung Gebrauchsfertig. Enthält: TMB, Puffer und Stabilisatoren. TMB Stopplösung Gebrauchsfertig. Enthält: 1 M H 2SO 4. Waschpuffer Konzentrat (40x) Enthält: Phosphatpuffer, Detergenzien und Stabilisatoren. 8. ZUSÄTZLICHES MATERIAL (NICHT IM KIT ENTHALTEN) 1. Pipetten (Multipette Eppendorf oder vergleichbare Produkte, < 3 % VK). Volumina: 0-20 µl; µl; µl 2. Orbitalschüttler ( U/min) (z.b. EAS 2/4, SLT) 3. Vortex-Mischer 4. Waschflasche, automatisches oder halbautomatisches Waschsystem für Mikrotiterplatten 5. Bidest. oder deionisiertes Wasser 6. Papiertücher, Pipettenspitzen, Stoppuhr 7. Messgerät für Mikrotiterplatten zur Messung der Absorption bei 450 nm (Referenzwellenlänge nm) 8. Röhrchen zur Probenverdünnung (Einmal-Polypropylenröhrchen) 9. 8-Kanal Mikropipette mit Reagenziengefäßen 9. HINWEISE ZUR TESTDURCHFÜHRUNG 1. Fehler bei der Handhabung der Proben oder Abweichungen von der beschriebenen Testdurchführung können die Ergebnisse verfälschen. Die angegebenen Pipettiervolumina, Inkubationszeiten, Temperaturen und Vorbereitungsschritte sind unbedingt gemäß Arbeitsanleitung einzuhalten. Nur kalibrierte Pipetten und Geräte verwenden. 2. Sobald mit der Testdurchführung begonnen wird, sollten alle Arbeitsschritte ohne Unterbrechung durchgeführt werden. Es ist sicherzustellen, dass alle benötigten Reagenzien, Geräte und Hilfsmittel zur rechten Zeit zur Verfügung stehen. Alle Reagenzien und Proben müssen auf Raumtemperatur (18-25 C) gebracht und vor Gebrauch vorsichtig ohne Schaumbildung gemischt werden. 3. Kontaminationen der Reagenzien, Pipetten und Wells/Röhrchen sind zu vermeiden. Neue Einmal- Pipettenspitzen für jede zu pipettierende Komponente und jede Probe verwenden. Die Deckel der Fläschchen nicht vertauschen. Nicht benötigte Fläschchen immer verschlossen halten. Wells/Röhrchen oder Reagenzien dürfen nicht wiederverwendet werden. Nicht benötigte Wells sollten sofort in den wiederverschließbaren Beutel mit Trockenmittel zurückgeben werden. 4. Es wird empfohlen, Doppelbestimmungen durchzuführen, um eventuelle Pipettierfehler zu erkennen. 5. Es sollte ein Pipettierschema verwendet werden, um die Identifikation der Standards und Proben auf der Platte sicherzustellen. Version / 7

5 6. Die Inkubationszeiten beeinflussen die Ergebnisse. Bei jedem Pipettierschritt sollten alle Wells in der gleichen Reihenfolge und im gleichen Zeittakt behandelt werden. Die Verwendung einer 8-Kanal- Mikropipette zum Pipettieren in alle Wells wird empfohlen. 7. Die korrekte Durchführung der Waschschritte ist entscheidend. Ungenügend gewaschene Wells ergeben falsche Ergebnisse. Die Verwendung einer Multikanalpipette oder eines automatischen Waschsystems für Mikrotiterplatten wird empfohlen. Zwischen den Inkubationen die Wells nicht austrocknen lassen. Beim Waschen und Ausschütteln dürfen die beschichteten Wells nicht beschädigt werden. Alle Reagenzien müssen daher mit Vorsicht pipettiert werden. Beim Waschvorgang ist es wichtig, dass alle Wells vollständig und gleichmäßig mit Waschpuffer gefüllt werden und nach dem Ausschütteln kein Rückstand an Flüssigkeit zurückbleibt. 8. Achten Sie auf visuell einwandfreie Liquorproben (z.b. Proben mit einer Erythrozytenzahl > 500/µL nicht ohne Zentrifugation verwenden). 10. TESTVORBEREITUNGEN Der Inhalt des Kits für 96 Bestimmungen kann in drei einzelne Läufe unterteilt werden. Die unten angegebenen Volumina beziehen sich auf einen Lauf mit allen Mikrotiterstreifen (96 Bestimmungen) Vorbereitung lyophilisierter oder konzentrierter Komponenten Verd. / rekonst. jedes Komponente Diluent Verhältnis Bemerkungen Lagerung Haltbarkeit CAL A-F LYO CONTROL 1 LYO CONTROL 2 LYO 400 µl ENZCONJ CONC 50 ml WASHBUF CONC mit 1.0 ml mit 11.6 ml ad 2000 ml Vorverdünnung der Proben SAMPLEDIL ASSAYBUF 1:30 bidest. Wasser 5-15 min auflösen. Ohne Schaumbildung mischen. Frisch herstellen und nur einmal verwenden. Ohne Schaumbildung mischen. RT (18-25 C) RT (18-25 C) Frisch herstellen und nur einmal verwenden. Frisch herstellen und nur einmal verwenden. 1:40 Gründlich mischen. 2-8 C 4 Wochen Patientenprobe zu mischen mit Verhältnis Bemerkungen z.b.: 25 µl µl Alle Verdünnungen von Liquor müssen in Liquor immer SAMPLEDIL 1:20 Polypropylen-Röhrchen erfolgen. Dies gilt auch für automatisierte Prozesse. Für die Verdünnung von Liquor ist es wichtig, zuerst den Probendiluent in ein PP-Röhrchen vorzulegen und die Liquorprobe direkt in den Probendiluent zu pipettieren. Version / 7

