Methoden-Wahl für den BVDV-Nachweis aus Ohrgewebeproben und Konsequenzen für die Praxis
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- Bella Kaiser
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1 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Methoden-Wahl für den BVDV-Nachweis aus Ohrgewebeproben und Konsequenzen für die Praxis Christian, J., Kupča, A., Drdlicek, J., Bogner, K. H. Ohrstanzen-Workshop Stendal 17. Juni 2010
2 Welche Methoden stehen für die Massendiagnostik zur Verfügung? E RNS -ELISA-Tests Schnell-Lyse - RT- PCR Methoden (in unserer Studie: BoVir-SL BVDV TaqMan RT-PCR Kit, Fa. Andiatec) Realtime RT- PCR- Methoden mit Aufreinigung (in unserer Studie als "Goldstandard": modifizierte Methode nach Hoffmann et al., 2006) Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 2
3 Allgemeines ELISA PCR-Methoden Geräte für den Massendurchsatz meist vorhanden für den Massendurchsatz evtl. Neuanschaffung nötig robuste, lang etablierte Methode gilt als kontaminationsanfälliger (v. a. Methoden mit Aufreinigung) Über-Nacht-Inkubation (12-24 Stunden) der Ohrgewebeproben mit Puffer nötig bei normalen Arbeitszeiten nur 4 Ansatz-Tage pro Woche! keine über-nacht-inkubation bei normalen Arbeitszeiten 5 Ansatz- Tage pro Woche! nur Einzelansätze möglich Pooluntersuchungen möglich Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 3
4 Zusammenhang Prävalenz und Poolgröße Für Tiere benötigt man bei einer Prävalenz von 1 % (10 Virämiker auf Tiere): Bei 10er Pool: (10 x 10) = 200 Untersuchungen Bei 25er Pool: 40 + (10 x 25) = 290 Untersuchungen Prävalenz von 0,5 % (5 Virämiker auf Tiere): Bei 10er Pool: (5 x 10) = 150 Untersuchungen Bei 25er Pool: 40 + (5 x 25) = 165 Untersuchungen Prävalenz von 0,4 % (4 Virämiker auf Tiere): Bei 10er Pool: (4 x 10) = 140 Untersuchungen Bei 25er Pool: 40 + (4 x 25) = 140 Untersuchungen Erst ab einer Prävalenz von 0,4 % "lohnt" sich ein 25er Pool! Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 4
5 Nachuntersuchungen ELISA bei Blut diagnostische Lücke beachten! Nachuntersuchung frühestens ab 61. Lebenstag möglich bei Hautbioptaten keine Einschränkung (frühestens 21 Tage nach Erst- Untersuchung) PCR-Methoden keine diagnostische Lücke bei Einzelansatz von Blutproben bei Hautbioptaten keine Einschränkung Nachuntersuchung frühestens 42 Tage nach Erst-Untersuchung PI-Tiere stehen lange im Bestand und scheiden ständig Virus aus als Abhilfe bietet sich hier die Bewertung als PI-Tier anhand der RNA-Kopienzahl an (Schirrmeier, 2010) Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 5
6 Wieviele NPI-Tiere werden detektiert? Untersuchungsmethode Summe der positiv detektierten Tiere detektierte PI-Tiere detektierte NPI-Tiere Anteil NPI-Tiere an positiv detektierten Tieren Lyse + Aufreinigung, PCR ,4 % Datenstand , Tiere vergleichend untersucht Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 6
7 Sensitivste Methode: PCR mit Aufreinigung Nachteil (aus Sicht des abgebenden Betriebes) : viele NPI-Tiere, die bis zur Nachuntersuchung nicht gehandelt werden dürfen Vorteil (aus Sicht des aufnehmenden Betriebes): Risiko der BVDV-Einschleppung wird minimiert weiterer Vorteil: eventuell wird Neueinschleppung eher erkannt Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 7
8 Beispielbetrieb aus unserer Studie positive Tiere im Bestand A, n=99 (davon 21 im "Ohr" positiv) Anzahl positiver Tiere nach Ohrgewebe ohne Nachuntersuchung NPI-Tiere PI-Tiere 0 Sep 08 Nov 08 Jan 09 Mrz 09 Mai 09 Jul 09 Sep 09 Nov 09 Jan 10 Mrz 10 Monat Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 8
9 Wieviele NPI-Tiere werden detektiert? Untersuchungsmethode Summe der positiv detektierten Tiere detektierte PI-Tiere detektierte NPI-Tiere Anteil NPI-Tiere an positiv detektierten Tieren Lyse + Aufreinigung, PCR ,4 % Schnelllyse, PCR ,1 % Datenstand , Tiere vergleichend untersucht Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 9
10 Zweitbeste Sensitivität: Schnell-Lyse RT-PCR relativ niedriger Prozentsatz von NPI-Tieren bisher kein PI-Tier "übersehen" (in unserer Studie: Allflex-Ohrmarken) aber: Vorsicht bei Kombination mit Caisley-Ohrmarken (verminderte Sensitivität) (genaueres hierzu im Vortrag Dr. Bogner) Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 10
11 Wieviele NPI-Tiere werden detektiert? Untersuchungsmethode Summe der positiv detektierten Tiere detektierte PI-Tiere detektierte NPI-Tiere Anteil NPI-Tiere an positiv detektierten Tieren Lyse + Aufreinigung, PCR ,4 % Schnelllyse, PCR ,1 % Datenstand , Tiere vergleichend untersucht Vergleichsdaten aus vorhergehender Studie (LMU, LGL) mit Ohrmarkenpaaren (Hellwig et al. 2009): ELISA ,0 % Aber: ELISA hat 8 PI-Tiere nicht erkannt Sensitivität 97 % Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 11
12 Im ELISA falsch negatives Tier Vergleichsuntersuchung an beiden Ohrgewebestanzen eines Tieres mit PCR (mit Aufreinigung) und E RNS- ELISA: PCR positiv mit Ct-Wert 26,7 ELISA negativ (OD 0,14) Wiederholungsuntersuchung im ELISA: negativ (OD 0,12) Nachuntersuchung (Blut): PCR positiv mit Ct-Wert 35,2 (ELISA positiv! OD 3,4) Antikörper-ELISA stark positiv asserviertes ELISA-Lysat in Antikörper-ELISA: positiv Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 12
13 Im ELISA falsch negatives Tier Amplification Plots Original PCR-Eluat PCR-Probe, neu extrahiert Origin. ELISA-Lysat, aufger. ELISA-Probe, neu extrahiert Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 13
14 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! Unser Dank gilt: Frau Doris Göbel, Frau Monika Lindner, Frau Christine Müller-Boushaba Amt für Landwirtschaft und Forsten Ansbach Bayerisches Staatsministerium für Umwelt und Gesundheit Bayerische Tierseuchenkasse Landeskuratorium der Erzeugerringe für tierische Veredelung in Bayern e. V. Rinderzuchtverband Mittelfranken Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 14
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