6 11. TESTDURCHFÜHRUNG 1. Je 100 µl der Standards, Kontrollen und verdünnten Proben in die entsprechenden Wells der Mikrotiterplatte pipettieren. Platte mit Deckel abdecken. 2. Mikrotiterplatte 120 min bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler (500 U/min) inkubieren. 3. Inkubationslösung verwerfen. Platte 5x mit je 250 µl verdünntem Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen µl verdünntes Enzymkonjugat in jedes Well pipettieren. Platte mit Deckel abdecken. 5. Mikrotiterplatte 60 min bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler (500 U/min) inkubieren. 6. Inkubationslösung verwerfen. Platte 5x mit je 250 µl verdünntem Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen µl TMB Substratlösung in jedes Well pipettieren. Platte kurz schütteln. 8. Mikrotiterplatte 30 min bei RT (18-25 C) inkubieren. 9. Die Substratreaktion durch Zugabe von 100 µl TMB Stopplösung in jedes Well stoppen. Platte kurz schütteln. 10. Die optische Dichte mit einem Photometer innerhalb von 15 min nach Zugabe der Stopplösung bei 450 nm messen (Referenzwellenlänge: nm). 12. QUALITÄTSKONTROLLE Die Testergebnisse sind nur gültig, wenn der Test gemäß der vorliegenden Arbeitsanleitung abgearbeitet wurde. Ferner muss der Anwender die GLP-Regeln (Good Laboratory Practice) oder vergleichbare Normen/Gesetze beachten. Anwender und/oder Labor müssen zur Diagnosestellung ein gemäß GLP validiertes System verwenden. Alle Kit-Kontrollen müssen innerhalb der Akzeptanzbereiche, die auf den Etiketten und dem QC-Zertifikat angegeben sind, gefunden werden. Wenn die Kriterien nicht erfüllt sind, sind die Ergebnisse ungültig und der Test sollte wiederholt werden. Jedes Labor sollte darüber hinaus eigene bekannte Proben als weitere Kontrollen mitführen. Es wird empfohlen, an den einschlägigen Ringversuchen teilzunehmen. Bei Abweichungen sind die folgenden Fehlermöglichkeiten zu überprüfen: Haltbarkeit der (vorbereiteten) Reagenzien, Lagerungsbedingungen, Pipetten, Geräte und Hilfsmittel, Inkubationsbedingungen und Waschmethoden. 13. TESTAUSWERTUNG Konzentrationsbestimmung über Standardkurve Die erhaltenen OD der Standards (y-achse, linear) gegen deren Konzentration (x-achse, logarithmisch) auftragen, entweder auf semi-logarithmischem Papier oder durch ein entsprechendes Computerprogramm. Bei Verwendung eines Computerprogramms werden die Cubic-Spline-Methode, 4-Parameter-Analyse (lin-log) oder Logit-Log-Berechnung empfohlen. Zur Berechnung der Standardkurve sollten alle Werte der Standards verwendet werden (bei Doppelwerten kann ein offensichtlicher Ausreißerwert eliminiert und stattdessen der plausiblere Einzelwert verwendet werden). Die Konzentrationen der Proben können von der Standardkurve abgelesen werden. Die standardmäßig durchzuführende Verdünnung muss in dem oben beschriebenen Auswerteverfahren berücksichtigt werden. Wenn Proben anders oder weiter verdünnt wurden, müssen die Ergebnisse mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert werden. Proben, die oberhalb des höchsten Standards gemessen werden, können wie in TESTVORBEREITUNGEN beschrieben, verdünnt und erneut analysiert werden. Version / 7

7 Typische Standardkurve (Beispiel: Nicht zur Testauswertung verwenden!) OD/OD Standard OD max (pg/ml) Mittelwert (%) A B C D E F NORMWERTE In einer multizentrischen klinischen (n = 3) Studie mit AD-Proben (= Liquor-Proben von Patienten mit früher wahrscheinlicher oder möglicher Alzheimer-Erkrankung (AD) oder Mild Cognitive Impairment (MCI) von AD- Typ.) und Kontrollproben (= Liquor-Proben von Patienten ohne kognitive Dysfunktion) wurden folgende Erwartungswerte ermittelt. AD n=119 (RE59651) (pg/ml) Amyloid-beta (1-42) (RE59661) (pg/ml) Amyloid-beta (1-42)/ 5% - Perzentile Mittelwert % - Perzentile % - Perzentile Mittelwert Kontrolle n=88 95% - Perzentile Jedes Labor sollte unter Berücksichtigung regionaler Gegebenheiten eigene Normalwertbereiche erstellen. 15. GRENZEN DES VERFAHRENS Die korrekte Durchführung der Probengewinnung und Aufbewahrung ist entscheidend für die Testergebnisse. Näheres siehe PROBENGEWINNUNG UND -AUFBEWAHRUNG. Angaben zu Kreuzreaktivitäten sind im Kapitel TESTCHARAKTERISTIKA zu finden. 16. TESTCHARAKTERISTIKA Analytische Spezifität (Kreuzreaktivität) Analytische Sensitivität (Nachweisgrenze) Cut-off Substanz Kreuzreaktivität (%) Amyloid-beta (1-42) 0.84 Amyloid-beta (1-38) 0.01 Amyloid-beta (2-40) pg/ml Mittleres Signal (Nullstandard) + 3SD (RE59651) Amyloid-beta (1-42) (RE59661) Amyloid-beta (1-42)/ Jedes Labor muss seine eigenen Cut-off-Werte erstellen. 650 pg/ml 0.05 Klinische Sensitivität na 85% 98% n=40 Klinische Spezifität na 84% 91% n=43 Präzision Bereich (pg/ml) Bereich (%) VK Mittelwert (%) Intra-Assay Inter-Assay Inter-Lot Version / 7

8 Linearität Wiederfindung Bereich (pg/ml) Bereich (%) Wiederfindung Mittelwert (%) :32 94 Bereich (pg/ml) Bereich (%) Wiederfindung Mittelwert (%) Methodenvergleich IBL Assay = 0.90 x kommerziell erhältlicher Enzymassay r² = 0.94 n = LITERATUR ÜBER DAS PRODUKT [1] Blennow K, Zetterberg H, Fagan AM. Fluid biomarkers in Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med 2012;2(9):a [2] Saido TC, Iwatsubo T, Mann DM, Shimada H, Ihara Y, Kawashima S. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE), in senile plaques. Neuron 1995;14(2): [3] Wiltfang J, Esselmann H, Bibl M, Hull M, Hampel H, Kessler H et al. Amyloid beta peptide ratio 42/40 but not A beta 42 correlates with phospho-tau in patients with low- and high-csf A beta 40 load. J Neurochem 2007;101(4): [4] Kuperstein I, Broersen K, Benilova I, Rozenski J, Jonckheere W, Debulpaep M et al. Neurotoxicity of Alzheimer's disease Abeta peptides is induced by small changes in the Abeta42 to Abeta40 ratio. EMBO J 2010;29(19): [5] Spies PE, Slats D, Sjogren JMC, Kremer BPH, Verhey FRJ, Rikkert MGMO et al. The cerebrospinal fluid amyloid beta42/40 ratio in the differentiation of Alzheimer's disease from non-alzheimer's dementia. Curr Alzheimer Res 2010;7(5): [6] Vanderstichele H, Bibl M, Engelborghs S, Le Bastard N, Lewczuk P, Molinuevo JL et al. Standardization of preanalytical aspects of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: a consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimers Dement 2012;8(1): [7] Alzheimer A, Stelzmann RA, Schnitzlein HN, Murtagh FR. An English translation of Alzheimer s 1907 paper, Uber eine eigenartige Erkrankung der Hirnrinde. Clin Anat. 1995;8: [8] Thies W, Bleiler L Alzheimer s disease facts and figures. Alzheimers Dement. 2013;9(2): [9] McKhann GM, Knopman DS, Chertkow H, Hyman BT, Jack CR et al. The diagnosis of dementia due to Alzheimer s disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer s Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer s disease. Alzheimers Dement 2011;7(3): [10] Albert MS, DeKosky ST, Dickson D, Dubois B et al. The diagnosis of mild cognitive impairment due to Alzheimer s disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer s Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer s disease. Alzheimers Dement 2011;7(3): [11] Sperling RA, Aisen PS, Beckett LA, Bennett DA et al. Toward defining the preclinical stages of Alzheimer s disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer s Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer s disease. Alzheimers Dement 2011;7(3): [12] Hansson O, Zetterberg H, Buchhave P, Andreasson U et al. Prediction of Alzheimer s disease using the CSF Abeta42/Abeta40 ratio in patients with mild cognitive impairment. Dement Geriatr Cogn Disord. 2007;23(5): Version / 7

9 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /